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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein In-vitro-Modell zur Beurteilung der olfaktorischen Ensheathing Glia (OEG) neuroregenerativen Kapazität, nach neuronalen Verletzungen. Es basiert auf einer Kokultur von axotomisierten adulten retinalen Ganglion neuronen (RGN) auf OEG-Monolayer und anschließende Studie der axonalen Regeneration, durch die Analyse von RGN axonalen und somatodendritischen Markern.

Zusammenfassung

Olfaktorische Ensheathing-Glia-Zellen (OEG) werden von der Riechschleimhaut bis hin zur Riechnervenschicht (ONL) der Riechbirne lokalisiert. Während des gesamten Erwachsenenlebens sind sie der Schlüssel für den axonalen Anbau von neu erzeugten olfaktorischen Neuronen, von der Lamina propria bis zum ONL. Aufgrund ihrer pro-regenerativen Eigenschaften wurden diese Zellen verwendet, um die axonale Regeneration in Rückenmarks- oder Sehnervenverletzungsmodellen zu fördern.

Wir präsentieren ein In-vitro-Modell, um die neuroregenerative OEG-Kapazität nach neuronalen Verletzungen zu assayen und zu messen. In diesem Modell wird reversibel verewigtes menschliches OEG (ihOEG) als Monolayer kultiviert, Netzhaut werden aus erwachsenen Ratten extrahiert und Retinalganglionneuronen (RGN) werden auf die OEG-Monoschicht kokultiviert. Nach 96 h werden axonale und somatodendritische Marker in RGNs durch Immunfluoreszenz analysiert und die Anzahl der RGNs mit Axon und die mittlere axonale Länge/Neuron quantifiziert.

Dieses Protokoll hat den Vorteil gegenüber anderen In-vitro-Assays, die auf embryonalen oder postnatalen Neuronen basieren, dass es die neuroregenerativen OEG-Eigenschaften im erwachsenen Gewebe bewertet. Es ist auch nicht nur nützlich für die Bewertung des neuroregenerativen Potenzials von ihOEG, sondern kann auch auf verschiedene Quellen von OEG oder anderen Gliazellen ausgedehnt werden.

Einleitung

Adult Central Nervous System (ZNS) Neuronen haben begrenzte Regenerationsfähigkeit nach Verletzungen oder Krankheiten. Eine gemeinsame Strategie zur Förderung der ZNS-Regeneration ist die Transplantation von Zelltypen an der Verletzungsstelle, die axonales Wachstum induzieren, wie Stammzellen, Schwannzellen, Astrozyten oder olfaktorische Ensheathing-Glia (OEG)-Zellen1,2,3,4,5.

OEG leitet sich vom Neuralkamm6 ab und lokalisiert in der riech-Mukose und in der Riechbirne. Bei Erwachsenen sterben olfaktorische sensorische Neuronen regelmäßig als Folge der Umweltexposition und werden durch neu differenzierte Neuronen ersetzt. OEG umgibt und führt diese neuen olfaktorischen Axone in die Riechbirne und um neue Synapsen mit ihren Zielen in der CNS7zuetablieren. Aufgrund dieser physiologischen Eigenschaften, OEG wurde in Modellen der ZNS-Verletzung wie Rückenmark oder Sehnerv-Verletzung verwendet und seine neuroregenerativen und neuroprotektive Eigenschaften werden bewiesen8,9,10,11. Mehrere Faktoren wurden als verantwortlich für die pro-regenerativen Eigenschaften dieser Zellen identifiziert, einschließlich extrazellulärer Matrixproteasen Produktion oder Sekretion von neurotrophen und axonalen Wachstumsfaktoren12,13,14.

Angesichts der technischen Einschränkungen zur Erweiterung primärer OEG-Zellen haben wir zuvor reversible, unsterblichen humane OEG (ihOEG) Klonlinien etabliert und charakterisiert, die eine unbegrenzte Versorgung mit homogenen OEG bieten. Diese ihOEG-Zellen stammen aus Primärkulturen, die aus olfaktorischen Glühbirnen hergestellt werden, die in Autopsien gewonnen werden. Sie wurden durch Transduktion der telomerase katalytischen Untereinheit (TERT) und des Onkogens Bmi-1 verewigt und mit dem SV40-Virus großes T-Antigen15,16,17,18modifiziert. Zwei dieser ihOEG-Zelllinien sind Ts14, das die Regenerationsfähigkeit der ursprünglichen Kulturen beibehält, und Ts12, eine niedrige regenerative Linie, die in diesen Experimenten als niedrige Regenerationskontrolle verwendet wird18.

Zur Bewertung der OEG-Fähigkeit zur Förderung der axonalen Regeneration nach neuralen Verletzungen wurden mehrere In-vitro-Modelle implementiert. In diesen Modellen wird OEG auf Kulturen unterschiedlicher neuronaler Herkunft angewendet und Neuritenbildung und Dehnung – als Reaktion auf gliaale Kokultur – werden als Assay untersucht. Beispiele für solche neuronalen Quellen sind neonatale Ratte kortikale Neuronen19, Kratzwunden an Ratten embryonalen Neuronen aus kortikalen Gewebedurchgeführt 20, Ratte Netzhautexplante21, Ratte hypothalamische oder hippocampale postnatale Neuronen22,23, postnatale Ratte dorsale Wurzel Ganglion Neuronen24, postnatale Maus kortikospinalen Trakt Neuronen25, menschliche NT2 Neuronen26, oder postnatale zerebrale kortikale Neuronen auf reaktive Astrozyten Narben-ähnliche Kulturen27.

In diesen Modellen beruht der Regenerationstest jedoch auf embryonalen oder postnatalen Neuronen, die eine intrinsische Plastizität aufweisen, die bei verletzten erwachsenen Neuronen fehlt. Um diesen Nachteil zu überwinden, präsentieren wir ein Modell der erwachsenen axonalen Regeneration in Kokulturen von OEG-Linien mit erwachsenen retinalen Ganglionneuronen (RGNs), basierend auf dem ursprünglich von Wigley et al.28,29,30,31 und modifiziert und von unserer Gruppe12,13,14,15,16,17,18,32,33. Kurz gesagt, Netzhautgewebe wird von erwachsenen Ratten extrahiert und mit Papain verdaut. Die Netzhautzellsuspension wird dann entweder auf polylysinbehandelten Abdeckungen oder auf Ts14- und Ts12-Monolayern plattiert. Kulturen werden 96 h lang gepflegt, bevor sie fixiert werden, und dann wird immunfluoreszenz für axonale (MAP1B- und NF-H-Proteine)34 und somatodendritische (MAP2A und B)35 Marker durchgeführt. Die axonale Regeneration wird als Prozentsatz der Neuronen mit Axon quantifiziert, in Bezug auf die Gesamtpopulation der RGNs und der axonale Regenerationsindex wird als mittlere axonale Länge pro Neuron berechnet. Dieses Protokoll ist nicht nur nützlich für die Bewertung des neuroregenerativen Potenzials von ihOEG, sondern kann auch auf verschiedene Quellen von OEG oder anderen Gliazellen ausgedehnt werden.

Protokoll

HINWEIS: Tierversuche wurden von nationalen und institutionellen Bioethik-Ausschüssen genehmigt.

1. ihOEG (Ts12 und Ts14) Kultur

HINWEIS: Dieses Verfahren wird unter sterilen Bedingungen in einem Gewebekultur-Biosicherheitsschrank durchgeführt.

  1. Bereiten Sie 50 ml ME10 OEG-Kulturmedium wie in Tabelle 1vorgesehen vor.
  2. Bereiten Sie 5 ml DMEM/F12-FBS, wie in Tabelle 1vorgesehen, in einem 15 ml konischen Rohr vor.
  3. Beide Medien bei 37 °C in einem sauberen Wasserbad 15 min erwärmen.
  4. Ts12- und Ts14-Zellen fläschbar bei 37 °C in einem sauberen Wasserbad.
  5. Resuspendieren und fügen Sie Zellen zum DMEM/F12-FBS-Kulturmedium hinzu, das in Schritt 2 vorbereitet wurde.
  6. Zentrifuge für 5 min bei 200 x g.
  7. Aspirieren Sie den Überstand.
  8. Fügen Sie 500 l ME10 medium hinzu und setzen Sie das Pellet wieder auf.
  9. Bereiten Sie eine p60 Zellkulturschale mit 3 ml ME10 vor und fügen Sie die zelluläre Suspension tropfenweise hinzu.
  10. Bewegen Sie sich, um die Zellen gleichmäßig über die Platte zu verteilen.
  11. Kulturzellen bei 37 °C in 5%CO2.
    HINWEIS: Nach dem Erreichen des Zusammenflusses muss mindestens ein weiterer Durchgang durchgeführt werden, um Zellen für die Kokultur zu optimieren. 90 % Zusammenfluss werden benötigt, bevor sie auf den Deckeln für die Kokultur gesät werden. Eine konfluente p-60 hat eine mittlere Zellzahl von 7 x 105 für Ts14 und 2,5 x 106 für Ts12-Zelllinien. Die Zelllinien Ts12 und Ts14 sollten alle 2–3 Tage durchgelassen werden.

2. Vorbereitung von ihOEG (Ts12 und Ts14) für den

HINWEIS: Dieser Schritt muss 24 h vor DER RGN-Sektion und Kokultur durchgeführt werden.

  1. 12 mm ,-Abdeckungen mit 10 g/ml Poly-L-Lysin (PLL) für 1 h behandeln.
    HINWEIS: Die Abdeckungen können über Nacht in der PLL-Lösung gelassen werden.
  2. Waschen Sie die Deckellipsen dreimal mit 1x Phosphatpuffer-Saline (PBS).
  3. Trennen Sie Ts12 und Ts14 ihOEG-Zellen von p60-Zellkulturschale.
    1. 4 ml DMEM/F12-FBS Kulturmedium (Tabelle 1) zu einem 15 ml konischen Rohr hinzufügen. Bei 37 °C in einem sauberen Wasserbad erwärmen.
    2. Entfernen Sie das Medium von Platten und Waschzellen mit 1 ml 1x 1x PBS-EDTA, einmal.
    3. 1 ml Trypsin-EDTA in die OEG-Zellen geben und 3–5 min bei 37 °C, 5%CO2brüten.
    4. Sammeln Sie Zellen mit einer p1000 Pipette und übertragen Sie sie auf Mittel in Schritt 3.1 vorbereitet.
    5. Zentrifuge für 5 min bei 200 x g.
    6. Aspirieren Sie den Überstand.
    7. 1 ml ME10 medium hinzufügen und das Pellet wieder aussetzen.
    8. Zählen Sie die Zellenzahl in einem Hämozytometer.
  4. Samen 80.000 Ts14-Zellen oder 100.000 Ts12-Zellen/well auf die Decklippen in 24-Well-Platten in 500 l ME10 medium.
  5. Kulturzellen bei 37 °C in 5%CO2, für 24 h.

3. Netzhautgewebesektion

HINWEIS: 2 Monate alte männliche Wistar Ratten werden als RGN-Quelle verwendet. Zwei Netzhaut (eine Ratte) für 20 Brunnen einer 24-Well-Zellschale. Autoklav chirurgisches Material vor gebrauchen. Papain Dissoziations-Kit wird kommerziell gekauft (Tabelle der Materialien). Befolgen Sie die Anweisungen des Anbieters zur Rekonstitution. D,L-2-amino-5-phosphonovalersäure (APV) in 5 mM Vorrat rekonstituieren und die Aliquots vorbereiten.

  1. Bereiten Sie am Tag des Testes die folgenden Medien vor.
    1. Bereiten Sie eine p60 Zellkulturschale mit 5 ml kaltem EBSS (Vial 1 des Papain-Dissoziationskits) zu.
    2. Bereiten Sie eine p60 Zellkulturschale mit rekonstituierter Durchstechflasche 2 (Papain) des Papain-Dissoziationskits plus 50 l APV vor.  Fügen Sie dann 250 l rekonstituierte Durchstechflasche 3 (DNase plus 5 l APV) hinzu.
    3. In einer sterilen Rohrmischung 2,7 ml Durchstechflasche 1 mit 300 l Durchstechflasche 4 (Albumin-Ovomucoid-Proteasehemmer). Fügen Sie 150 l Durchstechflasche 3 (DNase) plus 30 l APV hinzu.
    4. Bereiten Sie 20 ml Neurobasal-B27 medium (NB-B27) gemäß Tabelle 1vor.
  2. Opfern Sie eine Ratte durch Ersticken mitCO2.
  3. Entfernen Sie den Kopf durch Enthauptung mit Guillotine; In eine 100 mm Petrischale geben und den Kopf mit Ethanol 70% besprühen, bevor er in eine laminare Durchflusshaube gegeben wird.
  4. Schneiden Sie die Schnurrhaare der Ratte mit einer Schere, damit sie die Augenmanipulation nicht stören.
  5. Greifen Sie den Sehnerv mit Derkunden, um den Augapfel so weit herauszuziehen, dass er mit einem Skalpell einen Schnitt über das Auge machen kann.
  6. Entfernen Sie die Linse und Glaskörper Humor und ziehen Sie die Netzhaut (orange-ähnliches Gewebe), während die verbleibenden Schichten des Auges im Inneren bleiben (einschließlich der Pigment-Epithelschicht).
  7. Legen Sie die Netzhaut in die in Schritt 3.1.1 zubereitete zellkulturgericht p60.
  8. Übertragen Sie die Netzhaut auf die in Schritt 3.1.2 zubereitete p60-Zellkulturschale und schneiden Sie sie mit dem Skalpell in kleine Stücke von ungefährer Größe < 1 mm.
  9. Transfer auf ein 15 ml Kunststoffrohr.
  10. Inkubieren Sie das Gewebe für 30 min, in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2, mit Agitation alle 10 min.
  11. Dissoziieren Sie Zellklumpen, indem Sie mit einer glasigen Pasteurpipette nach oben und unten pfeifen.
  12. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 x g für 5 min.
  13. Überstand entsorgen und Papain inaktivieren, das Zellpellet in der in Schritt 3.1.3 vorbereiteten Lösung wieder aufsetzen. (1,5 ml für 2 Augen).
  14. Diese Zellsuspension sorgfältig in 5 ml rekonstituierte Durchstechflasche 4 einleiten.
  15. Zentrifuge bei 200 x g für 5 min.
  16. Beim Zentrifugieren das ME-10 Medium vollständig von der OEG 24 Brunnenzellplatte (bisher in Schritt 2) entfernen und durch 500 l NB-B27 Medium pro Brunnen ersetzen.
  17. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 2 ml NB-B27-Medium wieder aus.
  18. Platte 100 l Netzhautzellsuspension, pro Bohrung der m24-Platte, auf PLL-behandelte oder OEG-Monolayer-Coverlipslips.
  19. Halten Sie Kulturen bei 37 °C mit 5%CO2 für 96 h in NB-B27 medium.

4. Immunostaining

  1. Fixieren Sie die Zellen nach 96 h für 10 min, indem Sie dem Kulturmedium (600 l) das gleiche Volumen von 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS (600 'L) (PFA Endkonzentration 2%) zusetzen.
  2. Entfernen Sie die Medien und PFA von der 24-Multiwell-Platte und fügen Sie erneut 500 l 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS hinzu. 10 min inkubieren.
  3. Entsorgen Sie den Fixierer und waschen Sie 3 mal mit 1x PBS für 5 min.
  4. Block mit 0,1% Triton X-100/1% FBS in PBS (PBS-TS) für 30–40 min.
  5. Bereiten Sie die primären Antikörper im PBS-TS-Puffer wie folgt vor: SMI31 (gegen MAP1B- und NF-H-Proteine) monoklonaler Antikörper (1:500). 514 (erkennt MAP2A- und B-Proteine) polyklonales Antiserum (1:400).
  6. Fügen Sie Primärantikörper zu Kokulturen hinzu und brüten Sie über Nacht bei 4 °C.
  7. Am nächsten Tag die Antikörper entsorgen und die Deckellipsen mit 1x PBS, 3 mal, für 5 min waschen.
  8. Bereiten Sie die sekundären Antikörper im PBS-TS-Puffer wie folgt vor: Für SMI-31, Anti-Maus Alexa Fluor 488 (1:500). Für 514, Anti-Kaninchen Alexa-594 (1:500).
  9. Inkubieren Sie Zellen mit den entsprechenden fluoreszierenden Sekundärantikörpern für 1 h, bei RT, im Dunkeln.
  10. Waschen Sie die Abdeckungen mit 1x PBS, 3 mal, für 5 min, im Dunkeln.
  11. Schließlich befestigen Sie Abdeckungen mit Montagemedium (Materialtabelle) und halten Sie bei 4 °C.
    HINWEIS: Bei Bedarf können fluoreszierende Kerne mit DAPI (4,6-Diamidino-2-Phenylindole) gefärbt werden. Vor der Montage die Zellen 10 min im Dunkeln mit DAPI (10 g/ml in 1x PBS) inkubieren. Waschen Sie die Abdeckungen 3 mal mit 1x PBS und montieren Sie schließlich die Abdeckungen mit dem Montagemedium.

5. Axonale Regenerationsquantifizierung

HINWEIS: Die Proben werden unter dem 40-fachen Objektiv eines Epifluoreszenzmikroskops quantifiziert. Mindestens 30 Bilder sollten auf zufälligen Feldern mit mindestens 200 Neuronen aufgenommen werden, die für jede Behandlung quantifiziert werden müssen. Jedes Experiment sollte mindestens dreimal wiederholt werden.

  1. Quantifizieren Sie den Prozentsatz der Neuronen mit Axon (SMI31 positives Neurit) im Verhältnis zur Gesamtpopulation von RGNs (identifiziert mit MAP2A/B 514 positiver Immunostainierung von neuronalen Körpern und Dendriten).
  2. Quantifizieren Sie den axonalen Regenerationsindex oder die mittlere Axonlänge (m/neuron). Dieser Parameter ist definiert als die Summe der Längen (in m) aller identifizierten Axone, dividiert durch die Gesamtzahl der gezählten Neuronen, unabhängig davon, ob sie ein Axon präsentierten oder nicht. Die Axonallänge wird mit dem Plugin NeuronJ der Bildsoftware ImageJ (NIH-USA) bestimmt.
  3. Berechnen Sie den Mittelwert, die Standardabweichung und die statistische Signifikanz mit der entsprechenden Software.

Ergebnisse

In diesem Protokoll stellen wir ein In-vitro-Modell vor, um die neuroregenerative OEG-Kapazität nach neuronalen Verletzungen zu assayen. Wie in Abbildung 1dargestellt, ist die OEG-Quelle eine reversible verewigte menschliche OEG-Klonzelllinie -Ts14 und Ts12-, die aus Primärkulturen stammt, die aus geruchserhaltenden Glühbirnen hergestellt werden, die in Autopsien15,17,18hergestellt werden. Netzha...

Diskussion

OEG-Transplantation an ZNS-Verletzungsstellen gilt aufgrund ihrer konstitutiven pro-neuroregenerativen Eigenschaften7,8,9als vielversprechende Therapie für ZNS-Verletzungen. Je nach Gewebequelle – Olfaktorische Schleimhaut (OM-OEG) versus Olfaktorinde (OB-OEG) – oder dem Alter des Spenders besteht jedoch eine erhebliche Veränderung in dieser Kapazität26,31,

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Projekt SAF2017-82736-C2-1-R von Ministerio de Ciencia e Innovacién bis MTM-F und durch die Stiftung Universidad Francisco de Vitoria an JS finanziell unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
antibody 514Reference 34Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.
antibody SMI-31BioLegend801601Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibodyThermoFisherA-21202
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibodyThermoFisherA-21207
B-27 SupplementGibco17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acidSigma283967NMDA receptor inhibitor
DAPISigmaD9542Nuclei fluorescent stain
DMEM-F12Gibco11320033Cell culture medium
FBSGibco11573397Fetal bovine serum
FBS-HycloneFisher Scientific16291082Fetal bovine serum
FluoromountSouthern Biotech0100-01Mounting medium
ImageJNational Institutes of Health (NIH-USA)Image software
L-GlutamineLonzaBE17-605F
Neurobasal MediumGibco21103049Neuronal cells culture medium
Papain Dissociation SystemWorthington Biochemical CorporationLK003150For use in neural cell isolation
PBSHome made
PBS-EDTALonzaH3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin BLonza17-745EBacteriostatic and bactericidal
Pituitary extractGibco13028014Bovine pituitary extract
Poly -L- lysine (PLL)SigmaA-003-M

Referenzen

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