与嗅觉恩希廷格利亚合体培养的 Axotom 化大鼠视网膜甘利翁神经元，作为成人轴再生体外模型

摘要

我们提出了一个体外模型，以评估神经损伤后嗅觉包裹胶质（OEG）神经再生能力。它基于OEG单层的轴突成人视网膜结节神经元（RGN）的共生和随后的轴再生研究，通过分析RGN轴突和声乐内皮标记。

摘要

嗅觉包裹胶质 （OEG） 细胞从嗅觉粘膜一直定位到嗅球的嗅觉神经层 （ONL）。在整个成年生活中，它们是新产生的嗅觉神经元的轴突生长的关键，从拉米纳预言家到ONL。由于其亲再生特性，这些细胞已被用于促进脊髓或视神经损伤模型的轴突再生。

我们提出了一个体外模型，以检测和测量神经损伤后OEG神经再生能力。在这个模型中，可逆不朽的人类OEG（ihOEG）被培养为单层，视网膜从成年大鼠中提取，视网膜结石神经元（RGN）被共同培养到OEG单层。96小时后，通过免疫荧光分析RGN中的轴突和索马托内皮标记，并量化带轴突的RN数量和平均轴突长度/神经元。

此协议比依赖胚胎或产后神经元的其他体外检测具有优势，它评估成人组织中的OEG神经再生特性。此外，它不仅可用于评估 ihOEG 的神经再生潜力，而且可以扩展到 OEG 或其他胶质细胞的不同来源。

引言

成人中枢神经系统（CNS）神经元在受伤或患病后再生能力有限。促进CNS再生的一个共同策略是移植，在损伤部位，诱导轴突生长的细胞类型，如干细胞，施万细胞，星形细胞或嗅觉包裹胶质（OEG）细胞^{1，2，3，4，5。}

OEG源自神经峰^6，位于嗅觉粘膜和嗅球中。在成人中，嗅觉神经元由于环境暴露而定期死亡，并被新分化的神经元所取代。OEG包围和引导这些新的嗅觉轴突进入嗅球，并建立新的突触，他们的目标在CNS^7。由于这些生理属性，OEG已被用于CNS损伤的模型，如脊髓或视神经损伤，其神经再生和神经保护特性被证实为^{8，9，10，11。}几个因素已被确定为负责这些细胞的亲再生特征，包括细胞外基质蛋白酶生产或分泌神经营养和轴突生长因子12，13，14。

鉴于扩大原OEG细胞的技术局限性，我们以前建立并定性了可逆不朽的人类OEG（ihOEG）克隆系，它提供了无限的均匀OEG供应。这些 ihOEG 细胞源自原始培养物，这些培养物来自验尸中获得的嗅觉球茎。它们通过端粒酶催化亚单（TERT）和上基因Bmi-1的转导而永生，并与SV40病毒大T抗原^{15、16、17、18}一起改良。其中两个ihOEG细胞系是Ts14，它保持了原始培养物和Ts12的再生能力，Ts12是一种低再生线，^{在这些实验中}用作低再生控制。

为了评估OEG在神经损伤后促进轴突再生的能力，已经实施了几个体外模型。在这些模型中，OEG应用于不同神经元起源和中性形成和拉长的培养物——对胶质文化的反应——被检测。这些神经元来源的例子有新生儿大鼠皮质神经元^19，从皮质组织对大鼠胚胎神经元进行划伤^20，大鼠视网膜外泄^21，大鼠下丘脑或海马产后神经元22，23 ，产后大鼠鼻脊髓根结节神经元²⁴个，产后小鼠皮质脊髓神经元²⁵个，人类NT2神经元²⁶个，或产后脑皮质神经元对反应性星形细胞疤痕样培养²⁷个。

然而，在这些模型中，再生检测依赖于胚胎或产后神经元，这些神经元具有受伤的成人神经元所缺乏的内在可塑性。为了克服这个缺点， 我们提出了一个成人轴突再生模型在OEG线的培养与成人视网膜结节神经元（RN），基于一个最初由威格利等人28，29，30，31和修改和使用我们组12，13，14，15，16，17，18，32，33。简言之，视网膜组织从成年大鼠中提取，用木瓜消化。视网膜细胞悬浮液随后被镀在多晶硅处理的盖片上或 Ts14 和 Ts12 单层上。培养物在修复前保持96小时，然后进行轴突（MAP1B和NF-H蛋白^）34和体血体（MAP2A和^B）35标记的免疫荧光。轴突再生被量化为轴突神经元的百分比，关于RGN的总数，轴再生指数被计算为每个神经元的平均轴突长度。此协议不仅可用于评估 ihOEG 的神经再生潜力，而且可以扩展到 OEG 或其他胶质细胞的不同来源。

研究方案

注:动物实验已获国家和机构生物伦理委员会批准。

1. ihOEG （Ts12 和 Ts14） 文化

注:此程序是在组织培养生物安全柜的无菌条件下完成的。

1. 准备 表 1中提供的 50 mL ME10 OEG 文化介质。
2. 准备5毫升的DMEM/F12-FBS，如 表1所示，在15毫升圆锥管。
3. 在37°C的清洁水浴中加热两种介质15分钟。
4. 在干净的水浴中，在37°C下解冻 Ts12 和 Ts14 细胞小瓶。
5. 在第 2 步准备的 DMEM/F12-FBS 培养介质中重新悬浮并添加细胞。
6. 离心机5分钟，200 x g。
7. 渴望超人。
8. 添加 500 μL 的 ME10 介质并重新悬念颗粒。
9. 准备一个 p60 细胞培养盘与 3 mL 的 ME10 和添加蜂窝悬架， 向下。
10. 移动以将细胞均匀地分布在板上。
11. 培养细胞在37°C在5%_二氧化碳。
    注:到达汇合后，至少必须再做一段，以优化培养的细胞。90% 的汇合是需要之前播种他们的封面上为 co 文化。汇合p-60的平均细胞数为7×10 5，Ts14为2.5×10 6，Ts12细胞系为2.5×10 ^6。 Ts12 和 Ts14 细胞线应每 2-3 天通过一次。

2. 为检测准备 ihoeg （Ts12 和 Ts14）

注:此步骤必须在 RGN 解剖和培养前 24 小时完成。

1. 用 10 微克/mL 多 L-赖氨酸 （PLL） 治疗 12 mm é 盖片 1 小时。
   注:封口可以在PLL解决方案中过夜。
2. 用 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗盖片，三次。
3. 将 Ts12 和 Ts14 ihoEG 细胞从 p60 细胞培养皿中分离。
   1. 将 4 mL 的 DMEM/F12-FBS 培养介质 （表 1） 添加到 15 mL 圆锥管中。在37°C的清洁水浴中加热。
   2. 从盘子中取出介质，用 1 mL 的 1x PBS-EDTA 清洗电池一次。
   3. 在OEG细胞中加入1毫升的尝试-EDTA，在37°C、5%CO₂下孵育3-5分钟。
   4. 用 p1000 移液器收集细胞，并将它们转移到第 3.1 步准备的介质中。
   5. 离心机5分钟，200 x g。
   6. 渴望超人。
   7. 添加 1 mL 的 ME10 介质并重新悬念颗粒。
   8. 在血细胞计中数细胞数。
4. 种子 80，000 Ts14 细胞或 100，000 Ts12 细胞/井到盖片在 24 井板在 500 μL 的 ME10 介质.
5. 培养细胞在37°C在5%_二氧化碳，为24小时。

3. 视网膜组织解剖

注:2个月大的雄性威斯塔鼠被用作RGN来源。两个视网膜（一只老鼠），用于24口井细胞盘的20口井。使用前高压外科材料。帕潘分离套件是商业购买的（材料表）。按照提供商的重组说明操作。在 5 mM 库存中重组 D、L-2-氨基-5-磷新星酸 （APV），并准备阿利库特。

1. 在检测当天，准备以下媒体。
   1. 准备一个 p60 细胞培养菜与 5 ml 的冷 Ebss （小瓶 1 的木瓜分离套件） 。
   2. 准备一个 p60 细胞培养菜与重组小瓶 2 （帕帕因） 的木瓜分离套件加上 50μL 的 APV. 然后，添加 250 μL 的重建小瓶 3（DNase 加 5μL 的 APV）。
   3. 在无菌管混合 2.7 mL 小瓶 1 与 300 μL 小瓶 4 （白蛋白-卵巢蛋白酶抑制剂）.添加 150μL 的瓶 3 （DNase） 和 30μL 的 APV。
   4. 准备20 mL的神经底-B27介质（NB-B27），如 表1所示。
2. 用_二氧化碳窒息来牺牲老鼠。
3. 用断头台斩首来取下头部;把它放在一个100毫米的培养皿中，在将乙醇喷入层压流罩之前，先用70%的乙醇喷头。
4. 用剪刀切老鼠的胡须，这样它们就不会干扰眼睛的操纵。
5. 用钳子抓住视神经，拔出眼球，足以用手术刀在眼睛上切口。
6. 取出镜片和活泼的幽默，拉出视网膜（橙色般的组织），而眼睛的其余层留在里面（包括色素上皮层）。
7. 将网膜放入第 3.1.1 步准备的 p60 细胞培养盘中。
8. 将网膜转移到第 3.1.2 步准备的 p60 细胞培养盘，然后用手术刀将其切成大约大小和 1 mm 的小块。
9. 转移到15 mL塑料管。
10. 将组织孵育30分钟，在37°C的加湿孵化器中，在5%的_CO2下，每10分钟搅拌一次。
11. 用玻璃巴斯德移液器上下吹笛，分离细胞团块。
12. 在200 x g 下将电池悬架离心5分钟。
13. 丢弃超纳坦并灭活木瓜，在步骤 3.1.3 中准备的溶液中重新悬浮细胞颗粒。（2只眼睛1.5 mL）。
14. 小心地将此单元悬架吹入 5 mL 的重组小瓶 4 中。
15. 离心机在200 x g 5分钟。
16. 在离心时，从OEG 24油井电池板中完全去除ME-10介质（先前在第2步中准备），并替换为每口井500μL的NB-B27介质。
17. 丢弃超纳坦，在NB-B27介质的2mL中重新悬浮细胞。
18. 板 100 μL 的视网膜细胞悬架，每孔的 m24 板，到 PLL 处理或 OEG 单层盖片上。
19. 在 NB-B27 介质中将培养物保持在 37 °C，96 小时保持 5% CO 2。

4. 免疫污染

1. 96小时后，通过在培养介质（600 μL）（PFA最终浓度2%）中加入1倍PBS中4%的准甲醛（PFA）来修复细胞10分钟。
2. 从 24 多井板中取出介质和 PFA，并在 1x PBS 中再次添加 500 μL 的 4% 甲醛 （PFA）。孵化10分钟。
3. 丢弃固定器，用 1x PBS 清洗 3 次 5 分钟。
4. 在PBS（PBS-TS）中以0.1%的Triton X-100/1%FBS块30-40分钟。
5. 准备PBS-TS缓冲区的主要抗体如下:SMI31（针对MAP1B和NF-H蛋白）单克隆抗体（1:500）。514 （识别 MAP2A 和 B 蛋白） 兔子多克隆反塞 （1:400）。
6. 将原发抗体添加到培养物中，并在4°C下过夜孵育。
7. 第二天，丢弃抗体，用1x PBS清洗盖片，3次，5分钟。
8. 准备PBS-TS缓冲区中的次要抗体如下:对于SMI-31，抗鼠标亚历克萨氟488（1:500）。对于 514，反兔子亚历克萨-594 （1:500）。
9. 在RT，在黑暗中用相应的荧光二次抗体孵育细胞1小时。
10. 在黑暗中用 1x PBS 清洗盖片 3 次，5 分钟。
11. 最后，安装带安装介质（材料表）的盖片，并保持在4°C。
    注:如有必要，可执行带有 DAPI 的荧光核染色（4，6-迪米迪诺-2-苯酚）。安装前，用 DAPI（1x PBS 中的 10 微克/mL）在黑暗中孵育细胞 10 分钟。用 1x PBS 清洗盖片 3 次，最后用安装介质安装盖片。

5. 轴再生量化

注:样品在表观荧光显微镜的40倍目标下进行量化。每次治疗至少应在随机字段上拍摄 30 张照片，其中至少需要 200 个神经元。每个实验至少应重复三次。

1. 量化轴突（SMI31阳性中性）神经元相对于RGN总种群的百分比（与MAP2A/B 514神经元身体和树突的阳性免疫保持一起确定）。
2. 量化轴再生指数或平均轴长（μm/神经元）。此参数定义为所有已识别轴突的长度（以 μm）之和，除以计数神经元的总数，无论它们是否呈现轴突。轴长度是使用图像软件 ImageJ （NIH-USA） 的插件神经元J 确定的。
3. 使用适当的软件计算平均值、标准偏差和统计意义。

结果

在此协议中，我们提出了一个体外模型，以检测神经元损伤后的OEG神经再生能力。如图1所示，OEG源是一个可逆的不朽的人类OEG克隆细胞系-Ts14和Ts12-，它源自原始文化，从验尸^15，17，18获得的嗅球。视网膜组织从成年大鼠身上提取，消化后，视网膜结节神经元（RGN）悬浮物镀在PLL处理的盖片上或iHOEG单层?...

讨论

OEG移植在CNS损伤部位被认为是一个有希望的治疗CNS损伤，因为它构成亲神经再生属性^7，8，9。然而，根据组织来源-嗅觉粘膜（OM-OEG）与嗅球（OB-OEG）-或捐赠者的年龄，这种能力存在相当大的差异26，31，33，36。因此，在开始体内?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
antibody 514	Reference 34		Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.
antibody SMI-31	BioLegend	801601	Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody	ThermoFisher	A-21202
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody	ThermoFisher	A-21207
B-27 Supplement	Gibco	17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid	Sigma	283967	NMDA receptor inhibitor
DAPI	Sigma	D9542	Nuclei fluorescent stain
DMEM-F12	Gibco	11320033	Cell culture medium
FBS	Gibco	11573397	Fetal bovine serum
FBS-Hyclone	Fisher Scientific	16291082	Fetal bovine serum
Fluoromount	Southern Biotech	0100-01	Mounting medium
ImageJ	National Institutes of Health (NIH-USA)		Image software
L-Glutamine	Lonza	BE17-605F
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	Neuronal cells culture medium
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	For use in neural cell isolation
PBS	Home made
PBS-EDTA	Lonza	H3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B	Lonza	17-745E	Bacteriostatic and bactericidal
Pituitary extract	Gibco	13028014	Bovine pituitary extract
Poly -L- lysine (PLL)	Sigma	A-003-M