JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье представлены три простых и доступных анализа для оценки липидного обмена у мышей.

Аннотация

Оценка липидного обмена является краеугольным камнем оценки метаболической функции и считается важной для исследований метаболизма in vivo. Липиды представляют собой класс множества различных молекул со многими путями, участвующими в их синтезе и метаболизме. Необходима отправная точка для оценки липидного гемостаза для исследований в области питания и ожирения. В этой статье описываются три простых и доступных метода, которые требуют небольшого опыта или практики для освоения, и которые могут быть адаптированы большинством лабораторий для скрининга аномалий липидного обмена у мышей. Эти методы заключаются в (1) измерении нескольких молекул липидов сыворотки натощая время с использованием коммерческих наборов (2) анализе на способность к обработке липидов с пищей с помощью перорального теста на интралипидную толерантность и (3) оценке ответа на фармацевтическое соединение CL 316,243 у мышей. Вместе эти методы обеспечат высокоуровневый обзор возможностей обработки липидов у мышей.

Введение

Углеводы и липиды являются двумя основными субстратами для энергетического обмена. Аберрантный липидный обмен приводит к многим заболеваниям человека, включая диабет II типа, сердечно-сосудистые заболевания, жировые заболевания печени и рак. Диетические липиды, в основном триглицериды, всасываются через кишечник в лимфатическую систему и попадают в венозное кровообращение в хиломикронах вблизисердца1. Липиды переносятся липопротеиновыми частицами в кровотоке, где части жирных кислот высвобождаются под действием липопротеинлипазы на периферические органы, такие как мышцы и жироваяткань 2. Оставшиеся богатые холестерином остаточные частицы очищаются печенью3. Мыши широко использовались в лабораториях в качестве исследовательской модели для изучения липидного обмена. С доступными комплексными наборами генетических инструментов и относительно коротким циклом размножения, они являются мощной моделью для изучения того, как липиды поглощаются, синтезируются и метаболизируются.

Из-за сложности липидного обмена сложные исследования липидомики или изотопные индикаторные исследования обычно используются для количественной оценки коллекций липидных видов или связанных с липидами метаболических потоков и судеб4,5. Это создает огромную проблему для исследователей без специализированного оборудования или опыта. В этой статье мы представляем три анализа, которые могут служить начальными тестами перед использованием технически сложных методов. Они являются неконцевальными процедурами для мышей и, таким образом, очень полезны для выявления потенциальных различий в способности к обработке липидов и сужения затронутых процессов.

Во-первых, измерение молекул липидов сыворотки натощая может помочь определить общий липидный профиль мыши. Мышей следует голодать, потому что многие виды липидов поднимаются после еды, а на степень повышения сильно влияет состав рациона. Многие молекулы липидов, включая общий холестерин, триглицериды и неэтерифицированные жирные кислоты (NEFA), можно измерить с помощью коммерческого набора и считывателя пластин, который может считывать поглощение.

Во-вторых, пероральный тест на интралипидную толерантность оценивает способность обращаться с липидами как чистый эффект абсорбции и метаболизма. Перорально вводимый интралипид вызывает всплеск циркулирующих уровней триглицеридов (1-2 часа), после чего уровни триглицеридов в сыворотке крови возвращаются к базальным уровням (4-6 часов). Этот анализ дает информацию о том, насколько хорошо мышь может справляться с экзогенными липидами. Сердце, печень и коричневая жировая ткань являются активными потребителями триглицеридов, тогда как белая жировая ткань хранит ее в качестве энергетического резерва. Изменения в этих функциях приведут к различиям в результатах теста.

Наконец, содействие липолизу для мобилизации накопленных липидов считается возможной стратегией потери веса. Сигнальный путь β3-адренорецепторов в жировой ткани играет важную роль в липолизе адипоцитов, и генетика человека идентифицировала полиморфизм потери функции Trp64Arg в β3-адренергическом рецепторе, коррелируемом с ожирением6. CL 316,243, специфический и мощный агонист β3-адренергических рецепторов, стимулирует липолиз жировой ткани и высвобождение глицерина. Оценка реакции мыши на CL 316,243 может предоставить ценную информацию о разработке, улучшении и понимании эффективности соединения.

В совокупности эти тесты могут быть использованы в качестве начального скрининга для изменений в липидном метаболическом состоянии мышей. Они выбираются по доступности инструментов и реагентов. С помощью результатов, полученных из этих анализов, исследователи могут сформировать общую картину метаболической пригодности своих животных и принять решение о более сложных и целенаправленных подходах.

протокол

Животные размещаются в стандартизированных условиях в соответствии с протоколами ухода за животными и экспериментальными протоколами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского колледжа Бейлора (BCM). Животных кормят стандартной или специальной диетой, воды ad libitum и содержат с 12-часовым циклом день/ночь.

1. Измерение липидов сыворотки натощая

  1. Перенесите мышей в новую клетку после 5 часов вечера и быстро со свободным доступом к воде, на ночь (с примерно 16 часами голодания до эксперимента). Ночное голодание обеспечивает полное опорожнение желудочно-кишечного тракта мышей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши едят свои фекалии во время голодания, поэтому отказ от пищи не может гарантировать, что они адекватно голодают.
  2. На следующее утро схватите мышь за хвост и положите ее на поверхность. Осторожно отведите назад хвост мыши, чтобы поместить мышь в ограничительную часть. Поместите носовое удерживающее устройство, чтобы переобучить движение мыши, в то же время позволяя мыши дышать. Затяните ручку носа. Следите за движениями груди, чтобы убедиться, что животное дышит нормально, и сведите к минимуму время, которое мышь проводит в ограничителях.
  3. Сделайте поверхностный разрез (ник) в хвостовой вене свободно движущейся мыши, и вытяните 25 мкл крови из разреза в стеклянный капилляр (заполняя около 1/3 капилляра), не удерживая мышь. Быстро вдуть кровь в микроцентрифужную трубку.
  4. Остановите кровотечение с помощью кровоостановительных порошков, пополняйте корм в клетке и убедитесь, что мыши не проявляют признаков стресса.
  5. Полный забор крови у всех мышей.
  6. Дайте крови сгуститься, оставив ее ненарушенным при комнатной температуре в течение 1 часа. Раскрутите образцы свернувшой крови при 2000 х г при 4 °C в течение 10 минут в охлажденном настольного микроцентрифуге и перенесите супернатант (сыворотку) для анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка может храниться при -20 °C в течение нескольких недель до анализа. Для длительного хранения держите сыворотку при –70°C.
  7. Анализируйте каждый метаболит липидов с использованием протокола, предоставленного производителем.

2. Пероральный тест на интралипидную толерантность

  1. После 5 часов вечера взвесьте мышей для расчета внутрилипидного объема, который будет дан им на следующий день. Затем переведите мышей в новую клетку и погружайте их в течение ночи (16 часов).
  2. На следующее утро отметьте хвосты мышей, размещенных в одной клетке, чтобы помочь идентифицировать их на последующих этапах кровотечения.
  3. Сделайте кольцу в хвостовой вене и вытяните 15 мкл крови из разреза в стеклянный капилляр (заполняя около 1/5 капилляра), и быстро вдуйте кровь в микроцентрифужную трубку для T = 0 сыворотки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости останавливать кровотечение во время анализа, если у мышей не наблюдается избыточное кровотечение.
  4. Мышей Gavage 20% интралипида с использованием иглы 18G gavage в соотношении 15 мкл на грамм массы тела, используя вес тела до голодания. Укладывая каждую мышь на 1 минуту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Взвесьте животное и определите подходящий размер иглы. Как правило, игла 18 калибра подходит для мышей >25 г, а игла 20-22 калибра будет более подходящей для мелких животных. Похватите мышь, схвня кожу за плечи, чтобы удержать голову животного на месте. Поместите иглу в рот, а затем осторожно продляйте вдоль верхнего неба, пока пищевод не будет достигнут. Трубка должна проходить без сопротивления. Как только достигается надлежащая глубина, Интралипид можно медленно вводить. Осторожно удалите иглу под тем же углом во время введения иглы после введения Интралипида. Верните животное в клетку и следите за признаками затрудненного дыхания или другого дистресса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователи, которые неопытны в методах орального кровотечения или кровотечения хвоста, могут сложить каждую мышь на 2 минуты или даже дольше.
  5. Забор крови при T = 1, 2, 3, 4, 5 и 6 часов: Вытягивайте 15 мкл крови (1/5 капилляра) на мышь через хвостовое кровотечение и быстро вдувайте кровь в микроцентрифужную трубку.
  6. Раскрутите образцы крови при 2000 х г при комнатной температуре в течение 10 минут в микроцентрифуге. Перенесите супернатант, включая плавающий жировой слой, в ПЦР-трубку для хранения. Супернатант может храниться при –20 °C в течение нескольких недель до анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант должен быть плазменным. Если некоторые образцы уже свернули к моменту центрифугирования, это не влияет на измерение триглицеридов.
  7. После последнего забора крови остановите кровотечение с помощью кровоостанавливающих порошков, пополняйте корм в клетке и убедитесь, что мыши не проявляют признаков экстремального стресса.
  8. Загрузите 2 мкл стандартного триглицерида и собранных супернатантов в 96-луночную пластину.
  9. Добавьте 200 мкл триглицеридного реагента и дайте пластине инкубироваться в течение 5 минут при 37 °C для развития цвета.
  10. Измерьте поглощение при 500 нм с опорной длиной волны 660 нм в лабораторном считывателе пластин и рассчитайте концентрацию образца.

3. Агонист адренергических рецепторов β3 CL 316,243 Стимулированный анализ липолиза

  1. Готовят CL 316,243 в виде бульонного раствора 5 мг/мл (50x) в стерильном физиологическом растворе и хранят при –20°C до использования.
  2. Утром взвесьте мышей, чтобы рассчитать количество разбавленного раствора CL 316 243, необходимого для эксперимента. Мышь будет получать 10 мкл на грамм массы тела разбавленного CL 316 243 для конечной дозы 1 мг/кг массы тела.
  3. Перенесите мышей в новую клетку со свободным доступом к воде, и постите их в течение 4 часов.
  4. Сделайте достаточное количество 1x CL 316,243 раствора из 50x запаса, используя физиологический раствор. Конечная концентрация 1x раствора CL 316,243 составляет 0,1 мг/мл. Используйте физиологический раствор для контрольной группы лечения.
  5. Отметьте хвосты мышей, размещенных в одной клетке, для легкой идентификации во время этапов кровотечения.
  6. Сделайте кольцу в хвостовой вене, и вытяните 15 мкл крови из разреза в стеклянный капилляр (заполняя около 1/5 капилляра), и быстро вдуйте кровь в микроцентрифужную трубку для образца T = 0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости останавливать кровотечение во время анализа, если у мышей не наблюдается избыточное кровотечение.
  7. Вводить разбавленный раствор CL 316,243 (или контрольный, если включен в эксперимент) внутрибрюшинно в объеме 10 мкл/г массы тела. Укладывая каждую мышь на 1 минуту. Используйте максимум 5 мышей для каждого 60-минутного эксперимента или 10 мышей для команды из двух человек.
  8. Забор крови при T = 5, 15, 30, 60 минут: забор 15 мкл крови (1/5 капилляра) на мышь через хвостовое кровотечение.
  9. После последнего забора крови остановите кровотечение с помощью кровоостанавливающих порошков, пополняйте корм в клетке и убедитесь, что мыши не проявляют признаков экстремального стресса.
  10. Спиновые образцы крови при 2000 х г при 4 °C в течение 5 минут в охлажденном микроцентрифуге. Переложите супернатант в трубку ПЦР для хранения. Супернатант можно хранить при –20°C в течение нескольких недель до анализа.
  11. Нагрузляли 1 мкл 2-кратно последовательно разбавленными эталонами глицерина (0,156, 0,312, 0,625, 1,25 и 2,5 мг/мл эквивалента триолеина концентрациями) и собирали супернатанты в 96-луночную пластину. Добавьте 100 мкл свободного глицеринового реагента и дайте пластине инкубироваться в течение 5 минут при 37 °C для развития цвета.
  12. Измерьте поглощение при 540 нм с помощью лабораторного считывателя пластин и рассчитайте концентрацию образца.

Результаты

Мы показываем тремя выдержками, что каждый анализ предлагает ценную информацию о липидной информации мышей. Для самцов мышей C57BL/6J, которым бросили вызов восемь недель кормления с высоким содержанием жиров (HFD), начиная с восьминедельного возраста, общий уровень холестерина был значите?...

Обсуждение

Три описанных анализа надежно функционируют в лаборатории, с несколькими критическими соображениями. Ночное голодание требуется для определения уровня липидов в сыворотке натощите и перорального теста на интралипидную толерантность. Для перорального теста на интралипидную толеран?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа поддерживается Национальными институтами здравоохранения (NIH), грантом R00-DK114498 и Министерством сельского хозяйства США (USDA), грант CRIS: 3092-51000-062 для Y. Z.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
20% IntralipidSigma AldrichI141
BD Slip Tip Sterile Syringes 1mlShaotongB07F1KRMYN
CL 316,243 HydrateSigma-AldrichC5976
Curved Feeding Needles (18 Gauge)Kent ScientificFNC-18-2-2
Free Glycerol ReagentSigma AldrichF6428
Glycerol Standard SolutionSigmaG7793
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT AFujifilm Wako Diagnostics999-34691
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT BFujifilm Wako Diagnostics991-34891
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT AFujifilm Wako Diagnostics995-34791
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT BFujifilm Wako Diagnostics993-35191
Matrix Plus Chemistry Reference KitVerichem9500
Micro Centrifuge TubesFisher Scientific14-222-168
Microhematrocrit Capillary Tube, Not HeparanizedFisher Scientific22-362-574
NEFA STANDARD SOLUTIONFujifilm Wako Diagnostics276-76491
Phosphate Buffered SalineBoston BioproductsBM-220
Thermo Scientific Triglycerides ReagentFisher ScientificTR22421
Total Cholesterol ReagentsThermo ScientifiTR13421

Ссылки

  1. Dixon, J. B. Mechanisms of chylomicron uptake into lacteals. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, 52-57 (2010).
  2. Nuno, J., de Oya, M. Lipoprotein lipase: review. Revista Clínica Española. 170 (3-4), 83-87 (1983).
  3. Williams, K. J. Molecular processes that handle -- and mishandle -- dietary lipids. Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3247-3259 (2008).
  4. Burla, B., et al. MS-based lipidomics of human blood plasma: a community-initiated position paper to develop accepted guidelines. Journal of Lipid Research. 59 (10), 2001-2017 (2018).
  5. Umpleby, A. M. Hormone measurement guidelines: Tracing lipid metabolism: the value of stable isotopes. Journal of Endocrinology. 226 (3), 1-10 (2015).
  6. Mitchell, B. D., et al. A paired sibling analysis of the beta-3 adrenergic receptor and obesity in Mexican Americans. Journal of Clinical Investigation. 101 (3), 584-587 (1998).
  7. Mahoney, L. B., Denny, C. A., Seyfried, T. N. Caloric restriction in C57BL/6J mice mimics therapeutic fasting in humans. Lipids in Health and Disease. 5, 13 (2006).
  8. Hayek, T., et al. Dietary fat increases high density lipoprotein (HDL) levels both by increasing the transport rates and decreasing the fractional catabolic rates of HDL cholesterol ester and apolipoprotein (Apo) A-I. Presentation of a new animal model and mechanistic studies in human Apo A-I transgenic and control mice. Journal of Clinical Investigation. 91 (4), 1665-1671 (1993).
  9. Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comparative Biochemistry and Physiology - Part B: Biochemistry & Molecular Biology. 135 (2), 219-229 (2003).
  10. Tall, A. R. Functions of cholesterol ester transfer protein and relationship to coronary artery disease risk. Journal of Clinical Lipidology. 4 (5), 389-393 (2010).
  11. Singh, A. K., Singh, R. Triglyceride and cardiovascular risk: A critical appraisal. Indian Journal of Endocrinology and Metabolism. 20 (4), 418-428 (2016).
  12. Miller, M., et al. Triglycerides and cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (20), 2292-2333 (2011).
  13. Dron, J. S., Hegele, R. A. Genetics of Hypertriglyceridemia. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 11, 455 (2020).
  14. Dole, V. P. A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose. Journal of Clinical Investigation. 35 (2), 150-154 (1956).
  15. Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nature Medicine. 17 (2), 200-205 (2011).
  16. de Souza, C. J., Burkey, B. F. Beta 3-adrenoceptor agonists as anti-diabetic and anti-obesity drugs in humans. Current Pharmaceutical Design. 7 (14), 1433-1449 (2001).
  17. Braun, K., Oeckl, J., Westermeier, J., Li, Y., Klingenspor, M. Non-adrenergic control of lipolysis and thermogenesis in adipose tissues. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1653

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены