Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu teknik, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin gözlem ve analizi için tam tohum büyüklüğünde reçine bölümünün hızlı ve basit hazırlanmasına olanak sağlar.

Özet

Tohumun morfolojisi, büyüklüğü ve miktarı, nişasta granülleri ve tohumdaki protein kütleleri tohumun ağırlığını ve kalitesini belirler. Onlar tohum farklı bölgeler arasında önemli ölçüde farklıdır. Hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin morfolojilerini net bir şekilde görebilmek ve morfoloji parametrelerini nicel olarak doğru analiz edebilmek için tohum büyüklüğünde ki tüm bölüme ihtiyaç vardır. Tohum büyüklüğündeki parafin bölümü tohumlardaki depolama malzemelerinin birikimini araştırabilse de, kalın bölümün düşük çözünürlüğü nedeniyle hücrelerin ve depolama malzemelerinin morfoloji parametrelerini nicel olarak analiz etmek çok zordur. İnce rezorin bölümü yüksek çözünürlüğe sahiptir, ancak rutin rezorin kesit yöntemi büyük hacimli ve yüksek nişasta içeriği ile olgun tohumların tam tohum büyüklüğünde bölümünü hazırlamak için uygun değildir. Bu çalışmada, tohum büyüklüğündeki reişin hazırlanması için basit bir kuru kesit yöntemi sayılmiyoruz. Bu teknik, lr beyaz reçine gömülü, olgun, çimlenmiş ve pişmiş tohumlar, yüksek nişasta içeriği ile büyük tohumlar için bile, çapraz ve uzunlamasına tam tohum ölçekli bölümleri hazırlayabilir. Tüm tohum büyüklüğündeki bölüm floresan parlatıcı 28, iyot ve Coomassie parlak mavi R250 ile özellikle hücrelerin morfolojisi sergilemek için, nişasta granülleri, ve protein organları açıkça, sırasıyla. Elde edilen görüntü, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin morfoloji parametrelerini göstermek için nicel olarak analiz edilebilir.

Giriş

Bitki tohumları nişasta ve protein gibi depolama malzemeleri içerir ve insanlar için enerji ve beslenme sağlar. Hücre ve depolama malzemelerinin şekli, boyutu ve miktarı tohumun ağırlığını ve kalitesini belirler. Tohum farklı bölgelerde hücreleri ve depolama malzemeleri önemli ölçüde farklı morfolojileri var, özellikle nişasta dallanma enzimIIbinhibisyonu ile bazı yüksek amylose tahıl bitkileriiçin,2,3. Bu nedenle, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin ve depolama malzemelerinin morfolojilerinin araştırılması çok önemlidir.

Parafin kesiti tüm tohum büyüklüğündeki bölümü hazırlamak için iyi bir yöntemdir ve tohumun dokuyapısını ve tohum4,5,6farklı bölgelerde depolama malzemesi birikimini sergileyebilir. Ancak, parafin kesitleri genellikle düşük çözünürlükte 6-8 μm kalınlığa sahiptir; bu nedenle hücre ve depolama malzemelerinin morfolojisini net bir şekilde gözlemlemek ve nicel olarak analiz etmek çok zordur. Rezorin kesitleri genellikle 1-2 μm kalınlığında ve yüksek çözünürlüğe sahiptir ve hücre ve depolama malzemelerinin morfolojisini gözlemlemek ve analiz etmek için çok uygundur7. Ancak, rutin rezorin kesit yöntemi, özellikle büyük hacimli ve yüksek nişasta içeriği ne olursa olsun tohumlar için tüm tohum büyüklüğündeki bölümü hazırlamakta güçlük çekmiştir; bu nedenle, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin ve depolama malzemelerinin morfolojisini gözlemlemenin ve analiz etmenin bir yolu yoktur. LR Beyaz reçin bir akrilik reçine ve düşük viskozite ve güçlü geçirgenlik sergiler, tohumların reçine bölümünü n hazırlanmasında iyi uygulamalara yol açan, özellikle büyük hacimli ve yüksek nişasta içeriği ile tahıl olgun çekirdekleri için. Buna ek olarak, LR Beyaz reçine gömülü örnek açıkça ışık veya floresan mikroskop altında hücrelerin ve depolama malzemelerinin morfolojisi sergilemek için birçok kimyasal boyalar ile kolayca lekeli olabilir7. Bir önceki yazımızda, LR White reçine gömülü olgun tahıl çekirdeklerinin tohum büyüklüğündeki bölümlerini hazırlamak için kuru bir kesit yöntemi bildirmiştik. Yöntem aynı zamanda gelişmekte olan, çimlenmiş ve pişmiş tahıl çekirdeği8tam tohum büyüklüğünde bölüm hazırlayabilirsiniz. Elde edilen tam tohum büyüklüğündeki bölüm mikromorfoloji gözlem ve analizinde, özellikle tohum8,9'unfarklı bölgelerindeki hücre ve depolama malzemelerinin morfoloji farklılıklarının net bir şekilde görüntülenmesi ve nicel olarak analiz edilebilmiştir.

Bu teknik, ışığın mikroskobu kullanılarak tohumun farklı bölgelerindeki doku ların mikro yapısını ve hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin şekil ve büyüklüğünü gözlemlemek isteyen araştırmacılar için uygundur. Özellikle hücreler, nişasta granülleri ve protein cisimleri sergilemek için boyanmış tam tohum büyüklüğündeki bölümlerin görüntüleri, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin morfoloji parametrelerini nicel olarak ölçmek için morfoloji analiz yazılımı ile analiz edilebilir. Teknik uygulanabilirliği ve tam tohum büyüklüğündeki kesit uygulamalarını göstermek amacıyla, bu çalışmada mısır ve yağlı tohum tecavüzünün olgun tohumlarını ve gelişen, çimlenmiş ve pişmiş pirinç çekirdeklerini araştırdık. Protokol dört işlem içerir. Burada, büyük hacimli ve yüksek nişasta içeriği nedeniyle tohum büyüklüğündeki bölümlerin hazırlanmasında en zor olan olgun mısır çekirdeğini, süreçleri adım adım sergilemek için örnek olarak kullanıyoruz.

Protokol

1. Rezorin gömülü tohumunun hazırlanması (Şekil 1)

  1. 10 mL'de altı mısır olgun çekirdeğini %2,5 fosfat tamponlu glutaraldehit (0,1 M, pH7,2) 4 °C'de 48 saat boyunca sabitler. Araştırmacılar araştırma amaçlarına ve doku tiplerine göre diğer fiksatif karışımları, fiksatif konsantrasyonları ve fiksasyon koşullarını seçebilirler.
  2. Çekirdekleri çıkarVe keskin bir çift taraflı bıçak kullanarak 2-3 mm kalınlığında uzunlamasına veya transversyel dilimleyin ve 10 mL 2,5% fosfat-tamponlu glutdehit (0.1 M, pH 7.2) tekrar 48 saat için düzeltin.
  3. Numuneleri her seferinde 30 dakika boyunca 0,1 M fosfat tamponu (pH 7,2) ile üç kez yıkayın.
  4. Etanol sulu çözelti (10 mL) artan sınıflarda numuneleri %30'dan %50'ye, %70'ten %90'a ve 30 dakika boyunca üç kez dehydrate.
  5. Etanol ile seyreltilmiş LR White rezorin çözeltisinin 10 mL artırıcı kalitelerinde numunelere sızın ve her seferinde 12 saat boyunca 4 °C'de %75 ve %100 iki kez 12 saat.
  6. Gömmeden önce kaideleri numuneler için hazırlayın. 2 mL santrifüj tüpüne 0,25 mL %100 LR Beyaz reçine ekleyin ve 60 °C'de 48 saat polimerize edin.
  7. Art arda saf LR Beyaz reçine (0,5 mL) ve bir kaide ile santrifüj tüpü içine sızmış örnek ekleyin. Örnekleri anatomik iğne ile düzleştirin ve 60 °C'de bir fırında 48 saat polimerize edin.

2. Tam tohum büyüklüğünde kesit hazırlamak için kuru kesitler (Şekil 1)

  1. Santrifüj tüpünden gömülü çekirdekleri alın ve keskin bir bıçak kullanarak numunenin etrafındaki fazla reçineyi kesin.
  2. Resenin bloğunu ultramikrotom (EM UC7) numune tutucusuna kelepçele ve numunenin yüzeyinde ve numunenin etrafında ki gereksiz rezoriyi bir bıçakla kırpın.
  3. Tam bir bölüm oluşturulana kadar numunenin yüzeyini cam bir bıçakla ince ince parlata.
  4. Kesmeden önce bıçak kenarının yaklaşık 2 mm üzerine küçük bir bakır kanca koyun ve numuneyi 2 μm'lik bir keserek kesin. Kancanın rolü, bölümün yukarı doğru kıvrılmasını önlemektir.
  5. Bölüm uzun olduğunda onu desteklemek için bölümün altına kancayı koyun.
  6. Önceden işlenmemiş bir kaydıra 100°L su ekleyin ve tamamlanmış ve kırılmamış bölümü cımbızla suya dikkatlice aktarın.
  7. Buruşuk bölümü yumuşatmak için numuneyi bir gecede 50 °C'de düzleme masasında ısıtın ve kurutun.
    1. Bölüm parçalanırsa veya yırtılırsa, numunenin her reçine infiltrasyonu için süreyi 12 saatten 24 saat veya 48 saate kadar uzatın.
    2. Bölüm, bıçağa paralel bazı çizgilere sahipse, numune bloğunu sıkıca kenetleyin. Bölümde bıçak için dikey bazı çizgiler varsa, yeni bir bıçak kullanın.

3. Bölümün boyanma ve gözlemi

NOT: Hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin doku yapısını ve morfolojisini gözlemlemek için, araştırmanın amacına göre kesitleri belirli lekelerle lekeler. Burada, hücre duvarlarını, nişasta granüllerini ve protein cisimlerini lekelemek için floresan parlatıcı 28, iyot çözeltisi ve Coomassie parlak mavi R250 kullanıyoruz.

  1. Hücrelerin morfolojisini gözlemlemek için, 40 mL'lik floresan parlatıcı 28 sulu çözeltideki 40 mL'lik floresan parlatıcı 28 sulu çözeltiyi 45 °C'de 10 dakika boyunca akan suyla durulayın ve 5 dakika boyunca akan suyla durulayın. CCD kamera ile donatılmış bir floresan mikroskobu altındaki bölümü gözlemleyin ve fotoğrafladı.
  2. Nişasta granüllerinin morfolojisini gözlemlemek için, 1 dk boyunca %25 (v/v) gliserolde %40 07 (w/v) I2 ve %0,14 (w/v) KI ile kesiti boylayın ve iyot solüsyonu içeren numuneyi coverslip ile kapatın. Örneği CCD kamera ile donatılmış bir ışık mikroskobu altında görüntüleyin ve fotoğrafla.
  3. Protein cisimlerinin morfolojisini gözlemlemek için, 45 °C'de 10 dakika boyunca 70 mL kompakt cam boyama kavanozunda %10 (v/v) asetik asit ile bölümü 40 mL'lik bir asit le batırın ve 40 mL'lik coomassie parlak mavi R250%25 (v/v) izopropanol ve %10 (v/v) asetik asit le 15 dk 45 C5'te boyandın. Lekeli bölümleri 5 dk akan su ile yıkayın ve kurutun. CcD kamera ile donatılmış bir ışık mikroskobu altında bölümü gözlemleyin ve fotoğrafla.

4. Morfoloji parametrelerinin nicel analizi

  1. Zhao ve ark.9 prosedürlerini takip eden morfoloji analiz yazılımı (Image-Pro Plus 6.0 yazılımı) kullanarak, tohumun farklı bölgelerindeki hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin alanı, uzun/kısa ekseni ve yuvarlaklığı için fotoğraflanan görüntüleri işleme ve nicel olarak analiz edin.

Sonuçlar

Tam tohum büyüklüğünde bir kesit elde etmek için basit kuru kesit yöntemi
LR-beyaz rezorna gömülü tohumun tam tohum büyüklüğünde bir bölümünü hazırlamak için basit bir kuru kesit yöntemi oluşturduk (Şekil 1). Bu yöntem transversal ve boylamsal tam tohum büyüklüğünde 2 μm kalınlığında kesitler hazırlayabilir(Şekil 2-5, EkŞekil 1-4). Örneğin, yağlı tohum te...

Tartışmalar

Tohumlar gıda, yem ve endüstriyel hammadde için en önemli yenilenebilir kaynak, ve nişasta ve protein gibi depolama malzemeleri açısından zengindir. Hücrelerin morfolojisi ve miktarı ile depolama malzemelerinin içeriği ve konfigürasyonu tohumların ağırlığını ve kalitesini etkiler7,12. Stereoloji ve görüntü analizi teknolojisi bir doku bölgesindeki hücrelerin boyutunu ve miktarını ölçebilse de, pek çok laboratuvarda eksiktir. Parafin ...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Finansman Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32071927), Yangzhou Üniversitesi Yetenek Projesi ve Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirme tarafından sağlanmıştır.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931
Compact glass staining jar (5-Place)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E678013
Coomassie brilliant blue R-250Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A100472
CoverslipSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.F518211
Double-sided bladeGillette Shanghai Co., Ltd.74-S
Ethanol absoluteSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A500737
Flattening tableLeicaHI1220
Fluorescence microscopeOlympusBX60
Fluorescent brightener 28Sigma-Aldrich910090
Glass stripsLeica840031
Glutaraldehyde 50% solution in waterSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600875
GlycerolSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600232
IodineSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A500538
IsopropanolSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A507048
Light microscopeOlympusBX53
LR White resinAgar ScientificAGR1281A
OvenShanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd.9023A
Potassium iodideSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A100512
SlideSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.F518101
TweezersSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.F519022
Sodium phosphate dibasic dodecahydrateSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A607793
Sodium phosphate monobasic dihydrateSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A502805
UltramicrotomeLeicaEM UC7

Referanslar

  1. Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
  2. He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
  3. Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
  4. Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
  5. Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099 (2013).
  6. Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
  7. Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8 (2020).
  8. Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
  9. Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
  10. Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
  11. Lott, J. N. A. Protein bodies in seeds. Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).
  12. Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 167tam tohum b y kl nde kesitkuru kesit y ntemimorfolojih creni asta gran lprotein v cut

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır