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요약

이 기술은 종자의 다른 지구에 있는 세포, 전분 과립 및 단백질 바디의 관측 그리고 분석을 위한 전체 종자 크기의 수지 단면도의 빠르고 간단한 준비를 허용합니다.

초록

종자에 있는 세포의 형태, 크기 및 양, 전분 과립 및 단백질 바디는 종자의 무게 그리고 질을 결정합니다. 그들은 씨앗의 다른 영역 중 크게 다릅니다. 세포, 전분 과립 및 단백질 신체의 형태를 명확하게 보고 형태 매개 변수를 정확하게 정량적으로 분석하기 위해서는 전체 종자 크기의 섹션이 필요합니다. 전체 종자 크기의 파라핀 섹션은 종자에서 저장 재료의 축적을 조사 할 수 있지만, 두꺼운 섹션의 낮은 해상도로 인해 세포 및 저장 재료의 형태 매개 변수를 정량적으로 분석하기가 매우 어렵습니다. 얇은 수지 섹션은 고해상도를 가지고 있지만, 일상적인 수지 단면 방법은 큰 부피 및 높은 전분 함량으로 성숙한 씨앗의 전체 종자 크기의 섹션을 준비하는 데 적합하지 않습니다. 이 연구에서는 종자 크기의 수지 섹션을 준비하기위한 간단한 건조 단면 방법을 제시합니다. 이 기술은 LR White 수지에 내장된 개발, 성숙, 발아 및 조리된 씨앗의 교차 및 세로 전체 종자 크기의 섹션을 준비할 수 있으며, 심지어 높은 전분 함량이 높은 큰 씨앗에도 사용할 수 있습니다. 전체 종자 크기의 섹션은 형광 브라이트너(28, 요오드 및 쿠마시)로 염색할 수 있으며, 특히 세포, 전분 과립 및 단백질 체의 형태를 명확하게 나타낼 수 있다. 얻어진 이미지는 또한 종자의 상이한 지역에서 세포, 전분 과립 및 단백질 체의 형태 파라미터를 보여주기 위해 정량적으로 분석될 수 있다.

서문

식물 씨앗은 전분과 단백질과 같은 저장 물질을 포함하고 사람들에게 에너지와 영양을 제공합니다. 셀 및 저장 재료의 모양, 크기 및 양은 종자의 무게와 품질을 결정합니다. 종자의 다른 영역에서 세포 및 저장 물질은 전분 분지 효소 IIb1의억제와 일부 높은 아밀로오스 시리얼 작물에 대한 크게 다른 형태를 가지고1,2,3. 따라서, 종자의 다른 영역에서 세포 및 저장 물질의 형태를 조사하는 것이 매우 중요하다.

파라핀 단면은 종자 크기의 전체 섹션을 제조하는 좋은 방법이며 종자4,5,6의다른 영역에서 종자의 조직 구조 및 저장 물질의축적을나타낼 수 있다. 그러나 파라핀 섹션은 일반적으로 낮은 해상도로 6-8 μm 두께를 가지며; 따라서, 세포 및 저장 물질의 형태를 명확하게 관찰하고 정량적으로 분석하는 것은 매우 어렵다. 수지 섹션은 일반적으로 1-2 μm 두께와 고해상도를 가지며 세포 및 저장 재료7의형태를 관찰하고 분석하는 데 매우 적합합니다. 그러나, 일상적인 수지 단면 방법은 전체 종자 크기의 섹션을 준비하는 데 어려움이 있다, 특히 큰 볼륨과 높은 전분 함량을 가진 씨앗; 따라서, 종자의 상이한 영역에서 세포 및 저장 물질의 형태를 관찰하고 분석할 수 있는 방법은 없다. LR 화이트 수지는 아크릴 수지이며 낮은 점도와 강한 투과성을 나타내며, 특히 대량및 높은 전분 함량의 시리얼 성숙한 커널을 위해 씨앗의 수지 섹션을 준비하는 데 좋은 응용 프로그램으로 이어집니다. 또한, LR 백색 수지에 내장된 시료는 많은 화학염료로 쉽게 염색되어 빛 또는 형광 현미경7하에서 세포 및 저장 물질의 형태를 명확하게 나타낼 수 있다. 이전 논문에서, 우리는 LR 화이트 수지에 내장 된 성숙한 시리얼 커널의 전체 종자 크기의 섹션을 준비하기위한 건조 단면 방법을보고했습니다. 이 방법은 또한 개발, 발아 및 조리 된 시리얼 커널 8의 전체 종자 크기의 섹션을 준비 할 수있습니다. 획득된 전종자 크기의 섹션은 특히 종자8,9의다른 영역에서 세포 및 저장 물질의 형태 차이를 명확하게 보고 정량적으로 분석하기 위해 미세 형태학 관찰 및 분석에서 많은 응용 을 가지고 있다.

이 기술은 빛의 현미경을 사용하여 종자의 다른 지구에 있는 조직의 미세 구조 및 세포의 모양 그리고 크기, 전분 과립 및 단백질 바디를 관찰하고 싶은 연구원을 위해 적당합니다. 세포, 전분 과립 및 단백질 바디를 전시하기 위해 특별히 염색된 전체 종자 크기의 섹션의 이미지는 형태 분석 소프트웨어에 의해 분석되어 종자의 다른 영역에서 세포, 전분 과립 및 단백질 체의 형태 학적 매개 변수를 정량적으로 측정할 수 있습니다. 기술적 적용가능성과 종자 크기의 섹션 응용 을 입증하기 위해, 우리는 옥수수와 오일 시드 강간의 성숙한 씨앗과 이 연구에서 쌀의 개발, 발아 및 조리 된 커널을 조사했습니다. 프로토콜에는 네 개의 프로세스가 포함되어 있습니다. 여기서는 대형 부피와 높은 전분 함량으로 인해 전체 종자 크기의 섹션을 준비하는 데 가장 어려운 성숙한 옥수수 커널을 단계별로 공정을 전시하는 샘플로 사용합니다.

프로토콜

1. 수지 임베디드 씨앗의 준비 (그림 1)

  1. 48h4°C에서 2.5%의 인산염 완충 글루타랄데히드(0.1M, pH7.2)의 10mL에서 6개의 옥수수 성숙한 커널을 수정한다. 연구원은 다른 고정 혼합물을 선택할 수 있습니다., 고정 농도, 그리고 그들의 연구 목표 및 조직 유형에 따라 고정 조건.
  2. 커널을 꺼내 날카로운 양면 블레이드를 사용하여 2-3mm 두께로 세로 또는 반경적으로 슬라이스하고 48h에 대해 다시 2.5 % 인산염 버퍼링 글루타랄데히드 (0.1 M, pH 7.2)의 10 mL로 고정하십시오.
  3. 매번 30분 동안 0.1M 인산염 버퍼(pH 7.2)의 10mL로 시료를 3회 세척한다.
  4. 에탄올 수성 용액(10mL)의 등급이 30%에서 50%, 70%, 90%, 1회, 매번 30분 동안 100% 3회 씩 샘플을 탈수합니다.
  5. 10mL에 샘플을 침투하여 에탄올로 희석된 LR 화이트 수지 용액의 등급을 25%에서 50%, 75%, 1회 100% 4°C에서 100% 2회 12시간 동안 침투한다.
  6. 포함하기 전에 샘플을 위해 받침대를 준비합니다. 2mL 원심분리기 튜브에 100% LR 화이트 수지의 0.25 mL을 추가하고 48h에 대해 60°C로 중합합니다.
  7. 순LR 화이트 수지(0.5mL)와 침투된 샘플을 받침대가 있는 원심분리기 튜브에 연속적으로 추가합니다. 해부학 바늘로 샘플을 곧게 펴고 48 h의 오븐에서 60 °C로 중합하십시오.

2. 전체 종자 크기의 섹션을 준비하기위한 건식 단면(그림 1)

  1. 원심분리기 튜브에서 임베디드 커널을 꺼내 날카로운 블레이드를 사용하여 샘플 주위의 과잉 수지를 잘라냅니다.
  2. 초미세토메(EM UC7)의 샘플 홀더에서 수지 블록을 고정하고, 샘플 표면과 블레이드로 시료 주변의 불필요한 수지에서 트림한다.
  3. 완전한 단면이 형성될 때까지 유리 칼로 시료표면을 미세하게 연마한다.
  4. 절단하기 전에 블레이드 가장자리 위에 약 2mm 작은 구리 후크를 넣고 샘플을 2 μm 섹션으로 자른다. 후크의 역할은 섹션의 위쪽으로 컬링을 피하는 것입니다.
  5. 섹션이 길어질 때 이를 지원하기 위해 후크를 섹션 아래에 놓습니다.
  6. 처리되지 않은 슬라이드에 100μL의 물을 추가하고 완전하고 부서지지 않은 부분을 핀셋으로 물로 조심스럽게 옮겼습니다.
  7. 주름진 부분을 부드럽게 하기 위해 밤새 50°C의 평탄식 테이블의 샘플을 가열하고 건조시합니다.
    1. 단면이 무너지거나 찢어지는 경우, 샘플의 각 수지 침투에 대한 시간을 12h에서 24h 또는 48h로 연장한다.
    2. 단면에 칼과 평행한 선이 있는 경우 샘플 블록을 단단히 고정합니다. 단면에 칼에 수직으로 된 선이 있는 경우, 새 칼을 사용해 주세요.

3. 섹션의 염색 및 관찰

참고: 세포, 전분 과립 및 단백질 신체의 조직 구조 및 형태를 관찰하기 위해 연구의 목적에 따라 특정 얼룩으로 섹션을 얼룩지게합니다. 여기서, 우리는 형광 브라이트너(28), 요오드 용액, 쿠마시 브릴리언트 블루 R250을 사용하여 세포벽, 전분 과립 및 단백질 바디를 각각 염색합니다.

  1. 세포의 형태를 관찰하기 위해, 40mL의 0.1% (w/v) 형광 브라이트너 28 수성 용액으로 45°C에서 45°C에서 염색한 다음, 5분 동안 흐르는 물로 헹구는 다. CCD 카메라가 장착된 형광 현미경으로 섹션을 관찰하고 촬영합니다.
  2. 전분 과립의 형태를 관찰하기 위해, 요오드 용액 40 μL (0.07 % (w /v) I2 및 0.14 % (w / v) KI를 1 분 동안 염색하고, 커버 슬립으로 요오드 용액을 포함하는 샘플을 커버한다. CCD 카메라가 장착된 가벼운 현미경으로 샘플을 보고 촬영합니다.
  3. 단백질 바디의 형태를 관찰하기 위해, 40mL의 10% (v/v) 아세트산으로 40mL의 아세트산을 70mL 컴팩트 유리 스테인딩 용기에 넣고 45°C에서 10분 동안 염색한 다음, 40mL에서 1%(w/v) 쿠마시 브릴리언트 블루 R250을 25%(v/v) 이프로포탄올과 10%(v/v)로 10%(v/v)로 담급니다. 스테인드 섹션을 흐르는 물로 5분 동안 씻고 말리십시오. CCD 카메라가 장착된 가벼운 현미경으로 섹션을 관찰하고 촬영합니다.

4. 형태 매개 변수의 정량적 분석

  1. Zhao 외9의 절차에 따라 형태 분석 소프트웨어(Image-Pro Plus 6.0 소프트웨어)를 사용하여 종자의 다양한 영역에서 영역, 긴/짧은 축 및 세포의 원도, 전분 과립 및 단백질 체에 대한 촬영된 이미지를 정확하게 분석하고 정량적으로 분석한다.

결과

전체 종자 크기의 섹션을 얻기위한 간단한 건조 단면 방법
LR-화이트 수지(도1)에내장된 종자의 전체 종자 크기의 부분을 준비하기 위한 간단한 건식 단면 방법을 수립합니다. 이 방법은 2 μm의 두께를 가진 횡단 및 세로 전종 종자 크기의 섹션을 준비할 수있습니다(도 2-5,보충도 1-4). 예를 들어, 오일시?...

토론

씨앗은 식품, 사료 및 산업 원료에 가장 중요한 재생 가능한 자원이며 전분 및 단백질과 같은 저장 재료가 풍부합니다. 세포의 형태와 수량 및 저장 재료의 함량 및 구성은 종자7,12의무게와 품질에 영향을 미친다. 입체 및 이미지 분석 기술은 조직 지구에 있는 세포의 규모 그리고 양을 측정할 수 있더라도, 많은 실험실에서 부족합니다. 파라핀 과 수지 ?...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

기금은 중국 국립 자연과학 재단(32071927), 양주대학교 인재프로젝트, 장쑤고등교육기관의 우선학술프로그램 개발등을 통해 지원되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931
Compact glass staining jar (5-Place)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E678013
Coomassie brilliant blue R-250Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A100472
CoverslipSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.F518211
Double-sided bladeGillette Shanghai Co., Ltd.74-S
Ethanol absoluteSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A500737
Flattening tableLeicaHI1220
Fluorescence microscopeOlympusBX60
Fluorescent brightener 28Sigma-Aldrich910090
Glass stripsLeica840031
Glutaraldehyde 50% solution in waterSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600875
GlycerolSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600232
IodineSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A500538
IsopropanolSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A507048
Light microscopeOlympusBX53
LR White resinAgar ScientificAGR1281A
OvenShanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd.9023A
Potassium iodideSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A100512
SlideSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.F518101
TweezersSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.F519022
Sodium phosphate dibasic dodecahydrateSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A607793
Sodium phosphate monobasic dihydrateSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A502805
UltramicrotomeLeicaEM UC7

참고문헌

  1. Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
  2. He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
  3. Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
  4. Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
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  9. Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
  10. Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
  11. Lott, J. N. A. Protein bodies in seeds. Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).
  12. Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).

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