Valutazione della capacità di manipolazione dei lipidi di tutto il corpo nei topi

Riepilogo

Questo documento fornisce tre saggi facili e accessibili per valutare il metabolismo lipidico nei topi.

Abstract

La valutazione del metabolismo lipidico è una pietra miliare della valutazione della funzione metabolica ed è considerata essenziale per gli studi sul metabolismo in vivo. I lipidi sono una classe di molte molecole diverse con molti percorsi coinvolti nella loro sintesi e metabolismo. È necessario un punto di partenza per valutare l'emostasi lipidica per la ricerca sulla nutrizione e l'obesità. Questo documento descrive tre metodi facili e accessibili che richiedono poca esperienza o pratica per padroneggiare e che possono essere adattati dalla maggior parte dei laboratori per lo screening delle anomalie del metabolismo lipidico nei topi. Questi metodi sono (1) la misurazione di diverse molecole lipidiche sieriche a digiuno utilizzando kit commerciali (2) l'analisi della capacità di manipolazione dei lipidi nella dieta attraverso un test di tolleranza intralipidica orale e (3) la valutazione della risposta a un composto farmaceutico, CL 316.243, nei topi. Insieme, questi metodi forniranno una panoramica di alto livello della capacità di gestione dei lipidi nei topi.

Introduzione

Carboidrati e lipidi sono due substrati principali per il metabolismo energetico. Il metabolismo lipidico aberrante provoca molte malattie umane, tra cui il diabete di tipo II, le malattie cardiovascolari, le malattie del fegato grasso e i tumori. I lipidi alimentari, principalmente trigliceridi, vengono assorbiti attraverso l'intestino nel sistema linfatico ed entrano nella circolazione venosa nei chilomicroni vicino al cuore¹. I lipidi sono trasportati da particelle di lipoproteine nel flusso sanguigno, dove le parti di acidi grassi sono liberate dall'azione della lipoproteina lipasi negli organi periferici come il muscolo e il tessuto adiposo². Le restanti particelle residue ricche di colesterolo vengono eliminate dal fegato³. I topi sono stati ampiamente utilizzati nei laboratori come modello di ricerca per studiare il metabolismo dei lipidi. Con set di strumenti genetici completi disponibili e un ciclo riproduttivo relativamente breve, sono un modello potente per studiare come i lipidi vengono assorbiti, sintetizzati e metabolizzati.

A causa della complessità del metabolismo lipidico, sofisticati studi di lipidomica o studi di traccianti isotopici vengono solitamente utilizzati per quantificare collezioni di specie lipidiche o flussi metabolici e destini correlati ai lipidi^4,5. Ciò crea una sfida enorme per i ricercatori senza attrezzature o competenze specializzate. In questo documento, presentiamo tre saggi che possono servire come test iniziali prima di utilizzare tecniche tecnicamente impegnative. Sono procedure non terminali per i topi e quindi molto utili per identificare potenziali differenze nella capacità di gestione dei lipidi e restringere i processi interessati.

In primo luogo, misurare le molecole lipidiche sieriche a digiuno può aiutare ad accertare il profilo lipidico complessivo di un topo. I topi dovrebbero essere a digiuno, perché molte specie lipidiche aumentano dopo i pasti e l'entità dell'aumento è fortemente influenzata dalla composizione della dieta. Molte molecole lipidiche, tra cui colesterolo totale, trigliceridi e acido grasso non esterificato (NEFA), possono essere misurate utilizzando un kit commerciale e un lettore di piastre in grado di leggere l'assorbanza.

In secondo luogo, un test di tolleranza intralipidica orale valuta la capacità di manipolazione dei lipidi come effetto netto dell'assorbimento e del metabolismo. Un intralipide somministrato per via orale provoca un picco nei livelli circolanti di trigliceridi (1-2 ore), dopo di che i livelli sierici di trigliceridi ritornano ai livelli basali (4-6 ore). Questo test offre informazioni su quanto bene un topo può gestire i lipidi esogeni. Cuore, fegato e tessuto adiposo bruno sono consumatori attivi di trigliceridi, mentre il tessuto adiposo bianco lo immagazzina come riserva di energia. I cambiamenti in queste funzioni porteranno a differenze nei risultati del test.

Infine, promuovere la lipolisi per mobilitare i lipidi immagazzinati è considerata una possibile strategia per la perdita di peso. La via di segnalazione del recettore β3-adrenergico nel tessuto adiposo svolge un ruolo importante nella lipolisi degli adipociti e la genetica umana ha identificato un polimorfismo di perdita di funzione Trp64Arg nel recettore β3-adrenergico correlato con l'obesità⁶. CL 316.243, uno specifico e potente agonista del recettore β3-adrenergico, stimola la lipolisi del tessuto adiposo e il rilascio di glicerolo. La valutazione della risposta di un topo a CL 316.243 può fornire preziose informazioni sullo sviluppo, il miglioramento e la comprensione dell'efficacia del composto.

Collettivamente, questi test possono essere utilizzati come schermo iniziale per i cambiamenti nello stato metabolico lipidico dei topi. Sono scelti per l'accessibilità degli strumenti e dei reagenti. Con i risultati derivati da questi test, i ricercatori possono formare un quadro generale dell'idoneità metabolica dei loro animali e decidere approcci più sofisticati e mirati.

Protocollo

Gli animali sono alloggiati in condizioni standardizzate seguendo la cura degli animali e protocolli sperimentali approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Baylor College of Medicine (BCM). Gli animali sono nutriti con una dieta standard o speciale, acqua ad libitum, e tenuti con un ciclo giorno / notte di 12 ore.

1. Misurazione dei lipidi sierici a digiuno

1. Trasferisci i topi in una nuova gabbia dopo le 17:00 e velocemente con libero accesso all'acqua, durante la notte (con circa 16 ore di digiuno prima dell'esperimento). Il digiuno notturno assicura il completo svuotamento dei tratti gastrointestinali dei topi.
   NOTA: I topi mangiano le loro feci durante il digiuno, quindi l'astinenza da cibo non può garantire che siano adeguatamente a digiuno.
2. La mattina dopo, afferra il topo per la coda e posizionalo su una superficie. Tirare indietro delicatamente la coda del mouse per posizionare il mouse nel freno. Posizionare il sistema di ritenuta del naso per riqualificare il movimento del mouse pur consentendo al mouse di respirare. Stringere la manopola del sistema di ritenuta del naso. Monitora i movimenti del torace per assicurarti che l'animale stia respirando normalmente e ridurre al minimo il tempo che un topo trascorre nei freni.
3. Fare un'incisione superficiale (nick) nella vena della coda del topo che si muove liberamente e prelevare 25 μL di sangue dall'incisione in un capillare di vetro (riempiendo circa 1/3 del capillare) senza trattenere il topo. Soffiare rapidamente il sangue in un tubo di microcentrifuga.
4. Fermare l'emorragia usando polveri stiptiche, riempire il mangime nella gabbia e assicurarsi che i topi non mostrino segni di stress.
5. Completa il prelievo di sangue per tutti i topi.
6. Lasciare coagulare il sangue lasciandolo indisturbato a temperatura ambiente per 1 ora. Ruotare i campioni di sangue coagulato a 2.000 x g a 4 °C per 10 minuti in una microcentrifuga refrigerata da banco e trasferire il surnatante (siero) per l'analisi.
   NOTA: Il siero può essere conservato a -20 °C per diverse settimane fino all'analisi. Per la conservazione a lungo termine, mantenere il siero a -70 °C.
7. Analizzare ogni metabolita lipidico utilizzando il protocollo fornito dal produttore.

2. Test di tolleranza intralipide orale

1. Dopo le 17:00, pesare i topi per il calcolo del volume intralipidico da dare loro il giorno successivo. Quindi, trasferire i topi in una nuova gabbia e velocitarli durante la notte (16 ore).
2. La mattina dopo, segna le code dei topi alloggiati in una gabbia per aiutarli a identificarli nelle successive fasi di sanguinamento.
3. Fai un nick nella vena della coda e prendi 15 μL di sangue dall'incisione in un capillare di vetro (riempiendo circa 1/5 del capillare) e soffia rapidamente il sangue in un tubo microcentrifuga per T = 0 siero.
   NOTA: Non è necessario interrompere l'emorragia durante il test a meno che i topi non mostrino sanguinamento in eccesso.
4. Topi Gavage 20% intralipidi utilizzando un ago gavage 18G ad un rapporto di 15 μl per grammo di peso corporeo, utilizzando il peso corporeo pre-digiuno. Impila ogni mouse di 1 minuto.
   NOTA: Pesare l'animale e determinare la dimensione appropriata dell'ago del gavage. Generalmente, un ago gavage calibro 18 è appropriato per topi >25 g, e un ago gavage calibro 20-22 sarebbe più appropriato per gli animali più piccoli. Scruff il topo, afferrando la pelle sopra le spalle per tenere la testa dell'animale in posizione. Posizionare l'ago gavage in bocca e poi avanzare delicatamente lungo il palato superiore, fino a raggiungere l'esofago. Il tubo dovrebbe passare senza resistenza. Una volta raggiunta la giusta profondità, l'Intralipid può essere somministrato lentamente. Rimuovere delicatamente l'ago seguendo lo stesso angolo durante l'inserimento dell'ago dopo aver somministrato l'intralipide. Riportare l'animale nella gabbia e monitorare i segni di respiro affannoso o altro disagio.
   NOTA: I ricercatori che non sono esperti con tecniche di gavage orale o sanguinamento della coda possono impilare ogni topo di 2 minuti o anche di più.
5. Prelevare sangue a T = 1, 2, 3, 4, 5 e 6 ore: prelevare 15 μL di sangue (1/5 capillare) per topo attraverso il sanguinamento della coda e soffiare rapidamente il sangue in un tubo di microcentrifuga.
6. Ruotare i campioni di sangue a 2.000 x g a temperatura ambiente per 10 minuti in una microcentrifuga. Trasferire il surnatante, incluso lo strato di grasso galleggiante, in un tubo PCR per la conservazione. Il surnatante può essere conservato a -20 °C per diverse settimane fino all'analisi.
   NOTA: Il surnatante deve essere plasma. Se alcuni campioni si sono già coagulati al momento della centrifugazione, ciò non influisce sulla misurazione dei trigliceridi.
7. Dopo l'ultima raccolta di sangue, fermare l'emorragia usando polveri stiptiche, riempire il mangime nella gabbia e assicurarsi che i topi non mostrino segni di stress estremo.
8. Caricare 2 μL di trigliceridi standard e raccogliere supernatanti in una piastra a 96 pozzetti.
9. Aggiungere 200 μL di reagente trigliceridi e lasciare incubare la piastra per 5 minuti a 37 °C per lo sviluppo del colore.
10. Misurare l'assorbanza a 500 nm con una lunghezza d'onda di riferimento di 660 nm in un lettore di piastre da laboratorio e calcolare la concentrazione del campione.

3. β3 Agonista del recettore adrenergico CL 316,243 Test di lipolisi stimolata

1. Preparare CL 316.243 come soluzione stock da 5 mg/mL (50x) in soluzione salina sterile e conservare a -20°C fino all'uso.
2. Al mattino, pesare i topi per calcolare la quantità di soluzione diluita di CL 316.243 necessaria per l'esperimento. Il topo riceverà 10 μL per grammo di peso corporeo di CL 316.243 diluito, per una dose finale di 1 mg/kg di peso corporeo.
3. Trasferisci i topi in una nuova gabbia con libero accesso all'acqua e veloci per 4 ore.
4. Produrre abbastanza 1x CL 316,243 soluzione da 50x stock usando soluzione salina. La concentrazione finale di 1 soluzione di CL 316.243 è di 0,1 mg/ml. Utilizzare soluzione salina per il gruppo di trattamento di controllo.
5. Segna le code dei topi alloggiati nella stessa gabbia per una facile identificazione durante le fasi di sanguinamento.
6. Fai un nick nella vena della coda e prendi 15 μL di sangue dall'incisione in un capillare di vetro (riempiendo circa 1/5 del capillare) e soffia rapidamente il sangue in un tubo di microcentrifuga per T = 0 campione.
   NOTA: Non è necessario interrompere l'emorragia durante il test a meno che i topi non mostrino sanguinamento in eccesso.
7. Iniettare la soluzione diluita di CL 316,243 (o il controllo se incluso nell'esperimento) per via intraperitoneale ad un volume di 10 μL/g di peso corporeo. Impila ogni mouse di 1 minuto. Usa un massimo di 5 topi per ogni esperimento di 60 minuti o 10 topi per un team di due persone.
8. Prelevare sangue a T = 5, 15, 30, 60 minuti: prelevare 15 μL di sangue (1/5 capillare) per topo attraverso il sanguinamento della coda.
9. Dopo l'ultima raccolta di sangue, fermare l'emorragia usando polveri stiptiche, riempire il mangime nella gabbia e assicurarsi che i topi non mostrino segni di stress estremo.
10. Far girare i campioni di sangue a 2.000 x g a 4 °C per 5 minuti in una microcentrifuga refrigerata. Trasferire il surnatante in un tubo PCR per la conservazione. Il surnatante può essere conservato a -20°C per diverse settimane fino all'analisi.
11. Caricare 1 μL di 2x standard di glicerolo diluiti in serie (0,156, 0,312, 0,625, 1,25 e 2,5 mg / ml di concentrazioni equivalenti di trioleina) e sovranatanti raccolti in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 100 μL di reagente di glicerolo libero e lasciare incubare la piastra per 5 minuti a 37 °C affinché il colore si sviluppi.
12. Misurare l'assorbanza a 540 nm utilizzando un lettore di piastre da laboratorio e calcolare la concentrazione del campione.

Risultati

Mostriamo con tre estratti che ogni test offre preziose informazioni sul metabolismo lipidico dei topi. Per i topi maschi C57BL / 6J, sfidati da otto settimane di alimentazione con dieta ricca di grassi (HFD) a partire da otto settimane di età, i livelli di colesterolo totale erano significativamente elevati, mentre i trigliceridi sierici e neFA non lo erano (Tabella 1), suggerendo che trigliceridi e NEFA nel sangue non sono prevalentemente regolati da una sfida alimentare dei grassi. Nella seconda coor...

Discussione

I tre saggi descritti funzionano in modo robusto in laboratorio, con alcune considerazioni critiche. Il digiuno notturno è necessario per determinare i livelli di lipidi sierici a digiuno e il test di tolleranza intralipidica orale. Per il test di tolleranza intralipide orale, è fondamentale far girare il sangue a temperatura ambiente per ridurre al minimo la formazione di uno strato di grasso, specialmente nei punti temporali di 1 e 2 ore; è importante non scartare questo strato di grasso se si forma. Assicurarsi di ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
20% Intralipid	Sigma Aldrich	I141
BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml	Shaotong	B07F1KRMYN
CL 316,243 Hydrate	Sigma-Aldrich	C5976
Curved Feeding Needles (18 Gauge)	Kent Scientific	FNC-18-2-2
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma	G7793
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A	Fujifilm Wako Diagnostics	999-34691
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B	Fujifilm Wako Diagnostics	991-34891
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A	Fujifilm Wako Diagnostics	995-34791
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B	Fujifilm Wako Diagnostics	993-35191
Matrix Plus Chemistry Reference Kit	Verichem	9500
Micro Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-222-168
Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized	Fisher Scientific	22-362-574
NEFA STANDARD SOLUTION	Fujifilm Wako Diagnostics	276-76491
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
Thermo Scientific Triglycerides Reagent	Fisher Scientific	TR22421
Total Cholesterol Reagents	Thermo Scientifi	TR13421