Farelerde Tüm Vücut Lipid Taşıma Kapasitesinin Değerlendirilmesi

Özet

Bu makale, farelerde lipid metabolizmasını değerlendirmek için üç kolay ve erişilebilir test sağlar.

Özet

Lipid metabolizmasının değerlendirilmesi metabolik fonksiyonun değerlendirilmesinin temel taşıdır ve in vivo metabolizma çalışmaları için gerekli kabul edilir. Lipitler, sentezlerinde ve metabolizmalarında yer alan birçok yolak ile birçok farklı molekülden oluşan bir sınıftır. Beslenme ve obezite araştırmaları için lipid hemostazını değerlendirmek için bir başlangıç noktasına ihtiyaç vardır. Bu makalede, ustalaşmak için çok az uzmanlık veya pratik gerektiren ve çoğu laboratuvar tarafından farelerdeki lipid metabolizması anormalliklerini taramak için uyarlanabilen üç kolay ve erişilebilir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemler (1) oral intralipid tolerans testi yoluyla diyet lipid işleme yeteneği için ticari kitler (2) tahlilleri kullanarak birkaç açlık serum lipit molekülünün ölçülmesi ve (3) farelerde CL 316.243 adlı bir farmasötik bileşiğin yanıtının değerlendirilmesidir. Birlikte, bu yöntemler farelerde lipit işleme yeteneğine üst düzey bir genel bakış sağlayacaktır.

Giriş

Karbonhidratlar ve lipitler enerji metabolizması için iki ana substrattır. Anormal lipid metabolizması tip II diyabet, kardiyovasküler hastalıklar, yağlı karaciğer hastalıkları ve kanserler de dahil olmak üzere birçok insan hastalığı ile sonuçlanır. Diyet lipitleri, özellikle trigliseritler, bağırsak yoluyla lenfatik sisteme emilir ve kalbe yakın chylomicronlarda venöz dolaşıma girer¹. Lipitler, yağ asidi moietiesinin kas ve yağ dokusu gibi periferik organlarda lipoprotein lipazının etkisiyle kurtarıldığı kan dolaşımındaki lipoprotein parçacıkları tarafından taşınır². Kalan kolesterol bakımından zengin kalıntı parçacıkları karaciğer tarafından temizlenir³. Fareler, lipid metabolizmasını incelemek için laboratuvarlarda bir araştırma modeli olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Kapsamlı genetik araç seti ve nispeten kısa bir üreme döngüsü ile, lipitlerin nasıl emdiğini, sentezlendiğini ve metabolize edildiğini incelemek için güçlü bir modeldir.

Lipid metabolizmasının karmaşıklığı nedeniyle, sofistike lipidomik çalışmalar veya izotopik izleyici çalışmaları genellikle lipit türlerinin veya lipid ile ilgili metabolik akıların ve kaderlerin koleksiyonlarını ölçmek için kullanılır^4,5. Bu, özel ekipman veya uzmanlığa sahip olmayan araştırmacılar için büyük bir zorluk yaratır. Bu yazıda teknik olarak zorlu teknikler kullanılmadan önce ilk test görevi görebilecek üç tahlil sunuyoruz. Fareler için terminal olmayan prosedürlerdir ve bu nedenle lipid taşıma kapasitesindeki potansiyel farklılıkları belirlemek ve etkilenen süreçleri daraltmek için çok yararlıdır.

İlk olarak, açlık serumu lipid moleküllerinin ölçülmesi, bir farenin genel lipit profilinin tespitine yardımcı olabilir. Fareler oruç tutmalıdır, çünkü birçok lipit türü yemeklerden sonra yükselir ve artışın boyutu diyetin bileşimini güçlü bir şekilde etkiler. Toplam kolesterol, trigliserit ve esterlenmemiş yağ asidi (NEFA) dahil olmak üzere birçok lipid molekülü, ticari bir kit ve emiciliği okuyabilen bir plaka okuyucu kullanılarak ölçülebilir.

İkinci olarak, oral intralipid tolerans testi lipid işleme yeteneğini emilim ve metabolizmanın net bir etkisi olarak değerlendirir. Ağızdan uygulanan bir intralipid dolaşımdaki trigliserit seviyelerinde (1-2 saat) bir artışa neden olur, daha sonra serum trigliserit seviyeleri bazal seviyelere (4-6 saat) geri döner. Bu tahlil, bir farenin eksojen lipitleri ne kadar iyi idare edebileceği hakkında bilgi sunar. Kalp, karaciğer ve kahverengi yağ dokusu trigliseritlerin aktif tüketicileridir, beyaz yağ dokusu ise onu bir enerji rezervi olarak depolar. Bu işlevlerdeki değişiklikler test sonuçlarında farklılıklara yol açacaktır.

Son olarak, depolanan lipitleri harekete geçirmek için lipoliz teşvik etmek kilo kaybı için olası bir strateji olarak kabul edilir. Yağ dokusundaki β3-adrenerjik reseptör sinyal yolu adiposit lipolizinde önemli bir rol oynar ve insan genetiği obezite ile ilişkili β3-adrenerjik reseptörde fonksiyon kaybı polimorfizmi Trp64Arg tespit etti⁶. Cl 316,243, spesifik ve güçlü bir β3-adrenerjik reseptör agonisti, yağ dokusu lipolizini ve gliserol salınımını uyarır. Bir farenin CL 316,243'e verdiği yanıtın değerlendirilmesi, bileşiğin gelişimi, iyileştirilmesi ve etkinliğinin anlaşılması hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.

Toplu olarak, bu testler farelerin lipid metabolik durumundaki değişiklikler için bir başlangıç ekranı olarak kullanılabilir. Enstrümanların ve reaktiflerin erişilebilirliği için seçilirler. Bu testlerden elde edilen sonuçlarla araştırmacılar, hayvanlarının metabolik uygunluğunun genel bir resmini oluşturabilir ve daha sofistike ve hedefli yaklaşımlara karar verebilirler.

Protokol

Hayvanlar, Baylor Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (BCM) tarafından onaylanan hayvan bakımı ve deneysel protokolleri takiben standart koşullarda barındırılmaktadır. Hayvanlar standart veya özel bir diyet, su reklam libitum ile beslenir ve 12 saatlik gündüz / gece döngüsü ile tutulur.

1. Açlık serum lipitlerinin ölçülmesi

1. Fareleri 17:00'den sonra yeni bir kafese aktarın ve bir gecede suya ücretsiz erişimle hızlı olun (deneyden önce yaklaşık 16 saat oruçla). Gece orucu, farelerin gastrointestinal yollarının tamamen boşaltımını sağlar.
   NOT: Fareler oruç sırasında dışkılarını yerler, bu nedenle yiyecek çekme işlemi yeterince oruç tuttuklarından emin olamazlar.
2. Ertesi sabah, fareyi kuyruğundan kavrayın ve bir yüzeye yerleştirin. Fareyi kısıtlayıcıya yerleştirmek için farenin kuyruğuna hafifçe geri çekin. Farenin nefes almasına izin verirken farenin hareketini yeniden eğitmek için burun kısıtlamasını yerleştirin. Burun kısıtlamasının düğmesini sıkın. Hayvanın normal nefes gördüğünden emin olmak için göğüs hareketlerini izleyin ve bir farenin kısıtlayıcılarda geçirdiği süreyi en aza indirin.
3. Serbest hareket eden farenin kuyruk damarında yüzeysel bir kesi (çentik) yapın ve kesiden 25 μL kanı, fareyi kısıtlamadan cam bir kılcal damara (kılcal damarın yaklaşık 1/3'üni doldurarak) çekin. Kanı hızla bir mikrosantrifüj tüpüne üfleyin.
4. Stilistik tozlar kullanarak kanamayı durdurun, kafesteki yemini yeniden doldurun ve farelerin stres belirtisi göstermemesini kesin.
5. Tüm fareler için kan çekmeyi tamamlayın.
6. Kanı oda sıcaklığında 1 saat boyunca bozulmadan bırakarak pıhtılaşmasını kesin. Pıhtılaşmış kan örneklerini 4 °C'de 2.000 x g'da, soğutulmuş bir tezgah üstü mikrosantrifüjde 10 dakika döndürün ve analiz için süpernatantı (serum) aktarın.
   NOT: Serum analize kadar birkaç hafta boyunca –20 °C'de saklanabilir. Uzun süreli depolama için serumu –70°C'de tutun.
7. Üreticinin sağladığı protokolü kullanarak her lipid metabolitini analiz edin.

2. Oral Intralipid Tolerans Testi

1. Saat 17:00'den sonra, ertesi gün kendilerine verilecek intralipid hacminin hesaplanması için fareleri tartın. Ardından, fareleri yeni bir kafese aktarın ve gece boyunca (16 saat) oruçlayın.
2. Ertesi sabah, sonraki kanama adımlarında tanımlanmasına yardımcı olmak için bir kafeste bulunan farelerin kuyruklarını işaretleyin.
3. Kuyruk damarında bir çentik yapın ve kesiden cam bir kılcal damara (kılcal damarın yaklaşık 1/5'ini doldurarak) 15 μL kan çekin ve kanı hızla T = 0 serum için bir mikrosantrifüj tüpüne üfleyin.
   NOT: Fareler fazla kanama göstermediği sürece tahlil sırasında kanamayı durdurmaya gerek yoktur.
4. Gavage fareleri% 20 intralipid, 18G gavage iğnesi kullanarak gram vücut ağırlığı başına 15 μl oranında, oruç öncesi vücut ağırlığını kullanarak. Her fareyi 1 dakika istifle.
   NOT: Hayvanı tartın ve uygun gavage iğne boyutunu belirleyin. Genellikle, 18 kalibrelik bir gavage iğnesi fareler için >25 g uygundur ve 20-22 kalibrelik bir gavage iğnesi daha küçük hayvanlar için daha uygun olacaktır. Fareyi, hayvanın başını yerinde tutmak için cildi omuzların üzerinde kavrayarak reçete edin. Gavage iğnesini ağzına yerleştirin ve ardından yemek borusuna ulaşılana kadar üst damak boyunca hafifçe ilerleyin. Tüp direnç olmadan geçmelidir. Uygun derinliğe ulaşıldıktan sonra, Intralipid yavaşça uygulanabilir. Intralipid'i idare ettikten sonra iğne yerleştirme sırasında aynı açıyı izleyerek iğneyi yavaşça çıkarın. Hayvanı kafese geri koyun ve zahmetli solunum veya diğer sıkıntı belirtilerini izleyin.
   NOT: Oral gavage veya kuyruk kanaması teknikleri konusunda deneyimsiz olan araştırmacılar her fareyi 2 dakika veya daha uzun süre istifleyebilirler.
5. T = 1, 2, 3, 4, 5 ve 6 saatte kan alın: Kuyruk kanaması yoluyla fare başına 15 μL kan (1/5 kılcal damar) çekin ve kanı hızla bir mikrosenjrifuge tüpüne üfleyin.
6. Kan örneklerini oda sıcaklığında 2.000 x g'da mikrosantrifüjde 10 dakika döndürün. Yüzen yağ tabakası da dahil olmak üzere süpernatant'ı depolama için bir PCR tüpüne aktarın. Süpernatant, analize kadar birkaç hafta boyunca –20 °C'de saklanabilir.
   NOT: Süpernatant plazma olmalıdır. Bazı örnekler santrifüjleme zamanında zaten pıhtılaşmışsa, trigliserit ölçümünü etkilemez.
7. Son kan toplanmasından sonra, styptic tozları kullanarak kanamayı durdurun, kafesteki yemini yeniden doldurun ve farelerin aşırı stres belirtisi göstermemesini kesin.
8. 2 μL trigliserit standardı yükleyin ve 96 kuyulu bir plakaya süpernatantlar toplar.
9. 200 μL trigliserit reaktif ekleyin ve plakanın renk gelişimi için 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin.
10. Laboratuvar plakası okuyucusunda 660 nm referans dalga boyu ile emiciliği 500 nm olarak ölçün ve numunenin konsantrasyonu hesaplayın.

3. β3 Adrenerjik Reseptör Agonist CL 316,243 Uyarılmış Lipoliz Tahlil

1. CL 316,243'ü steril salin içinde 5 mg/mL (50x) stok çözeltisi olarak hazırlayın ve kullanıma kadar –20°C'de saklayın.
2. Sabahları, deney için gereken seyreltilmiş CL 316.243 çözelti miktarını hesaplamak için fareleri tartın. Fare, 1 mg / kg vücut ağırlığının son dozu için seyreltilmiş CL 316,243'ün gram vücut ağırlığı başına 10 μL alacaktır.
3. Fareleri suya ücretsiz erişim ile yeni bir kafese aktarın ve 4 saat boyunca oruçlayın.
4. Tuzlu su kullanarak 50x stoktan yeterli 1x CL 316.243 çözeltisi yapın. 1x CL 316,243 çözeltisinin son konsantrasyonu 0,1 mg/mL'dir. Kontrol tedavi grubu için salin kullanın.
5. Kanama adımları sırasında kolay tanımlama için aynı kafeste bulunan farelerin kuyruklarını işaretleyin.
6. Kuyruk damarında bir çentik yapın ve kesiden cam bir kılcal damara 15 μL kan çekin (kılcal damarın yaklaşık 1/5'ini doldurun) ve kanı hızla T = 0 örneği için bir mikrosantrifüj tüpüne üfleyin.
   NOT: Fareler fazla kanama göstermediği sürece tahlil sırasında kanamayı durdurmaya gerek yoktur.
7. Seyreltilmiş CL 316,243 çözeltisini (veya deneye dahil edilirse kontrol) intraperitoneal olarak 10 μL/ g vücut ağırlığı hacminde enjekte edin. Her fareyi 1 dakika istifle. Her 60 dakikalık deney için en fazla 5 fare veya iki kişilik bir ekip için 10 fare kullanın.
8. T = 5, 15, 30, 60 dakika kan çekin: kuyruk kanaması yoluyla fare başına 15 μL kan (1/5 kılcal damar) çekin.
9. Son kan toplanmasından sonra, styptic tozları kullanarak kanamayı durdurun, kafesteki yemini yeniden doldurun ve farelerin aşırı stres belirtisi göstermemesini kesin.
10. 4 °C'de 2.000 x g'da 5 dakika boyunca soğutmalı bir mikrosantrifüjde kan örnekleri döndürün. Süpernatant depolama için bir PCR tüpüne aktarın. Süpernatant, analize kadar birkaç hafta boyunca –20 °C'de saklanabilir.
11. 1 μL 2x seri seyreltilmiş gliserol standartlarını (0.156, 0.312, 0.625, 1.25 ve 2.5 mg/ml Trioleine eşdeğer konsantrasyonlar) yükleyin ve süpernatantları 96 kuyulu bir plakaya toplar. 100 μL serbest gliserol reaktif ekleyin ve rengin gelişmesi için plakanın 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin.
12. Laboratuvar plakası okuyucu kullanarak emiciliği 540 nm olarak ölçün ve numunenin konsantrasyonu hesaplayın.

Sonuçlar

Her testin farelerin lipit metabolizması hakkında değerli bilgiler sunduğunu üç alıntı ile gösteriyoruz. Sekiz haftalıktan başlayarak sekiz haftalık yüksek yağlı diyet (HFD) beslenmesi ile zorlanan C57BL / 6J erkek fareler için, toplam kolesterol seviyeleri önemli ölçüde yükselirken, serum trigliserit ve NEFA değildi (Tablo 1), kandaki trigliserit ve NEFA'nın ağırlıklı olarak bir diyet yağ zorluğu ile düzenlenmediğini düşündürmektedir. İkinci fare kohortunda, C57BL6'n?...

Tartışmalar

Açıklanan üç tahlil, laboratuvarda birkaç kritik hususla birlikte sağlam bir şekilde işlev görür. Açlık serum lipit düzeylerinin belirlenmesi ve oral intralipid tolerans testi için gece oruç gereklidir. Oral intralipid tolerans testi için, özellikle 1 ve 2 saatlik zaman noktalarında bir yağ tabakası oluşumunu en aza indirmek için kanı oda sıcaklığında döndürmek önemlidir; oluşursa bu yağ tabakasını atmamak önemlidir. Süpernatant lipid tabakası ile transfer emin olun ve trigliserit tay...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
20% Intralipid	Sigma Aldrich	I141
BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml	Shaotong	B07F1KRMYN
CL 316,243 Hydrate	Sigma-Aldrich	C5976
Curved Feeding Needles (18 Gauge)	Kent Scientific	FNC-18-2-2
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma	G7793
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A	Fujifilm Wako Diagnostics	999-34691
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B	Fujifilm Wako Diagnostics	991-34891
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A	Fujifilm Wako Diagnostics	995-34791
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B	Fujifilm Wako Diagnostics	993-35191
Matrix Plus Chemistry Reference Kit	Verichem	9500
Micro Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-222-168
Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized	Fisher Scientific	22-362-574
NEFA STANDARD SOLUTION	Fujifilm Wako Diagnostics	276-76491
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
Thermo Scientific Triglycerides Reagent	Fisher Scientific	TR22421
Total Cholesterol Reagents	Thermo Scientifi	TR13421