Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta

Riepilogo

Presentiamo un modello in vitro per valutare la capacità neuroregenerativa olfattiva di glia (OEG), dopo la lesione neurale. Si basa su una cocultura di neuroni ganglionali della retina adulta assotomizzati (RGN) su monostrati OEG e sul successivo studio della rigenerazione assonale, analizzando marcatori assonali e somatodendritici RGN.

Abstract

Le cellule olfattive di glia ensheathing (OEG) sono localizzate dalla mucosa olfattiva a e nello strato nervoso olfattivo (ONL) del bulbo olfattivo. Per tutta la vita adulta, sono fondamentali per la crescita assonale dei neuroni olfattivi appena generati, dalla lamina propria all'ONL. A causa delle loro proprietà pro-rigenerative, queste cellule sono state utilizzate per favorire la rigenerazione assonale nel midollo spinale o nei modelli di lesione del nervo ottico.

Presentiamo un modello in vitro per testare e misurare la capacità neuroregenerativa OEG dopo la lesione neurale. In questo modello, l'OEG umano reversibilmente immortalato (ihOEG) è coltivato come monostrato, le retine vengono estratte da ratti adulti e i neuroni ganglionari retinali (RGN) sono coculati sul monostrato OEG. Dopo 96 ore, i marcatori assonali e somatodendritici nelle RGN vengono analizzati per immunofluorescenza e il numero di RGN con assone e la lunghezza assionale media / neurone vengono quantificati.

Questo protocollo ha il vantaggio rispetto ad altri saggi in vitro che si basano su neuroni embrionali o postnatali, che valuta le proprietà neuroregenerative OEG nel tessuto adulto. Inoltre, non è solo utile per valutare il potenziale neuroregenerativo di ihOEG, ma può essere esteso a diverse fonti di OEG o altre cellule gliali.

Introduzione

I neuroni del sistema nervoso centrale adulto (SNC) hanno una capacità rigenerativa limitata dopo lesioni o malattie. Una strategia comune per promuovere la rigenerazione del SNC è il trapianto, nel sito delle lesioni, di tipi cellulari che inducono la crescita assonale come cellule staminali, cellule di Schwann, astrociti o cellule olfattive glia (OEG)^1,2,3,4,5.

OEG deriva dalla cresta neurale⁶ e si trova nella mucosa olfattiva e nel bulbo olfattivo. Nell'adulto, i neuroni sensoriali olfattivi muoiono regolarmente a causa dell'esposizione ambientale e vengono sostituiti da neuroni appena differenziati. OEG circonda e guida questi nuovi assoni olfattivi per entrare nel bulbo olfattivo e stabilire nuove sinapsi con i loro obiettivi nel CNS^7. A causa di questi attributi fisiologici, l'OEG è stato utilizzato in modelli di lesione del SNC come midollo spinale o lesione del nervo ottico e le sue proprietà neuroregenerative e neuroprotettive^{diventano dimostrate 8,9,10,11}. Diversi fattori sono stati identificati come responsabili delle caratteristiche pro-rigenerative di queste cellule, tra cui la produzione o la secrezione di fattori di crescita neurotrofica e assonale^12,13,14.

Date le limitazioni tecniche per espandere le cellule OEG primarie, abbiamo precedentemente stabilito e caratterizzato linee clonali OEG umane immortalate reversibili (ihOEG), che forniscono una fornitura illimitata di OEG omogeneo. Queste cellule ihOEG derivano da colture primarie, preparate da bulbi olfattivi ottenuti in autopsie. Sono stati immortalati per trasduzione della subunità catalitica telomerasi (TERT) e dell'oncogene Bmi-1 e modificati con il virus SV40 grande antigene T^15,16,17,18. Due di queste linee cellulari ihOEG sono Ts14, che mantiene la capacità rigenerativa delle colture originali e Ts12, una linea rigenerativa bassa che viene utilizzata come basso controllo di rigenerazione in questi esperimenti¹⁸.

Per valutare la capacità dell'OEG di favorire la rigenerazione assonale dopo la lesione neurale, sono stati implementati diversi modelli in vitro. In questi modelli, l'OEG viene applicato a colture di diversa origine neuronale e vengono saggiate la formazione e l'allungamento della neurite, in risposta alla cocoltura gliale. Esempi di tali fonti neuronali sono i neuroni corticali del ratto neonatale¹⁹, le ferite da graffio eseguite sui neuroni embrionali del ratto dal tessuto^{corticale 20,}le espianto retiniche^{del ratto 21}, i neuroni postnatali ipotalamici o ippocampali del ratto^22,23, neuroni ganglionali della radice dorsale del ratto postnatale²⁴, neuroni del tratto corticospinale del topo postnatale^25,neuroni NT2^{umani 26}o neuroni corticali cerebrali postnatali su colture reattive simili a cicatrici astrociti²⁷.

In questi modelli, tuttavia, il test di rigenerazione si basa su neuroni embrionali o postnatali, che hanno una plasticità intrinseca che è assente nei neuroni adulti feriti. Per superare questo inconveniente, presentiamo un modello di rigenerazione assonale adulta in coculture di linee OEG con neuroni ganglionali retini adulti (RGN), basato su quello originariamente sviluppatoda Wigley et^al. In breve, il tessuto retinale viene estratto da ratti adulti e digerito con papaina. La sospensione cellulare retinica viene quindi placcata su coverlips trattate con polilisina o su monostrati Ts14 e Ts12. Le colture vengono mantenute per 96 ore prima di essere fissate e quindi viene eseguita l'immunofluorescenza per i marcatori assonale (proteine MAP1B e NF-H)³⁴ e somatodendritica (MAP2A e B)³⁵ marcatori. La rigenerazione assonale è quantificata come percentuale di neuroni con assone, rispetto alla popolazione totale di RGN e l'indice di rigenerazione assonale è calcolato come lunghezza assonale media per neurone. Questo protocollo non è solo utile per valutare il potenziale neuroregenerativo di ihOEG, ma può essere esteso a diverse fonti di OEG o altre cellule gliali.

Protocollo

NOTA: La sperimentazione animale è stata approvata dai comitati nazionali e istituzionali di bioetica.

1. cultura ihOEG (Ts12 e Ts14)

NOTA: Questa procedura viene eseguita in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza per la coltura tissutale.

1. Preparare un supporto di coltura OEG ME10 da 50 mL come previsto nella tabella 1.
2. Preparare 5 ml di DMEM/F12-FBS, come previsto nella tabella 1, in un tubo conico da 15 ml.
3. Riscaldare entrambi i supporti a 37 °C in un bagno d'acqua pulita, per 15 minuti.
4. Scongelare le fiale delle cellule Ts12 e Ts14 a 37 °C in un bagno d'acqua pulita.
5. Resuspend e aggiungere celle al supporto di coltura DMEM/F12-FBS preparato nel passaggio 2.
6. Centrifuga per 5 min a 200 x g.
7. Aspira al supernatante.
8. Aggiungere 500 μL di mezzo ME10 e rimosogliere il pellet.
9. Preparare un piatto di coltura cellulare p60 con 3 mL di ME10 e aggiungere la sospensione cellulare, dropwise.
10. Spostarsi per distribuire le celle in modo uniforme sulla piastra.
11. Cellule di coltura a 37 °C nel 5% di CO₂.
    NOTA: Dopo aver raggiunto la confluenza, deve essere fatto almeno un altro passaggio per ottimizzare le cellule per la cocoltura. È necessaria una confluenza del 90% prima di seminarli sulle copertine per la cocoltura. Un p-60 confluente ha un numero di cella medio di 7 x 10⁵ per Ts14 e 2,5 x 10⁶ per le linee cellulari Ts12. Le linee cellulari Ts12 e Ts14 devono essere passaggio ogni 2-3 giorni.

2. Preparazione di ihOEG (Ts12 e Ts14) per il saggio

NOTA: Questo passaggio deve essere fatto 24 ore prima della dissezione rgn e della cocoltura.

1. Trattare 12 mm Ø coprelips con 10 μg/mL poli-L-lisina (PLL) per 1 h.
   NOTA: Le coverlips possono essere lasciate durante la notte in soluzione PLL.
2. Lavare i copripelli con 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS), tre volte.
3. Staccare le cellule Ts12 e Ts14 ihOEG dal piatto di coltura cellulare p60.
   1. Aggiungere 4 ml di mezzo di coltura DMEM/F12-FBS(tabella 1)a un tubo conico da 15 ml. Riscaldare a 37 °C in un bagno d'acqua pulito.
   2. Rimuovere il mezzo dalle piastre e lavare le celle con 1 mL di 1x PBS-EDTA, una volta.
   3. Aggiungere 1 mL di tripside-EDTA alle cellule OEG e incubare per 3-5 min a 37 °C, 5% CO₂.
   4. Raccogliere le celle con una pipetta p1000 e trasferirle su un supporto preparato nel passaggio 3.1.
   5. Centrifuga per 5 min a 200 x g.
   6. Aspira al supernatante.
   7. Aggiungere 1 mL di mezzo ME10 e rimospend il pellet.
   8. Contare il numero di cellulare in un emocitometro.
4. Semina 80.000 cellule Ts14 o 100.000 cellule Ts12/pozzo sui copripasci in piastre da 24 pozzi in 500 μL di mezzo ME10.
5. Cellule di coltura a 37 °C nel 5% di CO₂, per 24 h.

3. Dissezione del tessuto retinale

NOTA: i ratti Wistar maschi di 2 mesi sono usati come fonte RGN. Due retine (un topo) per 20 pozzi di un piatto cellulare da 24 po '. Materiale chirurgico autoclave prima dell'uso. Il kit di dissociazione papaina viene acquistato commercialmente(Tavolo dei Materiali). Seguire le istruzioni del provider per la ricostituzione. Ricostituire L,L-2-ammino-5-acido fosfonovalerico (APV) in 5 mM e preparare le aliquote.

1. Il giorno del saggio, preparare i seguenti media.
   1. Preparare un piatto di coltura cellulare p60 con 5 mL di EBSS freddo (fiala 1 del kit di dissociazione della papaina).
   2. Preparare un piatto di coltura cellulare p60 con fiala ricostituita 2 (papaina) del kit di dissociazione della papaina più 50 μL di APV.  Aggiungere quindi 250 μL di flaconcino ricostituito 3 (DNasi più 5 μL di APV).
   3. In un mix di tubi sterili 2,7 ml di flaconcino 1 con 300 μL di flaconcino 4 (inibitore della proteasi albumina-ovomucoide). Aggiungere 150 μL di flaconcino 3 (DNasi) più 30 μL di APV.
   4. Preparare 20 mL di mezzo Neurobasal-B27 (NB-B27) come previsto nella tabella 1.
2. Sacrificare un topo per asfissia con CO₂.
3. Rimuovere la testa per decapitazione con ghigliottina; posizionarlo in una piastra di Petri da 100 mm e spruzzare la testa con etanolo al 70% prima di posizionare in una cappa di flusso laminare.
4. Tagliare i baffi del topo con le forbici in modo che non interferiscano con la manipolazione degli occhi.
5. Afferrare il nervo ottico con pinze per estrarre il bulbo oculare abbastanza da poter fare un'incisione sull'occhio con un bisturi.
6. Rimuovere la lente e l'umorismo vitreo ed estrarre la retina (tessuto arancione), mentre gli strati rimanenti dell'occhio rimangono all'interno (incluso lo strato epiteliale del pigmento).
7. Posizionare la retina nel piatto di coltura cellulare p60 preparato al passaggio 3.1.1.
8. Trasferire la retina nel piatto di coltura cellulare p60 preparato al passaggio 3.1.2 e tagliarla con il bisturi in piccoli pezzi di dimensioni approssimative < 1 mm.
9. Trasferimento in un tubo di plastica da 15 ml.
10. Incubare il tessuto per 30 min, in un incubatore umidificato a 37 °C sotto il 5% di CO₂, con agitazione ogni 10 min.
11. Dissociare i ciuffi cellulari tubazioni su e giù con una pipetta Pasteur in vetro.
12. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 min.
13. Scartare il supernatante e inattivare la papaina, rimescolare il pellet cellulare nella soluzione preparata al passaggio 3.1.3. (1,5 mL per 2 occhi).
14. Pipettare con cura questa sospensione cellulare in 5 mL di flaconcino ricostituito 4.
15. Centrifuga a 200 x g per 5 min.
16. Durante la centrifugazione, rimuovere completamente il mezzo ME-10 dalla piastra cellulare del pozzo OEG 24 (precedentemente preparata nel passaggio 2) e sostituirlo con 500 μL di mezzo NB-B27 per pozzo.
17. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 2 mL di mezzo NB-B27.
18. Piastra 100 μL di sospensione cellulare retinica, per pozzo della piastra m24, su coprispalla monostrati OEG trattati con PLL.
19. Mantenere le colture a 37 °C con il 5% di CO₂ per 96 h in mezzo NB-B27.

4. Immunostaining

1. Dopo 96 ore, fissare le cellule per 10 minuti aggiungendo lo stesso volume del 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x PBS al mezzo di coltura (600 μL) (concentrazione finale PFA 2%).
2. Rimuovere il supporto e il PFA dalla piastra a 24 poliwell e aggiungere ancora una volta 500 μL di paraformaldeide al 4% (PFA) in 1x PBS. Incubare per 10 minuti.
3. Scartare il fissatore e lavare 3 volte con 1x PBS per 5 minuti.
4. Blocco con 0,1% Tritone X-100/1% FBS in PBS (PBS-TS) per 30-40 min.
5. Preparare gli anticorpi primari nel tampone PBS-TS come segue: SMI31 (contro le proteine MAP1B e NF-H) anticorpo monoclonale (1:500). 514 (riconosce le proteine MAP2A e B) antisiero policlonale coniglio (1:400).
6. Aggiungere anticorpi primari alle coculture e incubare durante la notte a 4 °C.
7. Il giorno dopo, scartare gli anticorpi e lavare le coverlips con 1x PBS, 3 volte, per 5 minuti.
8. Preparare gli anticorpi secondari nel tampone PBS-TS come segue: Per SMI-31, anti-mouse Alexa Fluor 488 (1:500). Per 514, anti-coniglio Alexa-594 (1:500).
9. Incubare le cellule con i corrispondenti anticorpi secondari fluorescenti per 1 h, a RT, al buio.
10. Lavare i copripavimenti con 1x PBS, 3 volte, per 5 minuti, al buio.
11. Infine, montare i copripasto con supporto di montaggio(Tavolo deiMateriali) e mantenere a 4 °C.
    NOTA: Quando necessario, possono essere eseguiti nuclei fluorescenti contenenti DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindolo). Prima del montaggio, incubare le cellule per 10 minuti al buio con DAPI (10 μg/mL in 1x PBS). Lavare le coverlips 3 volte con 1x PBS e infine montare i copripavimenti con il supporto di montaggio.

5. Quantificazione della rigenerazione assionale

NOTA: I campioni sono quantificati nell'obiettivo 40x di un microscopio a epifluorescenza. Un minimo di 30 immagini dovrebbero essere scattate su campi casuali, con almeno 200 neuroni, da quantificare per ogni trattamento. Ogni esperimento deve essere ripetuto almeno tre volte.

1. Quantificare la percentuale di neuroni con assone (neurite positiva SMI31) rispetto alla popolazione totale di RGN (identificata con MAP2A/B 514 immunostaining positivo del corpo neuronale e dei dendriti).
2. Quantificare l'indice di rigenerazione assonale o la lunghezza assionale media (μm/neurone). Questo parametro è definito come la somma delle lunghezze (in μm) di tutti gli assoni identificati, divisi per il numero totale di neuroni contati, indipendentemente dal fatto che presentavano o meno un assone. La lunghezza assonale è determinata utilizzando il plugin NeuronJ del software di immagini ImageJ (NIH-USA).
3. Calcola la media, la deviazione standard e la significatività statistica utilizzando il software appropriato.

Risultati

In questo protocollo, presentiamo un modello in vitro per testare la capacità neuroregenerativa OEG dopo la lesione neuronale. Come mostrato nella Figura 1, la sorgente OEG è una linea cellulare clonale OEG immortalata reversibile -Ts14 e Ts12-, che deriva da colture primarie, preparate da bulbi olfattivi ottenuti in autopsie^15,17,18. Il tessuto retinale viene estratto da ratti adulti, digerito e ...

Discussione

Il trapianto OEG nei siti di lesione del SNC è considerato una terapia promettente per la lesione del SNC a causa delle sue proprietà pro-neuroregenerative costitutive^7,8,9. Tuttavia, a seconda della sorgente tissutale — mucosa olfattiva (OM-OEG) rispetto al bulbo olfattivo (OB-OEG) — o dell'età del donatore, esistono notevoli variazioni in tale^{capacità 26,31}

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
antibody 514	Reference 34		Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.
antibody SMI-31	BioLegend	801601	Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody	ThermoFisher	A-21202
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody	ThermoFisher	A-21207
B-27 Supplement	Gibco	17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid	Sigma	283967	NMDA receptor inhibitor
DAPI	Sigma	D9542	Nuclei fluorescent stain
DMEM-F12	Gibco	11320033	Cell culture medium
FBS	Gibco	11573397	Fetal bovine serum
FBS-Hyclone	Fisher Scientific	16291082	Fetal bovine serum
Fluoromount	Southern Biotech	0100-01	Mounting medium
ImageJ	National Institutes of Health (NIH-USA)		Image software
L-Glutamine	Lonza	BE17-605F
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	Neuronal cells culture medium
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	For use in neural cell isolation
PBS	Home made
PBS-EDTA	Lonza	H3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B	Lonza	17-745E	Bacteriostatic and bactericidal
Pituitary extract	Gibco	13028014	Bovine pituitary extract
Poly -L- lysine (PLL)	Sigma	A-003-M