评估小鼠全身脂质处理能力

摘要

本文为评估小鼠脂质代谢提供了三种简单易行的检测。

摘要

评估脂质代谢是评估代谢功能的基石，它被认为是活体代谢研究的关键。脂质是许多不同的分子的一类，其合成和代谢涉及许多通路。需要一个起点来评估营养和肥胖研究的脂质血脂。本文描述了三种简单易行的方法，这些方法几乎不需要专业知识或实践来掌握，并且大多数实验室都可以将其改编为筛查小鼠的脂质代谢异常。这些方法是（1）测量几个禁食血清脂质分子使用商业套件（2）通过口服脂质耐受性测试，以评估饮食脂质处理能力，（3）评估对药物化合物CL 316，243的反应，在小鼠。这些方法将共同提供小鼠脂质处理能力的高水平概述。

引言

碳水化合物和脂质是能量代谢的两大基质。异常脂质代谢导致许多人类疾病，包括II型糖尿病、心血管疾病、脂肪肝疾病和癌症。膳食脂质，主要是甘油三酯，通过肠道吸收到淋巴系统，并进入心脏¹附近的血小龙静脉循环。脂质由血液中的脂蛋白颗粒携带，脂肪酸脂肪通过脂蛋白脂酶在肌肉和脂肪组织²等外周器官的作用而释放。剩余的富含胆固醇的残留颗粒由肝脏³清除。老鼠在实验室中被广泛用作研究脂质代谢的研究模型。拥有全面的遗传工具集和相对较短的繁殖周期，它们是研究脂质如何被吸收、合成和代谢的有力模型。

由于脂质代谢的复杂性，复杂的脂质学研究或同位素示踪研究通常用于量化脂质物种或脂质相关代谢通量和命运的集合^4，5。这给没有专门设备或专业知识的研究人员带来了巨大的挑战。在本文中，我们提出了三个测试，在使用具有技术挑战性的技术之前，这些测试可以作为初始测试。它们是小鼠的非终端程序，因此非常有助于识别脂质处理能力的潜在差异和缩小受影响的过程。

首先，测量禁食血清脂质分子可以帮助确定小鼠的整体脂质特征。老鼠应该禁食，因为许多脂质物种在饭后会上升，而且增加的程度受到饮食成分的强烈影响。许多脂质分子，包括总胆固醇、甘油三酯和非酯化脂肪酸（NEFA），都可以使用商业套件和可读取吸血的板读器进行测量。

其次，口服脂质耐受性测试将脂质处理能力评估为吸收和代谢的净效应。口服的脂内导致循环甘油三酯水平激增（1至2小时），之后血清甘油三酯水平恢复到基底水平（4至6小时）。此检测提供了有关鼠标处理外源性脂质的程度的信息。心脏、肝脏和棕色脂肪组织是甘油三酯的活跃消费者，而白色脂肪组织将其储存为能量储备。这些功能的变化将导致测试结果的差异。

最后，促进脂溶解以调动储存的脂质被认为是减肥的可能策略。脂肪组织中的β3-肾神经受体信号通路在脂肪细胞脂解中起着重要作用，人类遗传学已经识别出^{与肥胖相关的}3-肾上腺受体中功能丧失的多态性Trp64Arg。CL 316，243，一种特异且有效的β-肾上腺素受体激动剂，刺激脂肪组织脂解和甘油释放。评估鼠标对CL 316，243的反应可以提供关于化合物的开发、改进和理解的宝贵信息。

总的来说，这些测试可以用作小鼠脂质代谢状态变化的初始屏幕。它们是为仪器和试剂的可访问性而选择的。通过这些检测结果，研究人员可以形成动物代谢适应的整体图景，并决定更复杂和更有针对性的方法。

研究方案

根据贝勒医学院（BCM）机构动物护理和使用委员会批准的动物护理和实验协议，动物被安置在标准化条件下。动物被喂食标准或特殊的饮食，水广告脂质，并保持12小时的日夜循环。

1. 测量禁食血清脂

1. 下午5点以后将老鼠转移到一个新的笼子里，并快速免费取水，过夜（实验前大约16个小时的禁食）。通宵禁食确保完全排空小鼠的胃肠道。
   注意:老鼠在禁食时吃粪便，所以食物提取不能确保它们被充分禁食。
2. 第二天早上，抓住老鼠的尾巴，把它放在水面上。轻轻地拉回鼠标尾部，将鼠标放在抑制器中。将鼻子约束重新训练鼠标的运动，同时仍然允许鼠标呼吸。拧紧鼻子约束的旋钮。监控胸部运动，确保动物正常呼吸，并尽量减少鼠标在抑制器中停留的时间。
3. 在自由移动的鼠标的尾部静脉中做一个表面切口（尼克），从切口中抽出25μL的血液，制成玻璃毛细血管（填充大约1/3的毛细血管），而不抑制鼠标。迅速将血液吹入微中心管中。
4. 使用型粉停止出血，在笼子里补充饲料，并确保小鼠没有出现压力的迹象。
5. 完成所有小鼠的血液抽取。
6. 让血液凝固，使其在室温下不受干扰1小时。在冷藏台式微中心中，在 4 °C 下以 2，000 x g 旋转凝固的血液样本 10 分钟，并转移超高血清（血清）进行分析。
   注:血清可在 +20 °C 下存储数周，直到分析。对于长期存储，将血清保持在 +70°C。
7. 使用制造商提供的协议分析每个脂质代谢物。

2. 口服脂内耐受性测试

1. 下午5点以后，称量小鼠，计算第二天交给它们的脂内体积。然后，将老鼠转移到一个新的笼子里，并禁食它们过夜（16小时）。
2. 第二天早上，将老鼠的尾巴放在一个笼子里，以帮助识别它们在随后的出血步骤中。
3. 在尾部静脉上划一个刻痕，从切口中抽出 15 μL 的血液到玻璃毛细血管中（填充大约 1/5 的毛细血管），并快速将血液吹入 T = 0 血清的微中心管中。
   注意:除非小鼠出现过度出血，否则无需在检测过程中止血。
4. Gavage 小鼠使用 18G 盖瓦奇针的 20% 内脂，每克体重为 15 μl，使用禁食前体重。将每只鼠标堆叠 1 分钟。
   注:称量动物，确定适当的咽针大小。一般来说，18号的咽针适合25克>小鼠，20-22号的咽针更适合较小的动物。擦伤老鼠，抓住肩膀上的皮肤，把动物的头抱到位。将咽针放入口腔，然后沿着上味轻轻推进，直到食道到达。管子应该通过没有阻力。一旦达到适当的深度，内脂可以慢慢管理。在插入针头时，在管理脂内后，轻轻取出相同角度的针头。将动物送回笼子，并监测有呼吸困难或其他不适的迹象。
   注:缺乏口腔咽部或尾部出血技术经验的研究人员可以将每只小鼠堆叠2分钟甚至更长时间。
5. 在 T = 1、2、3、4、5 和 6 小时抽血:通过尾部出血每只小鼠抽取 15 μL 的血液（1/5 毛细管），并迅速将血液吹入微中心管中。
6. 在室温下以 2，000 x g 旋转血液样本，在微中心中旋转 10 分钟。将超高纳特（包括浮动脂肪层）转移到 PCR 管中存储。超高纳特可以在 +20 °C 下存储数周，直到分析。
   注:超高等离子体应该是等离子体。如果某些样品在离心时已经凝固，则不会影响甘油三酯测量。
7. 最后一次采血后，停止使用型粉出血，在笼子里补充饲料，并确保小鼠没有表现出极度紧张的迹象。
8. 装载 2 μL 甘油三酯标准，并将超分子收集到 96 井板中。
9. 加入 200 μL 甘油三酯试剂，让板在 37 °C 下孵育 5 分钟，用于颜色开发。
10. 测量实验室板读卡器中 500 nm 的吸血量，参考波长为 660 nm，并计算样本的浓度。

3. β3 肾上腺受体激动器 CL 316，243 刺激利波利西斯检测

1. 准备 CL 316，243 作为无菌盐水中 5 毫克/mL （50 倍） 的库存溶液，并储存在 ±20°C，直到使用。
2. 在早晨，称量小鼠，计算实验所需的稀释CL 316，243溶液量。小鼠将得到10μL每克体重稀释CL 316，243，为1毫克/千克体重的最后剂量。
3. 将老鼠转移到一个新的笼子里，免费取水，并禁食4小时。
4. 使用盐水从 50 倍库存中制作足够的 1x CL 316，243 溶液。1x CL 316，243 溶液的最终浓度为 0.1 毫克/mL。使用盐水进行对照组。
5. 标记存放在同一笼子里的老鼠的尾巴，以便在出血步骤中轻松识别。
6. 在尾部静脉中划出一个刻痕，从切口中抽取 15 μL 的血液到玻璃毛细血管中（填充大约 1/5 的毛细血管），并快速将血液吹入微中心管中，用于 T = 0 样本。
   注意:除非小鼠出现过度出血，否则无需在检测过程中止血。
7. 以 10 μL/g 体重的体量，在腹地注射稀释的 CL 316，243 溶液（或如果包含在实验中）。将每只鼠标堆叠 1 分钟。每60分钟的实验最多使用5只小鼠，或为双人小组使用10只小鼠。
8. 在 T = 5、15、30、60 分钟抽血:通过尾部出血每只小鼠抽取 15 微升血液（1/5 毛细血管）。
9. 最后一次采血后，停止使用型粉出血，在笼子里补充饲料，并确保小鼠没有表现出极度紧张的迹象。
10. 在冷藏微中心中，在 4 °C 下以 2，000 x g 旋转血液样本 5 分钟。将超纳特转移到 PCR 管进行存储。超高纳特可以在 +20°C 下存储数周，直到分析。
11. 负载 1 μL 的 2 倍串序稀释甘油标准 （0.156， 0.312， 0.625， 1.25 和 2.5 毫克/毫升三聚氨酯当量浓度）， 并收集超分子到 96 井板.加入100微升免费甘油试剂，让板在37°C孵育5分钟，使颜色形成。
12. 使用实验室板读卡器测量 540 nm 的吸血量，并计算样品的浓度。

结果

我们用三段摘录显示，每次检测都提供了有关小鼠脂质代谢的宝贵信息。对于C57BL/6J雄性小鼠来说，从8周大开始接受8周高脂肪饮食（HFD）喂养的挑战，总胆固醇水平显著升高，而血清甘油三酯和NEFA则没有（表1），这表明血液中的甘油三酯和NEFA不是主要受膳食脂肪挑战的调节。在第二组小鼠中，C57BL/6J和C57BL6/N子系统从8周大开始喂养HFD8周。他们的血清甘油三酯水平在口腔脂内挑战后?...

讨论

这三个分析描述了实验室中强有力的功能，并考虑了几个关键问题。夜间禁食是确定禁食血清脂质水平和口腔脂内耐受性测试所必需的。对于口腔脂内耐受性测试，在室温下旋转血液以尽量减少脂肪层的形成至关重要，尤其是在 1 小时和 2 小时的时间点:重要的是不要丢弃这个脂肪层，如果它形成。确保将超高肽与脂质层一起转移，并轻轻地将它们混合在一起，以进行甘油三酯测定。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
20% Intralipid	Sigma Aldrich	I141
BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml	Shaotong	B07F1KRMYN
CL 316,243 Hydrate	Sigma-Aldrich	C5976
Curved Feeding Needles (18 Gauge)	Kent Scientific	FNC-18-2-2
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma	G7793
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A	Fujifilm Wako Diagnostics	999-34691
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B	Fujifilm Wako Diagnostics	991-34891
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A	Fujifilm Wako Diagnostics	995-34791
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B	Fujifilm Wako Diagnostics	993-35191
Matrix Plus Chemistry Reference Kit	Verichem	9500
Micro Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-222-168
Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized	Fisher Scientific	22-362-574
NEFA STANDARD SOLUTION	Fujifilm Wako Diagnostics	276-76491
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
Thermo Scientific Triglycerides Reagent	Fisher Scientific	TR22421
Total Cholesterol Reagents	Thermo Scientifi	TR13421