Evaluación de la capacidad de manejo de lípidos de todo el cuerpo en ratones

Resumen

Este documento proporciona tres ensayos fáciles y accesibles para evaluar el metabolismo de los lípidos en ratones.

Resumen

La evaluación del metabolismo lipídico es una piedra angular de la evaluación de la función metabólica, y se considera esencial para los estudios de metabolismo in vivo. Los lípidos son una clase de muchas moléculas diferentes con muchas vías involucradas en su síntesis y metabolismo. Se necesita un punto de partida para evaluar la hemostasia lipídica para la investigación de la nutrición y la obesidad. Este artículo describe tres métodos fáciles y accesibles que requieren poca experiencia o práctica para dominar, y que pueden ser adaptados por la mayoría de los laboratorios para detectar anomalías en el metabolismo de los lípidos en ratones. Estos métodos son (1) medir varias moléculas de lípidos séricos en ayunas utilizando kits comerciales (2) evaluar la capacidad de manejo de lípidos en la dieta a través de una prueba de tolerancia intralipídica oral, y (3) evaluar la respuesta a un compuesto farmacéutico, CL 316,243, en ratones. Juntos, estos métodos proporcionarán una visión general de alto nivel de la capacidad de manejo de lípidos en ratones.

Introducción

Los carbohidratos y los lípidos son dos sustratos principales para el metabolismo energético. El metabolismo aberrante de los lípidos resulta en muchas enfermedades humanas, incluida la diabetes tipo II, las enfermedades cardiovasculares, las enfermedades del hígado graso y los cánceres. Los lípidos dietéticos, principalmente los triglicéridos, se absorben a través del intestino hacia el sistema linfático y entran en la circulación venosa en los quilomicrones cerca del corazón¹. Los lípidos son transportados por partículas de lipoproteínas en el torrente sanguíneo, donde las partes de ácidos grasos son liberadas por la acción de la lipoproteína lipasa en órganos periféricos como el músculo y el tejido adiposo². Las partículas remanentes restantes ricas en colesterol son eliminadas por el hígado³. Los ratones han sido ampliamente utilizados en laboratorios como modelo de investigación para estudiar el metabolismo de los lípidos. Con conjuntos de herramientas genéticas completas disponibles y un ciclo de reproducción relativamente corto, son un modelo poderoso para estudiar cómo se absorben, sintetizan y metabolizan los lípidos.

Debido a la complejidad del metabolismo de los lípidos, los sofisticados estudios de lipidómica o los estudios de trazadores isotópicos se utilizan generalmente para cuantificar colecciones de especies lipídicas o flujos y destinos metabólicos relacionados con los lípidos^4,5. Esto crea un desafío masivo para los investigadores sin equipo especializado o experiencia. En este artículo, presentamos tres ensayos que pueden servir como pruebas iniciales antes de que se utilicen técnicas técnicamente desafiantes. Son procedimientos no terminales para los ratones y, por lo tanto, muy útiles para identificar diferencias potenciales en la capacidad de manejo de lípidos y reducir los procesos afectados.

En primer lugar, medir las moléculas de lípidos séricos en ayunas puede ayudar a determinar el perfil lipídico general de un ratón. Los ratones deben ayunar, porque muchas especies de lípidos aumentan después de las comidas, y el alcance del aumento se ve fuertemente afectado por la composición de la dieta. Muchas moléculas de lípidos, incluyendo el colesterol total, los triglicéridos y los ácidos grasos no esterificados (NEFA), se pueden medir utilizando un kit comercial y un lector de placas que puede leer la absorbancia.

En segundo lugar, una prueba de tolerancia intralipídica oral evalúa la capacidad de manejo de lípidos como un efecto neto de la absorción y el metabolismo. Un intralípido administrado por vía oral causa un aumento en los niveles circulantes de triglicéridos (1-2 horas), después de lo cual los niveles séricos de triglicéridos vuelven a los niveles basales (4-6 horas). Este ensayo ofrece información sobre qué tan bien un ratón puede manejar los lípidos exógenos. El corazón, el hígado y el tejido adiposo marrón son consumidores activos de triglicéridos, mientras que el tejido adiposo blanco lo almacena como una reserva de energía. Los cambios en estas funciones darán lugar a diferencias en los resultados de las pruebas.

Por último, promover la lipólisis para movilizar los lípidos almacenados se considera una posible estrategia para la pérdida de peso. La vía de señalización del receptor β3-adrenérgico en el tejido adiposo juega un papel importante en la lipólisis de adipocitos, y la genética humana ha identificado un polimorfismo de pérdida de función Trp64Arg en el receptor β3-adrenérgico correlacionado con la obesidad⁶. CL 316,243, un agonista específico y potente del receptor β3-adrenérgico, estimula la lipólisis del tejido adiposo y la liberación de glicerol. La evaluación de la respuesta de un ratón a CL 316,243 puede proporcionar información valiosa sobre el desarrollo, la mejora y la comprensión de la eficacia del compuesto.

Colectivamente, estas pruebas se pueden utilizar como una prueba inicial para detectar cambios en el estado metabólico lipídico de los ratones. Se eligen por la accesibilidad de los instrumentos y reactivos. Con los resultados derivados de estos ensayos, los investigadores pueden formar una imagen general de la aptitud metabólica de sus animales y decidir sobre enfoques más sofisticados y específicos.

Protocolo

Los animales se alojan en condiciones estandarizadas siguiendo protocolos experimentales y de cuidado animal aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Baylor College of Medicine (BCM). Los animales son alimentados con una dieta estándar o especial, agua ad libitum, y mantenidos con un ciclo día/noche de 12 horas.

1. Medición de lípidos séricos en ayunas

1. Transfiera los ratones a una nueva jaula después de las 5 PM y rápido con acceso gratuito al agua, durante la noche (con alrededor de 16 horas de ayuno antes del experimento). El ayuno nocturno asegura el vaciado completo de los tractos gastrointestinales de los ratones.
   NOTA: Los ratones comen sus heces durante el ayuno, por lo que la abstinencia de alimentos no puede garantizar que estén adecuadamente ayunados.
2. A la mañana siguiente, agarre el ratón por la cola y colóquelo en una superficie. Tire suavemente hacia atrás en la cola del ratón para colocar el ratón en el reteneddor. Coloque la sujeción nasal para volver a entrenar el movimiento del ratón mientras permite que el ratón respire. Apriete la perilla de la sujeción de la nariz. Controle los movimientos del pecho para asegurarse de que el animal esté respirando normalmente y minimizar el tiempo que un ratón pasa en los sujetadores.
3. Haga una incisión superficial (nick) en la vena de la cola del ratón que se mueve libremente y extraiga 25 μL de sangre de la incisión en un capilar de vidrio (llenando aproximadamente 1/3 del capilar) sin restringir al ratón. Sople rápidamente la sangre en un tubo de microcentrífuga.
4. Detenga el sangrado con polvos estípticos, vuelva a llenar el alimento en la jaula y asegúrese de que los ratones no muestren signos de estrés.
5. Complete la extracción de sangre para todos los ratones.
6. Deje que la sangre coagule dejándola sin perturbar a temperatura ambiente durante 1 hora. Girar las muestras de sangre coaguladas a 2.000 x g a 4 °C durante 10 minutos en una microcentrífuga de sobremesa refrigerada y transferir sobrenadante (suero) para su análisis.
   NOTA: El suero se puede almacenar a –20 °C durante varias semanas hasta el análisis. Para el almacenamiento a largo plazo, mantenga el suero a –70 ° C.
7. Analice cada metabolito lipídico utilizando el protocolo proporcionado por el fabricante.

2. Prueba de tolerancia intralipídica oral

1. Después de las 5 PM, pese a los ratones para el cálculo del volumen intralípido que se les administrará al día siguiente. Luego, transfiera los ratones a una nueva jaula y ayunarlos durante la noche (16 horas).
2. A la mañana siguiente, marque las colas de los ratones alojados en una jaula para ayudar a identificarlos en los pasos de sangrado posteriores.
3. Haga un corte en la vena de la cola y extraiga 15 μL de sangre de la incisión en un capilar de vidrio (llenando aproximadamente 1/5 del capilar), y sople rápidamente la sangre en un tubo de microcentrífuga para T = 0 suero.
   NOTA: No hay necesidad de detener el sangrado durante el ensayo a menos que los ratones muestren sangrado excesivo.
4. Ratones de gavage 20% intralipídicos usando una aguja de gavage 18G en una proporción de 15 μl por gramo de peso corporal, utilizando el peso corporal previo al ayuno. Apila cada ratón en 1 minuto.
   NOTA: Pese al animal y determine el tamaño apropiado de la aguja de sonda. En general, una aguja de sonda de calibre 18 es apropiada para ratones >25 g, y una aguja de sonda de calibre 20-22 sería más apropiada para animales más pequeños. Desaliña el ratón, agarrando la piel sobre los hombros para mantener la cabeza del animal en su lugar. Coloque la aguja de sonda en la boca y luego avance suavemente a lo largo del paladar superior, hasta que se alcance el esófago. El tubo debe pasar sin resistencia. Una vez que se alcanza la profundidad adecuada, el Intralipid se puede administrar lentamente. Retire suavemente la aguja siguiendo el mismo ángulo durante la inserción de la aguja después de administrar el Intralipid. Devuelva al animal a la jaula y controle si hay signos de dificultad para respirar u otra angustia.
   NOTA: Los investigadores que no tienen experiencia con técnicas de sonda oral o sangrado de la cola pueden apilar cada ratón por 2 minutos o incluso más.
5. Extraer sangre a T = 1, 2, 3, 4, 5 y 6 horas: Extraer 15 μL de sangre (1/5 capilar) por ratón a través del sangrado de la cola, y soplar rápidamente la sangre en un tubo de microcentrífuga.
6. Gire las muestras de sangre a 2.000 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos en una microcentrífuga. Transfiera el sobrenadante, incluida la capa de grasa flotante, a un tubo de PCR para su almacenamiento. El sobrenadante puede almacenarse a –20 °C durante varias semanas hasta el análisis.
   NOTA: El sobrenadante debe ser plasma. Si algunas muestras ya se han coagulado en el momento de la centrifugación, no afecta la medición de triglicéridos.
7. Después de la última recolección de sangre, detenga el sangrado con polvos estípticos, vuelva a llenar el alimento en la jaula y asegúrese de que los ratones no muestren signos de estrés extremo.
8. Cargue 2 μL de triglicéridos estándar y recoja los sobrenadantes en una placa de 96 pozos.
9. Agregue 200 μL de reactivo de triglicéridos y deje que la placa se incube durante 5 minutos a 37 ° C para el desarrollo del color.
10. Mida la absorbancia a 500 nm con una longitud de onda de referencia de 660 nm en un lector de placas de laboratorio y calcule la concentración de la muestra.

3. β3 Agonista del receptor adrenérgico CL 316,243 Ensayo de lipólisis estimulada

1. Preparar CL 316,243 como una solución de caldo de 5 mg/ml (50x) en solución salina estéril, y almacenar a –20°C hasta su uso.
2. Por la mañana, pesa a los ratones para calcular la cantidad de solución diluida de CL 316,243 necesaria para el experimento. El ratón recibirá 10 μL por gramo de peso corporal de CL diluido 316.243, para una dosis final de 1 mg/kg de peso corporal.
3. Transfiera los ratones a una nueva jaula con acceso gratuito al agua y ayuna durante 4 horas.
4. Haga suficiente solución 1x CL 316,243 de 50x stock usando solución salina. La concentración final de 1 solución CL 316.243 es de 0,1 mg/ml. Use solución salina para el grupo de tratamiento de control.
5. Marque las colas de los ratones alojados en la misma jaula para una fácil identificación durante los pasos de sangrado.
6. Haga un corte en la vena de la cola y extraiga 15 μL de sangre de la incisión en un capilar de vidrio (llenando aproximadamente 1/5 del capilar), y sople rápidamente la sangre en un tubo de microcentrífuga para T = 0 muestra.
   NOTA: No hay necesidad de detener el sangrado durante el ensayo a menos que los ratones muestren sangrado excesivo.
7. Inyecte la solución diluida de CL 316,243 (o control si se incluye en el experimento) por vía intraperitoneal a un volumen de 10 μL/g de peso corporal. Apila cada ratón en 1 minuto. Use un máximo de 5 ratones para cada experimento de 60 minutos, o 10 ratones para un equipo de dos personas.
8. Extraer sangre en T = 5, 15, 30, 60 minutos: extraer 15 μL de sangre (1/5 capilar) por ratón a través del sangrado de la cola.
9. Después de la última recolección de sangre, detenga el sangrado con polvos estípticos, vuelva a llenar el alimento en la jaula y asegúrese de que los ratones no muestren signos de estrés extremo.
10. Girar muestras de sangre a 2.000 x g a 4 °C durante 5 minutos en una microcentrífuga refrigerada. Transfiera el sobrenadante a un tubo de PCR para su almacenamiento. El sobrenadante se puede almacenar a –20 °C durante varias semanas hasta el análisis.
11. Cargue 1 μL de 2x estándares de glicerol diluido en serie (concentraciones equivalentes a trioleína de 0,156, 0,312, 0,625, 1,25 y 2,5 mg/ml) y recoja los sobrenadantes en una placa de 96 pozos. Agregue 100 μL de reactivo de glicerol libre y deje que la placa se incube durante 5 minutos a 37 ° C para que el color se desarrolle.
12. Mida la absorbancia a 540 nm utilizando un lector de placas de laboratorio y calcule la concentración de la muestra.

Resultados

Mostramos con tres extractos que cada ensayo ofrece información valiosa sobre el metabolismo lipídico de los ratones. Para los ratones machos C57BL / 6J, desafiados por ocho semanas de alimentación con dieta alta en grasas (HFD) a partir de las ocho semanas de edad, los niveles de colesterol total se elevaron significativamente, mientras que los triglicéridos séricos y NEFA no lo fueron (Tabla 1), lo que sugiere que los triglicéridos y NEFA en la sangre no están regulados predominantemente por un ...

Discusión

Los tres ensayos descritos funcionan de manera robusta en el laboratorio, con algunas consideraciones críticas. Se requiere ayuno nocturno para determinar los niveles de lípidos séricos en ayunas y la prueba de tolerancia intralipídica oral. Para la prueba de tolerancia intralipídica oral, es fundamental hacer girar la sangre a temperatura ambiente para minimizar la formación de una capa de grasa, especialmente en los puntos de tiempo de 1 y 2 horas; es importante no descartar esta capa de grasa si se forma. Asegú...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
20% Intralipid	Sigma Aldrich	I141
BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml	Shaotong	B07F1KRMYN
CL 316,243 Hydrate	Sigma-Aldrich	C5976
Curved Feeding Needles (18 Gauge)	Kent Scientific	FNC-18-2-2
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma	G7793
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A	Fujifilm Wako Diagnostics	999-34691
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B	Fujifilm Wako Diagnostics	991-34891
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A	Fujifilm Wako Diagnostics	995-34791
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B	Fujifilm Wako Diagnostics	993-35191
Matrix Plus Chemistry Reference Kit	Verichem	9500
Micro Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-222-168
Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized	Fisher Scientific	22-362-574
NEFA STANDARD SOLUTION	Fujifilm Wako Diagnostics	276-76491
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
Thermo Scientific Triglycerides Reagent	Fisher Scientific	TR22421
Total Cholesterol Reagents	Thermo Scientifi	TR13421