Beurteilung der Ganzkörper-Lipid-Handling-Kapazität bei Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Papier bietet drei einfache und zugängliche Assays zur Beurteilung des Fettstoffwechsels bei Mäusen.

Zusammenfassung

Die Beurteilung des Fettstoffwechsels ist ein Eckpfeiler der Bewertung der Stoffwechselfunktion und wird als wesentlich für In-vivo-Stoffwechselstudien angesehen. Lipide sind eine Klasse von vielen verschiedenen Molekülen mit vielen Wegen, die an ihrer Synthese und ihrem Stoffwechsel beteiligt sind. Ein Ausgangspunkt für die Bewertung der Lipidmesmostase für die Ernährungs- und Adipositasforschung ist erforderlich. Dieses Papier beschreibt drei einfache und zugängliche Methoden, die wenig Fachwissen oder Übung erfordern und die von den meisten Labors angepasst werden können, um nach Fettstoffwechselanomalien bei Mäusen zu suchen. Diese Methoden sind (1) die Messung mehrerer Nüchternserumlipidmoleküle mit kommerziellen Kits, (2) die Bestimmung der diätetischen Lipidhandhabungsfähigkeit durch einen oralen Intralipidtoleranztest und (3) die Bewertung der Reaktion auf eine pharmazeutische Verbindung, CL 316.243, bei Mäusen. Zusammen werden diese Methoden einen Überblick über die Lipidhandhabungsfähigkeit bei Mäusen bieten.

Einleitung

Kohlenhydrate und Lipide sind zwei Hauptsubstrate für den Energiestoffwechsel. Der aberrante Fettstoffwechsel führt zu vielen menschlichen Krankheiten, einschließlich Typ-II-Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Fettlebererkrankungen und Krebs. Diätetische Lipide, hauptsächlich Triglyceride, werden durch den Darm in das Lymphsystem aufgenommen und gelangen in Chylomikronen in der Nähe des Herzens in den venösen Kreislauf¹. Lipide werden durch Lipoproteinpartikel im Blutkreislauf transportiert, wo die Fettsäuren durch die Wirkung der Lipoproteinlipase an peripheren Organen wie Muskel- und Fettgewebe freigesetzt werden². Die verbleibenden cholesterinreichen Restpartikel werden von der Leber^{beseitigt 3}. Mäuse wurden in Labors häufig als Forschungsmodell zur Untersuchung des Fettstoffwechsels verwendet. Mit umfassenden genetischen Toolsets und einem relativ kurzen Brutzyklus sind sie ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung, wie Lipide absorbiert, synthetisiert und metabolisiert werden.

Aufgrund der Komplexität des Fettstoffwechsels werden in der Regel ausgefeilte Lipidomik-Studien oder Isotopen-Tracer-Studien verwendet, um Sammlungen von Lipidspezies oder lipidbezogenen Stoffwechselflüssen und -schicksalen zu quantifizieren^4,5. Dies stellt Forscher ohne spezielle Ausrüstung oder Fachwissen vor eine große Herausforderung. In diesem Artikel stellen wir drei Assays vor, die als erste Tests dienen können, bevor technisch anspruchsvolle Techniken eingesetzt werden. Sie sind nicht-terminale Verfahren für die Mäuse und daher sehr nützlich, um mögliche Unterschiede in der Lipid-Handling-Kapazität zu identifizieren und die betroffenen Prozesse einzugrenzen.

Erstens kann die Messung von Nüchternserumlipidmolekülen helfen, das Gesamtlipidprofil einer Maus zu bestimmen. Mäuse sollten gefastet werden, da viele Lipidarten nach den Mahlzeiten aufsteigen und das Ausmaß des Anstiegs stark von der Zusammensetzung der Ernährung beeinflusst wird. Viele Lipidmoleküle, einschließlich Gesamtcholesterin, Triglycerid und nicht veresterte Fettsäure (NEFA), können mit einem kommerziellen Kit und einem Plattenleser gemessen werden, der die Absorption ablesen kann.

Zweitens bewertet ein oraler Intralipidtoleranztest die Fähigkeit zur Lipidhandhabung als Nettoeffekt von Absorption und Stoffwechsel. Ein oral verabreichtes Intralipid verursacht einen Anstieg der zirkulierenden Triglyceridspiegel (1-2 Stunden), wonach der Serumtriglyceridspiegel auf basale Werte (4-6 Stunden) zurückkehrt. Dieser Assay gibt Aufschluss darüber, wie gut eine Maus mit den exogenen Lipiden umgehen kann. Herz, Leber und braunes Fettgewebe sind aktive Konsumenten von Triglyceriden, während weißes Fettgewebe es als Energiereserve speichert. Änderungen in diesen Funktionen führen zu Unterschieden in den Testergebnissen.

Schließlich gilt die Förderung der Lipolyse zur Mobilisierung gespeicherter Lipide als eine mögliche Strategie zur Gewichtsabnahme. Der β3-adrenerge Rezeptorsignalweg im Fettgewebe spielt eine wichtige Rolle bei der Adipozytenlipolyse, und die Humangenetik hat einen Funktionsverlust-Polymorphismus Trp64Arg im β3-adrenergen Rezeptor identifiziert, der mit Fettleibigkeit korreliert⁶. CL 316,243, ein spezifischer und potenter β3-adrenerger Rezeptoragonist, stimuliert die Fettgewebslipolyse und die Freisetzung von Glycerin. Die Bewertung der Reaktion einer Maus auf CL 316.243 kann wertvolle Informationen über die Entwicklung, Verbesserung und das Verständnis der Wirksamkeit der Verbindung liefern.

Zusammen können diese Tests als Ersterbst für Veränderungen im Lipidstoffwechselzustand von Mäusen verwendet werden. Sie werden aufgrund der Zugänglichkeit der Instrumente und Reagenzien ausgewählt. Mit den Ergebnissen dieser Assays können sich Forscher ein Gesamtbild über die metabolische Fitness ihrer Tiere machen und sich für ausgefeiltere und gezieltere Ansätze entscheiden.

Protokoll

Die Tiere werden unter standardisierten Bedingungen nach Tierpflege- und Versuchsprotokollen untergebracht, die vom Institutional Animal Care and Use Committee des Baylor College of Medicine (BCM) genehmigt wurden. Die Tiere werden mit einer Standard- oder Spezialdiät gefüttert, Wasser ad libitum und mit einem 12-Stunden-Tag-Nacht-Zyklus gehalten.

1. Messung von Nüchternserumlipiden

1. Übertragen Sie mäuse nach 17 Uhr in einen neuen Käfig und schnell mit freiem Zugang zu Wasser, über Nacht (mit etwa 16 Stunden Fasten vor dem Experiment). Das Fasten über Nacht sorgt für eine vollständige Entleerung des Magen-Darm-Traktes der Mäuse.
   HINWEIS: Mäuse essen ihren Kot während des Fastens, so dass der Nahrungsentzug nicht sicherstellen kann, dass sie ausreichend gefastet werden.
2. Am nächsten Morgen fassen Sie die Maus am Schwanz und legen Sie sie auf eine Oberfläche. Ziehen Sie den Mausschwanz vorsichtig zurück, um die Maus in den Rückhalteer zu legen. Setzen Sie die Nasenrückhalteeinrichtung ein, um die Bewegung der Maus neu zu trainieren, während die Maus weiterhin atmen kann. Ziehen Sie den Knopf der Nasenrückhalteeinrichtung fest. Überwachen Sie brustbeenden Bewegungen, um sicherzustellen, dass das Tier normal atmet und minimieren Sie die Zeit, die eine Maus in Rückhaltemitteln verbringt.
3. Machen Sie einen oberflächlichen Schnitt (Nick) in der Schwanzvene der sich frei bewegenden Maus und ziehen Sie 25 μL Blut aus dem Schnitt in eine Glaskapillar (die etwa 1/3 der Kapillare füllt), ohne die Maus zurückzuhalten. Blasen Sie das Blut schnell in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
4. Stoppen Sie die Blutung mit Styptic-Pulvern, füllen Sie das Futter im Käfig auf und stellen Sie sicher, dass die Mäuse keine Anzeichen von Stress zeigen.
5. Vervollständigen Sie den Blutentzug für alle Mäuse.
6. Lassen Sie das Blut gerinnen, indem Sie es 1 Stunde lang ungestört bei Raumtemperatur lassen. Drehen Sie die geronnenen Blutproben bei 2.000 x g bei 4 °C für 10 Minuten in einer gekühlten Tischmikrozentrifuge und übertragen Sie den Überstand (Serum) zur Analyse.
   HINWEIS: Das Serum kann bis zur Analyse mehrere Wochen bei –20 °C gelagert werden. Zur Langzeitlagerung das Serum bei –70°C aufbewahren.
7. Analysieren Sie jeden Lipidmetaboliten mit dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll.

2. Oraler Intralipidtoleranztest

1. Nach 17 Uhr wiegen Sie die Mäuse für die Berechnung des Intralipidvolumens, das ihnen am nächsten Tag verabreicht werden soll. Dann die Mäuse in einen neuen Käfig bringen und sie über Nacht (16 Stunden) fasten.
2. Markieren Sie am nächsten Morgen die Schwänze der Mäuse, die in einem Käfig untergebracht sind, um sie in den nachfolgenden Blutungsschritten zu identifizieren.
3. Machen Sie einen Nick in der Schwanzvene und ziehen Sie 15 μL Blut aus dem Schnitt in eine Glaskapillar (die etwa 1/5 der Kapillare füllt) und blasen Sie das Blut schnell in ein Mikrozentrifugenröhrchen für T = 0 Serum.
   HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit, die Blutung während des Tests zu stoppen, es sei denn, die Mäuse zeigen übermäßige Blutungen.
4. Gavage Mäuse 20% Intralipid mit einer 18G Gavage Nadel in einem Verhältnis von 15 μl pro Gramm Körpergewicht, unter Verwendung des Körpergewichts vor dem Fasten. Stapeln Sie jede Maus um 1 Minute.
   HINWEIS: Wiegen Sie das Tier und bestimmen Sie die geeignete Nadelgröße. Im Allgemeinen ist eine 18-Gauge-Gavage-Nadel für Mäuse >25 g geeignet, und eine 20-22 Gauge-Gavage-Nadel wäre für kleinere Tiere besser geeignet. Schuppen Sie die Maus und greifen Sie die Haut über die Schultern, um den Kopf des Tieres an Ort und Stelle zu halten. Legen Sie die Nadel in den Mund und bewegen Sie sich dann vorsichtig am oberen Gaumen entlang, bis die Speiseröhre erreicht ist. Das Rohr sollte widerstandslos passieren. Sobald die richtige Tiefe erreicht ist, kann das Intralipid langsam verabreicht werden. Entfernen Sie die Nadel vorsichtig im gleichen Winkel während des Einführens der Nadel nach der Verwaltung des Intralipids. Bringen Sie das Tier in den Käfig zurück und überwachen Sie auf Anzeichen von Atemnot oder anderer Belastung.
   HINWEIS: Forscher, die mit oralen Gavage- oder Schwanzblutungstechniken unerfahren sind, können jede Maus um 2 Minuten oder sogar länger stapeln.
5. Blut bei T = 1, 2, 3, 4, 5 und 6 Stunden ziehen: Ziehen Sie 15 μL Blut (1/5 Kapillare) pro Maus durch Schwanzblutungen und blasen Sie das Blut schnell in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
6. Drehen Sie die Blutproben bei 2.000 x g bei Raumtemperatur für 10 Minuten in einer Mikrozentrifuge. Den Überstand, einschließlich der schwimmenden Fettschicht, zur Lagerung in ein PCR-Röhrchen geben. Der Überstand kann bis zur Analyse mehrere Wochen bei –20 °C gelagert werden.
   HINWEIS: Der Überstand sollte Plasma sein. Wenn einige Proben zum Zeitpunkt der Zentrifugation bereits gerinnt haben, hat dies keinen Einfluss auf die Triglyceridmessung.
7. Stoppen Sie nach der letzten Blutentnahme die Blutung mit stypischen Pulvern, füllen Sie das Futter im Käfig auf und stellen Sie sicher, dass die Mäuse keine Anzeichen von extremem Stress zeigen.
8. Laden Sie 2 μL Triglyceridstandard und gesammelte Überstände in eine 96-Well-Platte.
9. Fügen Sie 200 μL Triglyceridreagenz hinzu und lassen Sie die Platte für 5 Minuten bei 37 °C zur Farbentwicklung inkubieren.
10. Messen Sie die Absorption bei 500 nm mit einer Referenzwellenlänge von 660 nm in einem Laborplattenleser und berechnen Sie die Konzentration der Probe.

3. β3 Adrenerger Rezeptoragonist CL 316.243 Stimulierter Lipolyse-Assay

1. CL 316.243 als Stammlösung von 5 mg/ml (50x) in steriler Kochsalzlösung zubereiten und bis zur Verwendung bei –20 °C lagern.
2. Wiegen Sie morgens die Mäuse, um die Menge an verdünnter CL 316.243-Lösung zu berechnen, die für das Experiment benötigt wird. Die Maus erhält 10 μL pro Gramm Körpergewicht von verdünntem CL 316.243 für eine Enddosis von 1 mg/kg Körpergewicht.
3. Bringen Sie die Mäuse in einen neuen Käfig mit freiem Zugang zu Wasser und fasten Sie sie für 4 Stunden.
4. Machen Sie genug 1x CL 316.243 Lösung aus 50x Vorrat mit Kochsalzlösung. Die Endkonzentration von 1x CL 316.243 Lösung beträgt 0,1 mg/ml. Verwenden Sie Kochsalzlösung für die Kontrollbehandlungsgruppe.
5. Markieren Sie die Schwänze der Mäuse, die im selben Käfig untergebracht sind, um sie während der Blutungsschritte leicht zu identifizieren.
6. Machen Sie einen Nick in der Schwanzvene und ziehen Sie 15 μL Blut aus dem Schnitt in eine Glaskapillar (die etwa 1/5 der Kapillare füllt) und blasen Sie das Blut schnell in ein Mikrozentrifugenröhrchen für T = 0 Probe.
   HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit, die Blutung während des Tests zu stoppen, es sei denn, die Mäuse zeigen übermäßige Blutungen.
7. Injiziert verdünnte CL 316.243-Lösung (oder Kontrolle, falls im Experiment enthalten) intraperitoneal bei einem Volumen von 10 μL/g Körpergewicht. Stapeln Sie jede Maus um 1 Minute. Verwenden Sie maximal 5 Mäuse für jedes 60-minütige Experiment oder 10 Mäuse für ein Zwei-Personen-Team.
8. Blutentnahme bei T = 5, 15, 30, 60 Minuten: Entnahme von 15 μL Blut (1/5 Kapillare) pro Maus durch Schwanzblutung.
9. Stoppen Sie nach der letzten Blutentnahme die Blutung mit stypischen Pulvern, füllen Sie das Futter im Käfig auf und stellen Sie sicher, dass die Mäuse keine Anzeichen von extremem Stress zeigen.
10. Blutproben bei 2.000 x g bei 4 °C für 5 Minuten in einer gekühlten Mikrozentrifuge drehen. Übertragen Sie den Überstand zur Lagerung in eine PCR-Röhre. Der Überstand kann bis zur Analyse mehrere Wochen bei –20°C gelagert werden.
11. Laden Sie 1 μL mit 2x seriell verdünnten Glycerinstandards (0,156, 0,312, 0,625, 1,25 und 2,5 mg/ml Trioleine-Äquivalentkonzentrationen) und gesammelten Überständen in eine 96-Well-Platte. Fügen Sie 100 μL freies Glycerinreagenz hinzu und lassen Sie die Platte 5 Minuten bei 37 °C inkubieren, damit sich die Farbe entwickeln kann.
12. Messen Sie die Absorption bei 540 nm mit einem Laborplattenleser und berechnen Sie die Konzentration der Probe.

Ergebnisse

Wir zeigen mit drei Ausschnitten, dass jeder Assay wertvolle Informationen über den Fettstoffwechsel der Mäuse bietet. Bei männlichen C57BL/6J-Mäusen, die durch acht Wochen fettreiche Ernährung (HFD) ab einem Alter von acht Wochen herausgefordert wurden, war der Gesamtcholesterinspiegel signifikant erhöht, während Serumtriglyycerid und NEFA nicht waren (Tabelle 1), was darauf hindeutet, dass Triglycerid und NEFA im Blut nicht überwiegend durch eine diätetische Fettherausforderung reguliert werde...

Diskussion

Die drei beschriebenen Assays funktionieren robust im Labor, mit einigen kritischen Überlegungen. Das Fasten über Nacht ist für die Bestimmung des Nüchternserumlipidspiegels und des oralen Intralipidtoleranztests erforderlich. Für den oralen Intralipidtoleranztest ist es wichtig, das Blut bei Raumtemperatur zu drehen, um die Bildung einer Fettschicht zu minimieren, insbesondere an den 1- und 2-Stunden-Zeitpunkten; Es ist wichtig, diese Fettschicht nicht zu verwerfen, wenn sie sich bildet. Stellen Sie sicher, dass Si...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
20% Intralipid	Sigma Aldrich	I141
BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml	Shaotong	B07F1KRMYN
CL 316,243 Hydrate	Sigma-Aldrich	C5976
Curved Feeding Needles (18 Gauge)	Kent Scientific	FNC-18-2-2
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma	G7793
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A	Fujifilm Wako Diagnostics	999-34691
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B	Fujifilm Wako Diagnostics	991-34891
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A	Fujifilm Wako Diagnostics	995-34791
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B	Fujifilm Wako Diagnostics	993-35191
Matrix Plus Chemistry Reference Kit	Verichem	9500
Micro Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-222-168
Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized	Fisher Scientific	22-362-574
NEFA STANDARD SOLUTION	Fujifilm Wako Diagnostics	276-76491
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
Thermo Scientific Triglycerides Reagent	Fisher Scientific	TR22421
Total Cholesterol Reagents	Thermo Scientifi	TR13421