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Resumen

Presentamos un modelo in vitro para evaluar la capacidad neurorregenerativa olfativa ensheathing glia (OEG), después de una lesión neuronal. Se basa en un cocultivo de neuronas ganglionas de retina adultas axotomizadas (RGN) en monocapas OEG y posterior estudio de regeneración axonal, mediante el análisis de marcadores axoales y somatodendriáticos RGN.

Resumen

Las células olfativas ensheathing glia (OEG) se localizan desde la mucosa olfativa hasta la capa nerviosa olfativa (ONL) de la bombilla olfativa. A lo largo de la vida adulta, son clave para el cultivo axonal de neuronas olfativas recién generadas, desde la lamina propria hasta la ONL. Debido a sus propiedades pro-regenerativas, estas células se han utilizado para fomentar la regeneración axonal en modelos de lesión de la médula espinal o del nervio óptico.

Presentamos un modelo in vitro para adormecer y medir la capacidad neurorregenerativa de OEG después de una lesión neuronal. En este modelo, el OEG humano increíblemente inmortalizado (ihOEG) se cultiva como una monocapa, las retinas se extraen de ratas adultas y las neuronas ganglionas retinianas (RGN) se coculan en la monocapa OEG. Después de las 96 h, los marcadores axonal y somatodendritico en RGNs son analizados por inmunofluorescencia y se cuantifica el número de RGNs con axón y la longitud/neurona axonal media.

Este protocolo tiene la ventaja sobre otros ensayos in vitro que se basan en neuronas embrionarias o postnatal, que evalúa las propiedades neurorregenerativas OEG en el tejido adulto. Además, no sólo es útil para evaluar el potencial neurorregenerativo de ihOEG, pero se puede extender a diferentes fuentes de OEG u otras células gliales.

Introducción

Las neuronas del sistema nervioso central adulto (SNC) tienen una capacidad regenerativa limitada después de una lesión o enfermedad. Una estrategia común para promover la regeneración del SNC es el trasplante, en el sitio de lesiones, de tipos celulares que inducen el crecimiento axonal como células madre, células Schwann, astrocitos o células olfativas de glia (OEG)1,2,3,4,5.

OEG deriva de la cresta neural6 y se encuentra en la mucosa olfativa y en la bombilla olfativa. En el adulto, las neuronas sensoriales olfativas mueren regularmente como resultado de la exposición ambiental y son reemplazadas por neuronas recientemente diferenciadas. OEG rodea y guía estos nuevos axones olfativos para entrar en la bombilla olfativa y establecer nuevas sinapsis con sus objetivos en el CNS7. Debido a estos atributos fisiológicos, OEG se ha utilizado en modelos de lesión del SNC como lesión de la médula espinal o del nervio óptico y sus propiedades neurorregenerativas y neuroprotectoras se convierten en probadas8,9,10,11. Varios factores han sido identificados como responsables de las características pro-regenerativas de estas células, incluyendo la producción de proteasas de matriz extracelular o la secreción de factores de crecimiento neurotróficos y axoales12,13,14.

Dadas las limitaciones técnicas para ampliar las células OEG primarias, previamente establecimos y caracterizamos líneas clonales OEG humanas inmortalizadas reversibles (ihOEG), que proporcionan un suministro ilimitado de OEG homogéneo. Estas células ihOEG derivan de cultivos primarios, preparados a partir de bombillas olfativas obtenidas en autopsias. Fueron inmortalizados por la transducción de la subunidad catalítica de telomerasa (TERT) y el oncogeno Bmi-1 y modificados con el antígeno T grande del virus SV4015,16,17,18. Dos de estas líneas celulares ihOEG son Ts14, que mantiene la capacidad regenerativa de las culturas originales y Ts12, una línea regenerativa baja que se utiliza como un control de baja regeneración en estos experimentos18.

Para evaluar la capacidad de OEG para fomentar la regeneración axonal después de una lesión neuronal, se han implementado varios modelos in vitro. En estos modelos, la OEG se aplica a cultivos de diferente origen neuronal y se afirma la formación y elongación de neuritas, en respuesta a la cocultura glial. Ejemplos de tales fuentes neuronales son las neuronas corticales de rata neonatal19,heridas de arañazos realizadas en neuronas embrionarias de rata del tejido cortical20,explantas retinianas de rata21,neuronas posnatales hipotalales o hipocampales de rata22,23, post Rata dorsal raíz dorsal neuronas24,corticospoinal ratón postnatal neuronas del tracto corticospinal25,neuronas NT2 humanas26,o neuronas corticales cerebrales postnatal en cultivos reactivos similares a cicatrices de astrocitos27.

En estos modelos, sin embargo, el ensayo de regeneración se basa en neuronas embrionarias o postnatales, que tienen una plasticidad intrínsefica que está ausente en las neuronas adultas lesionadas. Para superar este inconveniente, presentamos un modelo de regeneración axonal adulta en coculturas de líneas OEG con neuronas ganglionas retinales adultas (RGNs), basada en la desarrollada originalmente por Wigley et al.28,29,30,31 y modificada y utilizada por nuestro grupo12,13,14,15,16,17,18,32,33. Brevemente, el tejido retiniano se extrae de ratas adultas y se digiere con papaína. A continuación, la suspensión de células retinianas se coloca en los cubrecochetas tratados con poli lisina o en las monocapas Ts14 y Ts12. Los cultivos se mantienen durante 96 h antes de que se arreglen y luego se realiza inmunofluorescencia para las proteínas axonal (MAP1B y NF-H)34 y somatodendritica (MAP2A y B)35 marcadores. La regeneración axonal se cuantifica como un porcentaje de neuronas con axón, con respecto a la población total de RGNs y el índice de regeneración axonal se calcula como la longitud axonal media por neurona. Este protocolo no sólo es útil para evaluar el potencial neurorregenerativo de ihOEG, sino que se puede extender a diferentes fuentes de OEG u otras células gliales.

Protocolo

NOTA: La experimentación con animales fue aprobada por comités nacionales e institucionales de bioética.

1. ihOEG (Ts12 y Ts14) cultura

NOTA: Este procedimiento se realiza en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad de cultivo de tejidos.

  1. Preparar 50 mL ME10 Medio de cultivo OEG según lo dispuesto en el Cuadro 1.
  2. Preparar 5 ml de DMEM/F12-FBS, según lo dispuesto en el Cuadro 1,en un tubo cónico de 15 ml.
  3. Caliente ambos medios a 37 °C en un baño de agua limpia, durante 15 minutos.
  4. Descongelar viales de células Ts12 y Ts14 a 37 °C en un baño de agua limpia.
  5. Resuspend y agregue células al medio de cultivo DMEM/F12-FBS preparado en el paso 2.
  6. Centrífuga durante 5 min a 200 x g.
  7. Aspira al sobrenadante.
  8. Añadir 500 μL de ME10 medio y resuspend el pellet.
  9. Prepare un plato de cultivo celular p60 con 3 ml de ME10 y agregue la suspensión celular, en sentido dropwise.
  10. Muévase para distribuir las celdas uniformemente a través de la placa.
  11. Células de cultivo a 37 °C en 5% CO2.
    NOTA: Después de alcanzar la confluencia, se debe hacer al menos otro pasaje para optimizar las células para la cocultura. Se necesita un 90% de confluencia antes de sembrarlas en las portadas de la cocultura. Un p-60 confluente tiene un número de celda medio de 7 x 105 para Ts14 y 2,5 x 106 para las líneas de celda Ts12. Las líneas celulares Ts12 y Ts14 deben pasarse cada 2-3 días.

2. Preparación de ihOEG (Ts12 y Ts14) para el ensayo

NOTA: Este paso debe hacerse 24 h antes de la disección y cocultura de RGN.

  1. Tratar 12 mm Ø coverslips con 10 μg / mL poli-L-lisina (PLL) para 1 h.
    NOTA: Los cubrebotas se pueden dejar durante la noche en la solución PLL.
  2. Lave las tapas con solución salina de tampón de fosfato (PBS) 1x, tres veces.
  3. Retire las células Ts12 y Ts14 ihOEG del plato de cultivo celular p60.
    1. Añadir 4 ml de medio de cultivo DMEM/F12-FBS(Tabla 1)a un tubo cónico de 15 ml. Caliente a 37 °C en un baño de agua limpia.
    2. Retire el medio de las placas y las células de lavado con 1 ml de 1x PBS-EDTA, una vez.
    3. Añadir 1 ml de trypsin-EDTA a las células OEG e incubar durante 3-5 min a 37 °C, 5% CO2.
    4. Recoger celdas con una pipeta p1000 y transferirlas a medio preparado en el paso 3.1.
    5. Centrífuga durante 5 min a 200 x g.
    6. Aspira al sobrenadante.
    7. Añadir 1 ml de me10 medio y resuspend el pellet.
    8. Cuente el número de celda en un hemociclo.
  4. Semillas 80.000 células Ts14 o 100.000 células Ts12/pozo en las cubiertas en placas de 24 pozos en 500 μL de medio ME10.
  5. Células de cultivo a 37 °C en 5% CO2,para 24 h.

3. Disección del tejido retiniano

NOTA: Las ratas Wistar macho de 2 meses de edad se utilizan como fuente RGN. Dos retinas (una rata) para 20 pozos de un plato de 24 bien celulares. Autoclave material quirúrgico antes de su uso. Papain kit de disociación se compra comercialmente (Tabla de Materiales). Siga las instrucciones del proveedor para la reconstitución. Reconstituir D,L-2-amino-5-ácido fosfonovalerico (APV) en stock de 5 mM y preparar las alícuotas.

  1. El día del ensayo, prepare los siguientes medios.
    1. Prepare un plato de cultivo celular p60 con 5 ml de EBSS frío (vial 1 del kit de disociación de papaína).
    2. Prepare un plato de cultivo celular p60 con el vial reconstituido 2 (papaína) del kit de disociación de papaína más 50 μL de APV.  A continuación, añadir 250 μL de vial 3 (DNase más 5 μL de APV).
    3. En una mezcla de tubo estéril 2,7 ml del vial 1 con 300 μL del vial 4 (inhibidor de la proteasa albúmina-ovomucoide). Añadir 150 μL del vial 3 (DNase) más 30 μL de APV.
    4. Preparar 20 ml de medio Neurobasal-B27 (NB-B27) según lo dispuesto en el Cuadro 1.
  2. Sacrificar una rata por asfixia con CO2.
  3. Retire la cabeza por decapitación con guillotina; colocarlo en una placa Petri de 100 mm y rociar la cabeza con etanol al 70% antes de colocarla en una campana de flujo laminar.
  4. Corta los bigotes de la rata con tijeras para que no interfieran con la manipulación ocular.
  5. Sujete el nervio óptico con fórceps para extraer el globo ocular lo suficiente como para poder hacer una incisión a través del ojo con un bisturí.
  6. Retire la lente y el humor vítreo y extraiga la retina (tejido anaranjado), mientras que las capas restantes del ojo permanecen dentro (incluida la capa epitelial pigmentaria).
  7. Coloque la retina en el plato de cultivo celular p60 preparado en el paso 3.1.1.
  8. Transfiera la retina al plato de cultivo celular p60 preparado en el paso 3.1.2 y córtalo con el bisturí en trozos pequeños de un tamaño aproximado < 1 mm.
  9. Transferir a un tubo de plástico de 15 ml.
  10. Incubar el tejido durante 30 min, en una incubadora humidificada a 37 °C bajo 5% CO2,con agitación cada 10 min.
  11. Disociar los grupos celulares pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta pasteur de vidrio.
  12. Centrífuga la suspensión celular a 200 x g durante 5 minutos.
  13. Deseche el sobrenadante e inactive la papaína, resuspend el pellet celular en la solución preparada en el paso 3.1.3. (1,5 ml para 2 ojos).
  14. Entuba cuidadosamente esta suspensión celular en 5 ml de vial reconstituido 4.
  15. Centrífuga a 200 x g durante 5 min.
  16. Mientras centrifuga, retire completamente el medio ME-10 de la placa de células de pozo OEG 24 (previamente preparado en el paso 2) y reemplácelo por 500 μL de medio NB-B27 por pozo.
  17. Deseche el sobrenadante y resuspend las células en 2 ml de medio NB-B27.
  18. Placa 100 μL de suspensión de células retinianas, por pozo de la placa m24, sobre monocapas-coverslips PLL o OEG.
  19. Mantenga los cultivos a 37 °C con un 5% de CO2 para 96 h en el medio NB-B27.

4. Inmunodetención

  1. Después de 96 h, fije las células durante 10 minutos añadiendo el mismo volumen de 4% paraformaldehído (PFA) en 1x PBS al medio de cultivo (600 μL) (concentración final de PFA 2%).
  2. Retire el soporte y el PFA de la placa de 24 multipopos y agregue una vez más 500 μL de paraformaldehído (PFA) del 4% en 1x PBS. Incubar durante 10 minutos.
  3. Deseche el fijador y lave 3 veces con 1x PBS durante 5 minutos.
  4. Bloquee con 0.1% Tritón X-100/1% FBS en PBS (PBS-TS) durante 30-40 min.
  5. Prepare los anticuerpos primarios en el búfer PBS-TS de la siguiente manera: SMI31 (contra proteínas MAP1B y NF-H) anticuerpo monoclonal (1:500). 514 (reconoce las proteínas MAP2A y B) antísero policlonal del conejo (1:400).
  6. Agregue anticuerpos primarios a las coculturas e incuba durante la noche a 4 °C.
  7. Al día siguiente, deseche los anticuerpos y lave las tapas con 1x PBS, 3 veces, durante 5 min.
  8. Prepare los anticuerpos secundarios en el búfer PBS-TS de la siguiente manera: Para SMI-31, Alexa Fluor 488 anti-ratón (1:500). Para 514, alexa-594 anti-conejo (1:500).
  9. Incubar células con los anticuerpos secundarios fluorescentes correspondientes durante 1 h, en RT, en la oscuridad.
  10. Lave las tapas con 1x PBS, 3 veces, durante 5 minutos, en la oscuridad.
  11. Por último, monte las cubiertas con medio de montaje(Tabla de materiales)y manténgalas a 4 °C.
    NOTA: Siempre que sea necesario, se pueden realizar manchas de núcleos fluorescentes con DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole). Antes de montar, incubar las células durante 10 minutos en la oscuridad con DAPI (10 μg/mL en 1x PBS). Lave las cubiertas 3 veces con 1x PBS y, finalmente, monte las tapas con el medio de montaje.

5. Cuantificación de la regeneración axonal

NOTA: Las muestras se cuantifican bajo el objetivo 40x de un microscopio de epifluorescencia. Un mínimo de 30 imágenes deben tomarse en campos aleatorios, con al menos 200 neuronas, que se cuantificarán para cada tratamiento. Cada experimento debe repetirse un mínimo de tres veces.

  1. Cuantificar el porcentaje de neuronas con axón (neurite positivo SMI31) en relación con la población total de RGNs (identificado con MAP2A/B 514 inmunodetención positiva del cuerpo neuronal y dendritas).
  2. Cuantificar el índice de regeneración axonal o la longitud axonal media (μm/neurona). Este parámetro se define como la suma de las longitudes (en μm) de todos los axones identificados, divididos por el número total de neuronas contadas, presenten o no un axón. La longitud axonal se determina utilizando el plugin NeuronJ del software de imagen ImageJ (NIH-USA).
  3. Calcule la media, la desviación estándar y la significación estadística utilizando el software adecuado.

Resultados

En este protocolo, presentamos un modelo in vitro para augur la capacidad neurorregenerativa OEG después de una lesión neuronal. Como se muestra en la Figura 1,la fuente OEG es una línea celular clonal OEG humana inmortalizada reversible -Ts14 y Ts12-, que deriva de cultivos primarios, preparados a partir de bombillas olfativas obtenidas en autopsias15,17,18. El tejido retiniano se extrae de rata...

Discusión

El trasplante de OEG en los sitios de lesiones del SNC se considera una terapia prometedora para la lesión del SNC debido a sus propiedades pro-neurorregenerativas constitutivas7,8,9. Sin embargo, dependiendo de la fuente de tejido —mucosa olfativa (OM-OEG) frente a bulbo olfativo (OB-OEG)— o la edad del donante, existe una variación considerable en dicha capacidad26,31,...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo financiero del proyecto SAF2017-82736-C2-1-R del Ministerio de Ciencia e Innovación a MTM-F y de la Fundación Universidad Francisco de Vitoria a JS.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
antibody 514Reference 34Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.
antibody SMI-31BioLegend801601Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibodyThermoFisherA-21202
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibodyThermoFisherA-21207
B-27 SupplementGibco17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acidSigma283967NMDA receptor inhibitor
DAPISigmaD9542Nuclei fluorescent stain
DMEM-F12Gibco11320033Cell culture medium
FBSGibco11573397Fetal bovine serum
FBS-HycloneFisher Scientific16291082Fetal bovine serum
FluoromountSouthern Biotech0100-01Mounting medium
ImageJNational Institutes of Health (NIH-USA)Image software
L-GlutamineLonzaBE17-605F
Neurobasal MediumGibco21103049Neuronal cells culture medium
Papain Dissociation SystemWorthington Biochemical CorporationLK003150For use in neural cell isolation
PBSHome made
PBS-EDTALonzaH3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin BLonza17-745EBacteriostatic and bactericidal
Pituitary extractGibco13028014Bovine pituitary extract
Poly -L- lysine (PLL)SigmaA-003-M

Referencias

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