שיטת מקטע יבש פשוטה לקבלת מקטע שרב בגודל זרע שלם ויישומיו

Summary

טכניקה זו מאפשרת הכנה מהירה ופשוטה של סעיף שרין בגודל זרע כולו לתצפית וניתוח של תאים, גרגרי ענבן, וגופים חלבון באזורים שונים של הזרע.

Abstract

מורפולוגיה, גודל וכמות של תאים, גרגרי ענבן וגופים חלבון בזרע לקבוע את המשקל ואיכות הזרע. הם שונים באופן משמעותי בין אזורים שונים של זרעים. על מנת להציג את המורפולוגיות של תאים, גרגרי איתילן וגופים חלבון בבירור, וכמותית לנתח את הפרמטרים המורפולוגיה שלהם במדויק, המקטע בגודל כל הזרעים נדרש. למרות כל הזרע בגודל פרפין סעיף יכול לחקור את ההצטברות של חומרי אחסון בזרעים, קשה מאוד לנתח כמותית את הפרמטרים מורפולוגיה של תאים וחומרי אחסון בשל הרזולוציה הנמוכה של הסעיף העבה. סעיף שרף דק יש ברזולוציה גבוהה, אבל שיטת מקטע שרף שגרתי אינו מתאים להכין את החלק בגודל הזרע כולו של זרעים בוגרים עם נפח גדול ותוכן עעמלן גבוה. במחקר זה, אנו מציגים שיטת מקטע יבש פשוטה להכנת סעיף שבין בגודל זרע כולו. הטכניקה יכולה להכין את הצלב ואת האורך בגודל זרעים של פיתוח, בוגר, נבט, וזרעים מבושלים מוטבע שרף לבן LR, אפילו עבור זרעים גדולים עם תוכן עעמלן גבוה. החלק בגודל זרע כולו יכול להיות מוכתם עם מבהיר פלורסנט 28, יוד, ו Coomassie כחול מבריק R250 כדי להציג באופן ספציפי את המורפולוגיה של תאים, גרגרי עילן, וגופים חלבון בבירור, בהתאמה. ניתן לנתח את התמונה שהושגה גם באופן כמותי כדי להראות את הפרמטרים המורפולוגיה של תאים, גרגרי איתילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע.

Introduction

זרעי צמחים מכילים חומרי אחסון כגון עילן וחלבון ומספקים אנרגיה ותזונה לאנשים. הצורה, הגודל והכמות של תא וחומרי אחסון קובעים את המשקל והאיכות של הזרע. התאים וחומרי האחסון באזורים שונים של זרעים יש מורפולוגיות שונות באופן משמעותי, במיוחד עבור כמה גידולי דגנים עמילוס גבוה עם עיכוב של עמילן הסתעפות אנזים IIb^1,2,3. לכן, חשוב מאוד לחקור את המורחולוגיות של תאים וחומרי אחסון באזורים שונים של זרעים.

פרפין קטע היא שיטה טובה כדי להכין את כל הזרע בגודל סעיף יכול להציג את מבנה הרקמה של הזרע ואת הצטברות של חומר אחסון באזורים שונים של זרע^4,5,6. עם זאת, סעיפים פרפין בדרך כלל יש 6-8 μm עובי עם רזולוציה נמוכה; לכן, קשה מאוד להתבונן בבירור ולנתח באופן כמותי את המורפולוגיה של תא וחומרי אחסון. מקטעים שרין בדרך כלל יש 1-2 μm עובי ברזולוציה גבוהה והם מתאימים מאוד להתבונן ולנתח את המורפולוגיה של תא וחומרי^{אחסון 7}. עם זאת, שיטת ניתוח שרין שגרתית מתקשה להכין את המקטע בגודל זרע כולו, במיוחד עבור זרעים עם נפח גדול ותוכן איתן גבוה; לפיכך, אין דרך להתבונן ולנתח את המורפולוגיה של תאים וחומרי אחסון באזורים שונים של הזרע. שרף לבן LR הוא שרף אקרילי ומציג צמיגות נמוכה וחחללות חזקה, המוביל יישומים טובים שלה בהכנת סעיף שרף של זרעים, במיוחד עבור גרעינים בוגרים דגנים עם נפח גדול ותוכן איתילן גבוה. בנוסף, המדגם מוטבע LR לבן שסוף ניתן להכתים בקלות עם צבעים כימיים רבים כדי להציג בבירור את המורפולוגיה של תאים וחומרי אחסון תחת אור או מיקרוסקופ^{פלורסנט 7}. בעיתון הקודם שלנו, דיווחנו על שיטת מקטע יבש להכנת חלקים בגודל זרע של גרעיני דגנים בוגרים מוטבע שרף לבן LR. השיטה יכולה גם להכין את החלק בגודל זרע של פיתוח, נביטה ומבושלת גרעין דגנים⁸. הסעיף שהתקבל בגודל זרע כולו יש יישומים רבים תצפית מיקרומורפולוגיה וניתוח, במיוחד עבור צפייה ברורה וניתוח כמותי של הבדלי מורפולוגיה של תא וחומרי אחסון באזורים שונים של^{זרע 8,9}.

טכניקה זו מתאימה לחוקרים שרוצים לבחון את מבנה המיקרו של רקמות ואת הצורה והגודל של תאים, גרגרי איתילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע באמצעות מיקרוסקופ אור. ניתן לנתח את התמונות של חלקים בגודל זרעים שלמים המוכתמים במיוחד עבור תאים מוצגים, גרגרי איתילן וגופים חלבון על ידי תוכנת ניתוח מורפולוגיה כדי למדוד באופן כמותי את הפרמטרים המורפולוגיה של תאים, גרגרי איתילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע. על מנת להדגים את הישימות הטכנית ויישומי סעיף בגודל זרעים שלמים, חקרנו את הזרעים הבוגרים של תירס ואונס זרעי שמן ואת הגרעינים המתפתחים, נבט, ומבושל של אורז במחקר זה. הפרוטוקול מכיל ארבעה תהליכים. כאן, אנו משתמשים בליבת תירס בוגרת, שהיא הקשה ביותר בהכנת המקטעים בגודל כל הזרע בשל נפח גדול ותוכן מעילן גבוה, כדגימה כדי להציג את התהליכים צעד אחר צעד.

Protocol

1. הכנת זרע מוטבע שרף (איור 1)

1. לתקן שישה גרעינים תירס בוגר ב 10 מ"ל של 2.5% גלוטרלדה פוספט אגירה (0.1 M, pH7.2) ב 4 ° C עבור 48 שעות. החוקרים יכולים לבחור תערובות קיבעון אחרות, ריכוזים קיבעון, ותנאי קיבעון על פי מטרות המחקר שלהם וסוגי רקמות.
2. להוציא את הגרעינים ולחתוך אותם לאורך או transversally ל 2-3 מ"מ עובי באמצעות להב חד דו צדדי, ולתקן אותם ב 10 מ"ל של 2.5% גלוטרלדה פוספט אגירהייד (0.1 M, pH 7.2) שוב במשך 48 שעות.
3. לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם 10 מ"ל של 0.1 M פוספט מאגר (pH 7.2) במשך 30 דקות בכל פעם.
4. מייבשים את הדגימות בהגדלת הציונים של תמיסת אתנול (10 מ"ל) מ-30% ל-50%, 70%, 90% פעם אחת ו-100% שלוש פעמים במשך 30 דקות בכל פעם.
5. לחדור את הדגימות ב 10 מ"ל הגדלת ציונים של פתרון LR לבן שרפים מדולל עם אתנול מ 25% כדי 50%, 75% פעם אחת, ו 100% פעמיים ב 4 ° C עבור 12 שעות בכל פעם.
6. הכינו את הדומיות לדגימות לפני ההטיה. להוסיף 0.25 מ"ל של 100% LR לבן שף לתוך צינור צנטריפוגה 2 מ"ל, ופולימר אותו ב 60 ° C עבור 48 שעות.
7. ברציפות להוסיף שרף לבן LR טהור (0.5 מ"ל) ואת הדגימה הסתננה לתוך צינור צנטריפוגה עם ה-Pedestal. מיישרים את הדגימות עם המחט האנטומית, וממירים אותן ב-60 מעלות צלזיוס בתנור למשך 48 שעות.

2. מקטע יבש להכנת חלק בגודל זרע שלם (איור 1)

1. להוציא את הגרעינים מוטבעים מצינור הצנטריפוגה ולחתוך את שרף עודף סביב המדגם באמצעות להב חד.
2. מהדק את בלוק הברסין במחזיק המדגם של אולטרה מיקרוטומי (EM UC7), ולקצץ את את השנין המיותר על פני השטח של המדגם וסביב הדגימה עם להב.
3. ללטש את פני השטח של המדגם דק עם סכין זכוכית עד שניתן יהיה לגבש קטע שלם.
4. לשים וו נחושת קטן על 2 מ"מ מעל קצה הלהב לפני חיתוך ולחתוך את הדגימה לתוך סעיף 2 μm. התפקיד של הוו הוא למנוע את התלתל כלפי מעלה של המקטע.
5. שים את הוו מתחת למקטע כדי לתמוך בו כאשר המקטע הופך ארוך.
6. מוסיפים 100 μL של מים על מגלשה לא מטופלת, ומעבירים בזהירות את החלק המלא והבלתי שבור למים עם הפינצטה.
7. על מנת להחליק את החלק המקומט, מחממים ויבשים את הדגימה על שולחן השיטח ב-50 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   1. אם המקטע מתפורר או דמעות, להאריך את הזמן עבור כל חדירה של שריון של המדגם מ 12 שעות כדי 24 שעות או 48 שעות.
   2. אם בחלק יש כמה קווים מקבילים לסכין, מהדק את בלוק הדגימה בחוזקה. אם בחלק יש כמה קווים אנכיים לסכין, אנא השתמש בסכין חדשה.

3. הכתמה והתבוננות בסעיף

הערה: על מנת לבחון את מבנה הרקמות ומורפולוגיה של תאים, גרגרי עילן, וגופים חלבון, להכתים את החלקים עם כתמים ספציפיים על פי מטרת המחקר. כאן, אנו משתמשים במבהיר פלורסנט 28, תמיסת יוד, ו- R250 כחול מבריק Coomassie כדי להכתים את קירות התא, גרגרי עילן, וגופים חלבון, בהתאמה.

1. להתבוננות מורפולוגיה של תאים, להכתים את המקטע עם 40 מ"ל של 0.1% (w / v) מבהיר פלורסנט 28 פתרון מים בצנצנת כתמים זכוכית קומפקטית 70 מ"ל ב 45 ° C במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותו עם מים זורמים במשך 5 דקות. צפה וצלם את החלק תחת מיקרוסקופ פלואורסציטי מצויד במצלמת CCD.
2. להתבוננות מורפולוגיה של גרגרי עען, להכתים את המקטע עם 40 μL של תמיסת יוד (0.07% (w /v) I₂ ו 0.14% (w / v) KI ב 25% (v /v) גליקרול עבור 1 דקות, ולכסות את המדגם המכיל פתרון יוד עם כיסוי. הצג וצלם את הדגימה תחת מיקרוסקופ אור המצויד במצלמת CCD.
3. להתבוננות מורפולוגיה של גופים חלבון, לטבול את המקטע עם 40 מ"ל של 10% (v /v) חומצה אצטית בצנצנת ויטראז' קומפקטית 70 מ"ל במשך 10 דקות ב 45 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להכתים אותו ב 40 מ"ל של 1% (w / v) Coomassie כחול מבריק R250 ב 25% (v / v) isopropanol ו 10% (v / v) חומצה אצטית במשך 15 דקות ב 45 ° C. שוטפים את החלקים המוכתמים במים זורמים במשך 5 דקות, וייבאשו. צפה וצלם את החלק תחת מיקרוסקופ אור מצויד במצלמת CCD.

4. ניתוח כמותי של פרמטרים מורפולוגיים

1. תהליך וכמותי לנתח את התמונות המצולם עבור אזור, ציר ארוך / קצר, מעוגל של תאים, גרגרי מעילן, וגופים חלבון באזורים שונים של זרע באמצעות תוכנת ניתוח מורפולוגיה (Image-Pro פלוס 6.0 תוכנה) בעקבות ההליכים של Zhao et^al.

תוצאות

שיטת מקטע יבש פשוטה להשגת מקטע בגודל זרע שלם
אנו מקימים שיטת מקטע יבש פשוט להכנת קטע בגודל זרע שלם של זרע מוטבע LR-לבן שף(איור 1). השיטה יכולה להכין מקטעים טרנסוורסאליים ואורך בגודל זרע שלם בעובי של 2 μm(איור 2-5, דמות משלימה 1-4...

Discussion

הזרעים הם המשאב המתחדש החשוב ביותר למזון, מספוא וחומר גלם תעשייתי, והם עשירים בחומרי אחסון כגון תעילן וחלבון. המורפולוגיה והכמות של תאים והתוכן והתצורה של חומרי אחסון משפיעים על המשקל והאיכות של^{זרעים 7,12}. למרות טכנולוגיית סטריאוטיפ וניתוח תמונה יכול למדוד ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A501931
Compact glass staining jar (5-Place)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	E678013
Coomassie brilliant blue R-250	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A100472
Coverslip	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F518211
Double-sided blade	Gillette Shanghai Co., Ltd.	74-S
Ethanol absolute	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A500737
Flattening table	Leica	HI1220
Fluorescence microscope	Olympus	BX60
Fluorescent brightener 28	Sigma-Aldrich	910090
Glass strips	Leica	840031
Glutaraldehyde 50% solution in water	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600875
Glycerol	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600232
Iodine	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A500538
Isopropanol	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A507048
Light microscope	Olympus	BX53
LR White resin	Agar Scientific	AGR1281A
Oven	Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd.	9023A
Potassium iodide	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A100512
Slide	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F518101
Tweezers	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F519022
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A607793
Sodium phosphate monobasic dihydrate	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A502805
Ultramicrotome	Leica	EM UC7