JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים מודל במבחנה כדי להעריך חוש הריח ensheathing גליה (OEG) יכולת נוירו-רגנרטיבית, לאחר פגיעה עצבית. הוא מבוסס על קוקולטורה של נוירונים גנגליון רשתית למבוגרים אקסוטומיים (RGN) על מונוליירים OEG ומחקר עוקב של התחדשות אקסון, על ידי ניתוח סמנים אקסונליים וסמטודנדריטיים RGN.

Abstract

תאי גליה מעוגנים חוש הריח (OEG) מותאמים כל הדרך מן רירית הריח אל ולתוך שכבת עצב הריח (ONL) של נורת הריח. לאורך כל החיים הבוגרים, הם המפתח לגידול אקסונלי של נוירונים חוש הריח החדש שנוצר, מן הפרופריה למינה ל ONL. בשל תכונותיהם הפרו-רגנרטיביות, תאים אלה שימשו לטיפוח התחדשות אקסונית בחוט השדרה או במודלים של פגיעה בעצב הראייה.

אנו מציגים מודל במבחנה כדי לבצע בדיקה ולמדוד את היכולת הנוירו-רה-רגנרטיבית של OEG לאחר פגיעה עצבית. במודל זה, OEG אנושי מונצח באופן הפיך (ihOEG) הוא מתורבת כמונולאייר, רשתית מופקים חולדות מבוגרים נוירונים גנגליון רשתית (RGN) הם cocultured על מונולאיר OEG. לאחר 96 שעות, סמנים אקסונליים וסמוטונדריטיים ב- RGNs מנותחים על ידי כשל חיסוני ומספר ה- RGNs עם אקסון והאורך/נוירון האקסונלי הממוצע מכומתים.

לפרוטוקול זה יש יתרון על פני מבחני הפריה חוץ גופיים אחרים המסתמכים על נוירונים עובריים או לאחר לידה, כי הוא מעריך תכונות נוירו-רגנרטיביות OEG ברקמה הבוגרת. כמו כן, זה לא רק שימושי להערכת הפוטנציאל neuroregenerative של ihOEG אבל ניתן להרחיב למקורות שונים של OEG או תאים גליה אחרים.

Introduction

נוירונים במערכת העצבים המרכזית למבוגרים (CNS) יש יכולת רגנרטיבית מוגבלת לאחר פציעה או מחלה. אסטרטגיה נפוצה לקידום התחדשות מערכת העצבים המרכזית היא השתלה, באתר הפציעה, של סוגי תאים שגורמים לצמיחה אקסונאלית כגון תאי גזע, תאי שוואן, אסטרוציטים או חוש הריח ensheathing גליה (OEG) תאים1,2,3,4,5.

OEG נובעת מהציצה העצבית6 ומאתרת ברירית הריח ובנורת הריח. אצל המבוגרים, נוירונים חושיים חושיים חושיים מתים באופן קבוע כתוצאה מחשיפה סביבתית והם מוחלפים על ידי נוירונים שהובחנו לאחרונה. OEG מקיפה ומנחה את האקסונים חוש הריח החדשים האלה להיכנס לנורת הריח ולהקים סינפסות חדשות עם המטרות שלהם במערכת העצבים המרכזית7. בשל תכונות פיזיולוגיות אלה, OEG שימש במודלים של פגיעה במערכת העצבים המרכזית כגון פגיעה בחוט השדרה או בעצב הראייה ותכונותיו הנוירו-רגנרטיביות והנוירו-פרוטקטיביות מוכחות8,9,10,11. מספר גורמים זוהו כאחראים למאפיינים הפרו-רגנרטיביים של תאים אלה, כולל ייצור פרוטאזות מטריצה חוץ-תאית או הפרשת גורמי גדילה נוירוטרופיים וקסוניים12,13,14.

בהתחשב במגבלות הטכניות להרחבת תאי OEG ראשוניים, הקמנו בעבר ואפיינו קווי שיבוט אנושיים מונצחים הפיכים (ihOEG), המספקים אספקה בלתי מוגבלת של OEG הומוגני. תאים אלה ihOEG נובעים תרבויות ראשוניות, מוכן נורות חוש הריח שהושגו נתיחה שלאחר המוות. הם הונצחו על ידי התמרה של subunit קטליטית טלומראז (TERT) ואת oncogene Bmi-1 ושונו עם וירוס SV40 גדול T אנטיגן15,16,17,18. שניים מקווי תא ihOEG אלה הם Ts14, אשר שומר על יכולת ההתחדשות של התרבויות המקוריות ו Ts12, קו רגנרטיבי נמוך המשמש בקרת התחדשות נמוכה בניסויים אלה18.

כדי להעריך את יכולת OEG לטפח התחדשות אקסונלית לאחר פגיעה עצבית, מספר מודלים במבחנה יושמו. במודלים אלה, OEG מוחל על תרבויות ממוצא עצבי שונה היווצרות neurite והתארכות – בתגובה coculture גליה – הם assayed. דוגמאות של מקורות עצביים כאלה הם נוירונים קליפת המוח חולדה יילודים19, פצעי שריטה שבוצעו על נוירונים עובריים חולדה מרקמת קליפת המוח20, חולדה רשתית explants21, חולדה היפותלמית או היפוקמפוס לאחר הלידה נוירונים22,23, נוירונים גנגליון שורש עכברוש לאחר הלידה24, נוירונים קורטיקוספינל עכבר לאחר הלידה25, נוירונים אנושיים NT226, או נוירונים קליפת המוח לאחר הלידה על תרבויות אסטרוציטים תגובתי דמוי צלקת27.

במודלים אלה, לעומת זאת, מבחני ההתחדשות מסתמכים על נוירונים עובריים או לאחר לידה, שיש להם פלסטיות מהותית הנעדרת בנוירונים בוגרים פצועים. כדי להתגבר על החיסרון הזה, אנו מציגים מודל של התחדשות אקסונלית למבוגרים ב cocultures של קווי OEG עם נוירונים גנגליון רשתית למבוגרים (RGNs), המבוסס על אחד שפותח במקור על ידי Wigley et al.28,29,30,31 ושונה בשימוש על ידי הקבוצה שלנו12,13,14,15,16,17,18,32,33. בקצרה, רקמת הרשתית מופקת מעכברושים בוגרים ומתעכלת עם פפאין. השעיית תאי רשתית מצופה לאחר מכן על כיסויים שטופלו בפוליסין או על Ts14 ו Ts12 monolayers. תרבויות נשמרות במשך 96 שעות לפני שהם קבועים ולאחר מכן immunofluorescence עבור אקסונל (MAP1B ו NF-H חלבונים)34 ו somatodendritic (MAP2A ו- B)35 סמנים מבוצע. התחדשות אקסונלית מכומתת כאחוז של נוירונים עם אקסון, ביחס לאוכלוסייה הכוללת של RGNs ומדד התחדשות אקסונלי מחושב כאורך אקסונלי ממוצע לכל נוירון. פרוטוקול זה אינו שימושי רק להערכת הפוטנציאל הנוירו-רגנרטיבי של ihOEG, אלא ניתן להרחיבו למקורות שונים של OEG או תאי גליה אחרים.

Protocol

הערה: ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדות ביואתיקה לאומיות ומוסדיות.

1. תרבות ihOEG (Ts12 ו- Ts14)

הערה: הליך זה נעשה בתנאים סטריליים בארון biosafety תרבית רקמות.

  1. הכן 50 מ"ל ME10 OEG תרבות בינונית כפי שסופק בטבלה 1.
  2. הכן 5 מ"ל של DMEM / F12-FBS, כפי שסופק בטבלה 1, בצינור חרוט 15 מ"ל.
  3. מחממים את שתי המדיה ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים נקיים, במשך 15 דקות.
  4. להפשיר Ts12 ו Ts14 בקבוקונים תאים ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים נקיים.
  5. התחדש והוסף תאים למדיום התרבות DMEM/F12-FBS שהוכן בשלב 2.
  6. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 x גרם.
  7. שאפו את הסופרנט.
  8. הוסף 500 μL של ME10 בינוני ו resuspend גלולה.
  9. הכן צלחת תרבות תא p60 עם 3 מ"ל של ME10 ולהוסיף את ההשעיה הסלולר, dropwise.
  10. העבר כדי לפזר את התאים באופן אחיד על פני הצלחת.
  11. תאי תרבות ב 37 °C (69 °F) ב 5% CO2.
    הערה: לאחר הגעה להתכנסות, יש לעשות לפחות מעבר נוסף כדי למטב תאים עבור coculture. 90% מפגש יש צורך לפני זריעת אותם על כריכות עבור coculture. p-60 confluent יש מספר תא ממוצע של 7 x 105 עבור Ts14 ו 2.5 x 106 עבור קווי תא Ts12. יש להעביר קווי תאים Ts12 ו- Ts14 כל 2-3 ימים.

2. הכנת ihOEG (Ts12 ו- Ts14) לבדיקה

הערה: שלב זה חייב להיעשות 24 שעות לפני ניתוח RGN ושיתוף פעולה.

  1. יש לטפל בכיסויי Ø 12 מ"מ עם 10 מיקרוגרם/מ"ל פולי-ל-לידין (PLL) למשך שעה.
    הערה: ניתן להשאיר את הכיסויים למשך הלילה בפתרון PLL.
  2. לשטוף את הכיסויים עם 1x פוספט מלח חיץ (PBS), שלוש פעמים.
  3. נתק תאי Ts12 ו- Ts14 ihOEG מתבשיל תרבות התא p60.
    1. הוסף 4 מ"ל של מדיום תרבות DMEM/F12-FBS(טבלה 1)לצינור חרוט של 15 מ"ל. חם ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים נקיים.
    2. הסר את המדיום מצלחות ולשטוף תאים עם 1 מ"ל של 1x PBS-EDTA, פעם אחת.
    3. הוסף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA לתאי OEG והדגירה במשך 3-5 דקות ב 37 °C (69 °F), 5% CO2.
    4. לאסוף תאים עם p1000 פיפטה ולהעביר אותם בינוני מוכן בשלב 3.1.
    5. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 x גרם.
    6. שאפו את הסופרנט.
    7. הוסף 1 מ"ל של ME10 בינוני ו resuspend גלולה.
    8. ספור את מספר התא במד המוציטים.
  4. זרע 80,000 תאי Ts14 או 100,000 תאי Ts12 / גם על הכותרות בלוחות 24-באר ב 500 μL של ME10 בינוני.
  5. תאי תרבות ב 37 °C (69 °F) ב 5% CO2, עבור 24 שעות.

3. ניתוח רקמת רשתית

הערה: חולדות Wistar זכר בן חודשיים משמשים כמקור RGN. שתי רשתיות (חולדה אחת) עבור 20 בארות של צלחת תא 24-באר. מובלעת אוטומטית של חומר כירורגי לפני השימוש. ערכת ניתוק פפאין נרכשת באופן מסחרי(שולחן החומרים). בצע את הוראות הספק לצורך השבה. לשקם D,L-2-אמינו-5-phosphonovaleric חומצה (APV) במלאי 5 מ"מ ולהכין את aliquots.

  1. ביום ההסמכה, הכינו את המדיה הבאה.
    1. הכן צלחת תרבות תא p60 עם 5 מ"ל של EBSS קר (בקבוקון 1 של ערכת דיסוציאציה פפאין).
    2. הכן צלחת תרבות התא p60 עם בקבוקון מחדש 2 (פפאין) של ערכת דיסוציאציה פפאין בתוספת 50 μL של APV.  לאחר מכן, להוסיף 250 μL של בקבוקון 3 (DNase בתוספת 5 μL של APV).
    3. בצינור סטרילי לערבב 2.7 מ"ל של בקבוקון 1 עם 300 μL של בקבוקון 4 (מעכב פרוטאז אלבומין-ovomucoid). הוסף 150 μL של בקבוקון 3 (DNase) בתוספת 30 μL של APV.
    4. הכן 20 מ"ל של מדיום Neurobasal-B27 (NB-B27) כפי שסופק בטבלה 1.
  2. להקריב חולדה על ידי חנק עם CO2.
  3. הסר את הראש על ידי עריפת ראש עם גיליוטינה; מניחים אותו בצלחת פטרי 100 מ"מ ומרססים את הראש באתנול 70% לפני שמניחים אותו במכסה המנוע של זרימת למינאר.
  4. חותכים את השפם של החולדה עם מספריים כדי שהם לא יפריעו למניפולציה בעין.
  5. לאחוז בעצב הראייה עם מלקחיים כדי לשלוף את גלגל העין מספיק כדי להיות מסוגל לעשות חתך על פני העין עם אזמל.
  6. הסר את העדשה ואת ההומור זגוגית ולשלוף את הרשתית (רקמה דמוית כתום), בעוד השכבות הנותרות של העין להישאר בפנים (כולל שכבת אפיתל פיגמנט).
  7. מניחים את הרשתית בצלחת תרבות התא p60 מוכן בשלב 3.1.1.
  8. מעבירים את הרשתית לצלחת תרבות התא p60 שהוכנה בשלב 3.1.2 וחותכים אותה עם האזמל בחתיכות קטנות בגודל משוער < 1 מ"מ.
  9. מעבירים לצינור פלסטיק 15 מ"ל.
  10. דגירה את הרקמה במשך 30 דקות, באינקובטור לח ב 37 °C (70 °F) תחת 5% CO2, עם תסיסה כל 10 דקות.
  11. לנתק גושי תאים על ידי צנרת למעלה ולמטה עם פיפט פסטר זכוכית.
  12. צנטריפוגה השעיית התא ב 200 x g במשך 5 דקות.
  13. להשליך supernatant כדי להשבית פפאין, resuspend גלולה התא בתמיסה שהוכנה בשלב 3.1.3. (1.5 מ"ל עבור 2 עיניים).
  14. בזהירות pipet השעיית תא זה לתוך 5 מ"ל של בקבוקון מחדש 4.
  15. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
  16. תוך כדי צנטריפוגה, להסיר לחלוטין את ME-10 בינוני מלוח התא OEG 24 היטב (שהוכן בעבר בשלב 2) ולהחליף אותו עם 500 μL של NB-B27 בינוני לכל באר.
  17. השלך את supernatant ו resuspend התאים ב 2 מ"ל של NB-B27 בינוני.
  18. צלחת 100 μL של השעיית תאי רשתית, לכל באר של צלחת m24, על PLL מטופלים או OEG monolayers-coverslips.
  19. לשמור על תרבויות ב 37 °C (70 °F) עם 5% CO2 עבור 96 שעות במדיום NB-B27.

4. חיסון

  1. לאחר 96 שעות, לתקן את התאים במשך 10 דקות על ידי הוספת נפח זהה של 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1x PBS למדיום התרבות (600 μL) (ריכוז סופי PFA 2%).
  2. הסר את המדיה ואת PFA מהצלחת 24 multiwell ושוב להוסיף 500 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1x PBS. דגירה במשך 10 דקות.
  3. השלך את המתקן ולשטוף 3 פעמים עם 1x PBS במשך 5 דקות.
  4. חסום עם 0.1% טריטון X-100/1% FBS ב- PBS (PBS-TS) למשך 30-40 דקות.
  5. הכינו את הנוגדנים העיקריים במאגר PBS-TS כדלקמן: SMI31 (נגד חלבוני MAP1B ו- NF-H) נוגדן חד שבטי (1:500). 514 (מזהה חלבוני MAP2A ו- B) אנטיסרום פוליקלונלי ארנב (1:400).
  6. מוסיפים נוגדנים ראשוניים לקוקולטורות ומדגרים במשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
  7. למחרת, להשליך את הנוגדנים ולשטוף את coverslips עם 1x PBS, 3 פעמים, במשך 5 דקות.
  8. הכינו את הנוגדנים המשניים במאגר PBS-TS כדלקמן: עבור SMI-31, נגד העכבר אלקסה פלואור 488 (1:500). עבור 514, אנטי ארנב אלקסה-594 (1:500).
  9. דגירה תאים עם נוגדנים משניים פלואורסצנטיים המתאימים במשך 1 שעות, ב RT, בחושך.
  10. לשטוף את העטיפות עם 1x PBS, 3 פעמים, במשך 5 דקות, בחושך.
  11. לבסוף, הר coverslips עם מדיוםהרכבה (שולחן החומרים)ולשמור על 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: במידת הצורך, ניתן לבצע כתמי גרעיני פלואורסצנטיים עם DAPI (4,6-diamidino-2-פנילינדול). לפני ההרכבה, דגירה התאים במשך 10 דקות בחושך עם DAPI (10 מיקרוגרם / מ"ל ב 1x PBS). לשטוף את coverslips 3 פעמים עם 1x PBS ולבסוף, הר את coverslips עם מדיום הרכבה.

5. כימות התחדשות אקסון

הערה: דגימות מכמתות תחת המטרה 40x של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. מינימום של 30 תמונות יש לצלם על שדות אקראיים, עם לפחות 200 נוירונים, כדי לכמת עבור כל טיפול. כל ניסוי צריך לחזור על עצמו לפחות שלוש פעמים.

  1. לכמת את אחוז הנוירונים עם אקסון (SMI31 נייטריט חיובי) ביחס לאוכלוסייה הכוללת של RGNs (מזוהה עם MAP2A / B 514 חיסון חיובי של גוף עצבי דנדריטים).
  2. לכמת את אינדקס התחדשות אקסון או ממוצע אורך אקסונלי (μm / נוירון). פרמטר זה מוגדר כסכום האורכים (ב מיקרומטר) של כל האקסונים שזוהו, מחולק במספר הכולל של נוירונים שנספרו, בין אם הם הציגו אקסון או לא. אורך אקסונל נקבע באמצעות התוסף NeuronJ של תוכנת התמונה ImageJ (NIH-USA).
  3. חשב את הממוצע, סטיית התקן והמובהקות הסטטיסטית באמצעות התוכנה המתאימה.

תוצאות

בפרוטוקול זה, אנו מציגים מודל במבחנה כדי לתבוע את היכולת הנוירו-רגנרטיבית של OEG לאחר פגיעה עצבית. כפי שמוצג באיור 1, מקור ה-OEG הוא קו תאים שיבוט אנושי מונצח הפיך -Ts14 ו- Ts12-, הנובע מתרבויות עיקריות, המוכן מנורות חוש הריח המתקבלות בנתיחה שלאחר המוות15,1...

Discussion

השתלת OEG באתרי פגיעה במערכת העצבים המרכזית נחשבת לטיפול מבטיח לפציעה במערכת העצבים המרכזית בשל תכונותיה הפרו-נוירו-נוירו-רגנרטיביות המכוננות7,8,9. עם זאת, בהתאם למקור הרקמה - רירית חוש הריח (OM-OEG) לעומת נורת חוש הריח (OB-OEG) - או גיל התורם, קיימת ...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה כספית על ידי פרויקט SAF2017-82736-C2-1-R משריו דה סינסיה e Innovación ל MTM-F ועל ידי Fundación אוניברסיטת פרנסיסקו דה ויטוריה ל JS.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
antibody 514Reference 34Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.
antibody SMI-31BioLegend801601Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibodyThermoFisherA-21202
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibodyThermoFisherA-21207
B-27 SupplementGibco17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acidSigma283967NMDA receptor inhibitor
DAPISigmaD9542Nuclei fluorescent stain
DMEM-F12Gibco11320033Cell culture medium
FBSGibco11573397Fetal bovine serum
FBS-HycloneFisher Scientific16291082Fetal bovine serum
FluoromountSouthern Biotech0100-01Mounting medium
ImageJNational Institutes of Health (NIH-USA)Image software
L-GlutamineLonzaBE17-605F
Neurobasal MediumGibco21103049Neuronal cells culture medium
Papain Dissociation SystemWorthington Biochemical CorporationLK003150For use in neural cell isolation
PBSHome made
PBS-EDTALonzaH3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin BLonza17-745EBacteriostatic and bactericidal
Pituitary extractGibco13028014Bovine pituitary extract
Poly -L- lysine (PLL)SigmaA-003-M

References

  1. Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
  2. Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).
  3. Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury. Glia. 65 (4), 639-656 (2017).
  4. Moreno-Flores, M. T., et al. A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord. Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).
  5. Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair. Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).
  6. Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
  7. Su, Z., He, C. Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration. Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).
  8. Yao, R., et al. Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues. Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).
  9. Gómez, R. M., et al. Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs). Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).
  10. Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system. Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).
  11. Xue, L., et al. Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress. Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).
  12. Pastrana, E., et al. Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2. The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).
  13. Pastrana, E., et al. BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons. Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).
  14. Simón, D., et al. Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration. Glia. 59, 1458-1471 (2011).
  15. Lim, F., et al. Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity. Glia. 58, 546-558 (2010).
  16. García-Escudero, V., et al. Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization. Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).
  17. García-Escudero, V., et al. A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth. Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).
  18. Plaza, N., Simón, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept. Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).
  19. Deumens, R., et al. Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro. Neuroscience. 125 (3), 591-604 (2004).
  20. Chung, R. S., et al. Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors. Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).
  21. Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro. Glia. 53 (5), 467-476 (2006).
  22. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro. Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).
  23. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study. International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).
  24. Runyan, S. A., Phelps, P. E. Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro. Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).
  25. Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism. Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).
  26. Roloff, F., Ziege, S., Baumgärtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro. BMC Neuroscience. 14, 141 (2013).
  27. Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures. Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).
  28. Wigley, C. B., Berry, M. Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons. Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).
  29. Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture. Glia. 25 (3), 256-269 (1999).
  30. Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture. Glia. 44 (3), 232-241 (2003).
  31. Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration. Glia. 50 (1), 12-20 (2005).
  32. Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons. Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).
  33. García-Escudero, V., et al. Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons. Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).
  34. Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).
  35. Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons. Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).
  36. Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair. Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

165ensheathing OEGassayRGN

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved