立体纤毛束成像在活哺乳动物听觉毛细胞中的纳米级分辨率

摘要

在这里，我们提出了跳跃探针离子电导显微镜（HPICM）的方案，这是一种非接触式扫描探针技术，允许对活听觉毛细胞中的立体纤毛束进行纳米级成像。

摘要

内耳毛细胞检测声音诱导的位移，并将这些刺激转化为发束中的电信号，该发束由立体纤毛组成，这些发束排列成高度增加的行。当立体纤毛偏转时，它们会拉扯微小的（直径约5nm）细胞外尖端连接，这些细胞外尖端链接相互连接立体纤毛，从而将力传递到机械敏感转导通道。尽管机械纵促在活毛细胞中已经研究了几十年，但立体纤毛尖端的机电转导机制在功能上重要的超微结构细节（例如尖端链接动力学或转导依赖性立体纤毛重塑）仍然只能在具有电子显微镜的死细胞中进行研究。从理论上讲，扫描探针技术，如原子力显微镜，具有足够的分辨率来可视化立体纤毛的表面。然而，与成像模式无关，即使原子力显微镜探针与立体纤毛束最轻微的接触通常也会损坏束。在这里，我们提出了活啮齿动物听觉毛细胞的跳跃探针离子电导显微镜（HPICM）成像的详细方案。这种非接触式扫描探针技术允许对具有复杂形貌的活细胞表面进行延时成像，如毛细胞，具有单纳米分辨率，并且不与样品进行物理接触。HPICM使用通过玻璃纳米移液器的电流来检测移液器附近的细胞表面，而3D定位压电系统扫描表面并生成其图像。使用HPICM，我们能够对立体纤毛束和连接活听觉毛细胞中的立体纤毛束和连接立体纤毛细胞数小时，而不会造成明显的损伤。我们预计，HPICM的使用将允许直接探索活毛细胞立体纤毛的超微结构变化，以更好地了解其功能。

引言

尽管听觉毛细胞中的立体纤毛束足够大，可以通过光学显微镜观察，并在膜片钳实验中在活细胞中偏转，但转导机制的基本结构组件（例如尖端链接）只能用死细胞中的电子显微镜成像。在哺乳动物听觉毛细胞中，转导机械位于尖端链接的下端，即在短行立体纤毛¹的尖端，并通过立体纤毛^2，3的尖端的信号传导局部调节。然而，由于立体纤毛细胞的小尺寸，活毛细胞中该位置的表面结构的无标记成像是不可能的。

哺乳动物耳蜗有两种类型的听觉感觉细胞:内毛细胞和外毛细胞。在内毛细胞中，与外毛细胞中的发丝相比，立体纤毛更长，更厚⁴。第一排和第二排立体纤毛在小鼠或大鼠内毛细胞中的直径为300-500nm。由于光的衍射，使用无标记光学显微镜可以达到的最大分辨率约为200nm。因此，使用光学显微镜观察内毛细胞束第一排和第二排内的单个立体纤毛相对容易。相反，内毛细胞中较短的行立体纤毛和外毛细胞的所有立体纤毛的直径约为100-200nm，并且无法用光学显微镜⁵可视化。尽管最近在超分辨率成像方面取得了进展，但这一基本限制在任何光学无标记成像中都存在。目前市售的所有超分辨技术都需要某种荧光分子^6，这限制了它们的应用。除了由于需要特定的荧光标记分子而受到限制之外，暴露在强光照射下已被证明会诱导细胞损伤并可能影响细胞过程，这在研究活细胞时是一个很大的缺点⁷。

我们目前对毛细胞立体纤毛束的超微结构细节的了解主要是通过各种电子显微镜（EM）技术获得的，例如扫描电子显微镜（SEM），透射电子显微镜（TEM），冷冻断裂EM，以及最近使用3D技术，例如使用聚焦离子束或冷冻电镜断层扫描^{8，9，10，11，12，13，} 14，15，16 。不幸的是，所有这些EM技术都需要对样品进行化学或冷冻固定。根据现象的时间尺度，这一要求使得对立体纤毛尖端的动态过程的研究要么不可能，要么非常劳动密集型。

用原子力显微镜（AFM）对活毛细胞的毛束进行成像的努力有限^{，17，18。}由于AFM在生理溶液中起作用，因此从理论上讲，它可以可视化活毛细胞立体纤毛束随时间变化的动态变化。问题在于高分辨率AFM的原理，这意味着AFM探头和样品之间存在一定的物理接触，即使在破坏性最小的"攻丝"模式¹⁹中也是如此。当AFM探针遇到立体纤毛时，它通常会撞到它，破坏发束的结构。因此，这种技术不适合可视化活的，甚至是固定的毛细胞束^17，18。通过使用仅对样品²⁰表面施加流体动力的大型球形AFM探头，可以部分缓解该问题。然而，即使这样的探针非常适合测试样品²¹的机械性能，它在对Corti²²的器官成像时仅提供亚微米级的分辨率，并且仍然对样品施加对于高度敏感的立体纤毛束来说可能是巨大的力。

扫描离子电导显微镜（SICM）是扫描探针显微镜的一种版本，它使用填充有导电溶液²³的玻璃移液器探针。当移液器接近细胞并且通过移液器的电流减少时，SICM会检测表面。由于这在接触细胞之前就已经发生，因此SICM非常适合在生理溶液²⁴中对活细胞进行非接触式成像。SICM的最佳分辨率约为单纳米，这允许在活细胞²⁵的质膜上解析单个蛋白质复合物。然而，与其他扫描探针技术类似，SICM只能对相对平坦的表面进行成像。我们通过发明跳跃探针离子电导显微镜（HPICM）26克服了这一限制，其中纳米移液器在每个成像点接近样品（图1A）。使用HPICM，我们能够以纳米级分辨率²⁷对活听觉毛细胞中的立体纤毛束进行成像。

这种技术的另一个基本优点是HPICM不仅仅是一种成像工具。与其他扫描探针技术相比，HPICM / SICM探针是一种广泛用于细胞生理学的电极，用于各种刺激的电记录和局部传递。离子通道活性通常不会干扰HPICM成像，因为通过HPICM探针的总电流比最大离子通道²⁵产生的细胞外电流大几个数量级。然而，HPICM允许在感兴趣的结构上精确定位纳米移液器，以及随后从该结构²⁸进行单通道膜片钳记录。这就是我们如何获得外毛细胞立体纤毛²⁹尖端的单通道活动的第一个初步记录。值得一提的是，由于细胞外介质的巨大分流，即使通过纳米移液管的大电流也无法在质膜上产生电位的显着变化。然而，单个离子通道可以通过液体流过纳米移液器³⁰ 或通过局部施用激动剂³¹以化学方式被机械激活。

在HPICM中，当纳米移液器在一个点上依次接近样品，缩回，然后向横向移动以重复接近时，就会生成图像（图1A）。膜片钳放大器不断向移液器中的AgCl线施加电压（图1B），以在浴液中产生~1 nA的电流。当移液器远离电池表面时，该电流的值被确定为参考电流（I_ref，图1C）。然后，移液器在Z轴上移动以接近样品，直到电流减少用户预定义的量（设定值），通常为I_ref的0.2%-1%（图1C，顶部迹线）。然后，系统将此时的Z值保存为样品的高度，以及该成像点的X和Y坐标。然后，移液器以用户定义的速度（通常为700-900 nm / ms）从表面缩回（图1C，底部迹线）。在缩回后，移液器（或者，在我们的例子中，样品 - 见图1B）被横向移动到下一个成像点，获得新的参考电流值，移液器再次接近样品，重复该过程。移液器的X-Y运动在直置显微镜设置中是首选，通常用于记录毛细胞机械转导电流。在这种情况下，HPICM探针不是从顶部以³²的角度接近毛细胞束。然而，HPICM成像的最佳分辨率是在倒置显微镜设置中实现的（图1A，B），其中样品在X-Y方向上的运动与纳米移液器的Z运动脱耦合，从而消除了潜在的机械伪影。

使用HPICM，我们获得了小鼠和大鼠内外毛细胞立体纤毛束的地形图像，甚至可视化了直径约为5nm的立体纤毛之间的联系^26，27。使用这种技术进行毛细胞束成像的成功取决于几个因素。首先，纳米移液器电流的噪声（方差）应尽可能小，以便为HPICM成像提供尽可能低的设定点。低设定值允许HPICM探针在更远的距离和与探针方法的任何角度"感知"立体纤毛表面，并且令人惊讶的是，提高了HPICM成像的X-Y分辨率（参见讨论）。其次，系统中的振动和漂移应减少到小于10nm，因为它们直接导致成像伪影。最后，即使HPICM探头和样品台通过具有单个纳米或更高精度的校准反馈控制压电致动器在Z轴和X-Y轴上移动，纳米移液器尖端的直径也决定了电流的扩散（传感体积）和分辨率（图1A）。因此，在对活毛细胞进行成像之前，至关重要的是要拉动足够的移液器，用校准样品达到所需的分辨率，并在记录系统中实现低噪声。

至少几十年来，SICM技术尚未商业化，世界上只有少数几个实验室与帝国理工学院（英国）的Korchev教授的领先实验室一起开发。最近，几种SICM系统开始商业化（见 材料表），所有这些都基于原始的HPICM原理。然而，对毛细胞中的立体纤毛束进行成像需要进行一些定制修改，这些修改在封闭的"准备就绪"系统中在技术上具有挑战性（甚至是不可能的）。因此，需要一些组件集成。由于HPICM设置代表了一个具有更严格的振动和漂移要求以及HPICM探头和样品的压电驱动运动的膜片钳装置（图1D），因此对于任何精通膜片钳的研究人员来说，这种集成都相对容易。然而，一个没有适当背景的科学家肯定首先需要一些电生理学培训。尽管仍然存在挑战，例如提高成像速度（参见 讨论），但我们已经能够以纳米级分辨率对活毛细胞中的立体纤毛束进行成像而不会损坏它们。

本文提出了一个详细的方案，使用我们的定制系统对年轻的产后大鼠或小鼠耳蜗外植体中的活听觉毛细胞束进行成功的HPICM成像。集成组件列在 材料表。本文还介绍了可能遇到的常见问题以及如何排除故障。

研究方案

该研究是根据美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行的。所有动物程序均由肯塔基大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（协议00903M2005）。

1.纳米塑胶的制造和测试

1. 在微量移液器拉拔器中创建一个程序，以获得电阻在200至400 MΩ之间的移液器，其对应于约50-70nm的内吸头直径。参数将取决于微量移液器拉拔器。要获得带有非柔性精细吸头的短移液器，请查看拉拔器的操作手册。
2. 使用外径/内径为1/0.58 mm的硼硅酸盐玻璃毛细管和内丝，以方便填充。移液器的长度至关重要，因为它决定了移液器横向机械共振的频率。移液器越长，谐振频率越低，就越难避免这种共振。
   注:用户应尽量制造支架可以接受的最短移液器。本实验中纳米管的长度通常为15-25毫米（图2A）。
3. 用浴液将纳米移液器填充到其中点（图2A），要么是Leibovitz的L-15，要么是补充有20 mM D-葡萄糖的Hank平衡盐溶液（HBSS）（以调节渗透压）。为避免潜在的伪影，请使用与浴槽中用于录音的相同溶液。
4. 使用放大倍率为10x的光学显微镜，检查移液器尖端是否有任何气泡（图2B）。气泡会阻止电流流动。在实验前几个小时拉出移液器中的气泡更难。因此，建议在每次实验中拔出新的移液器。
5. 移液器没有气泡后，将其安装在HPICM移液器支架中（图2C）。
6. 将样品（组织或校准标准品）放在定制的腔室中，并加入4mL上述浴液。
7. 将定制的腔室放在HPICM台上，并将接地电极引入溶液中。
8. 确保膜片钳放大器施加到移液器上的电压为零。
9. 将移液器以 Z 方向移动，直到其接触到液体。
10. 将放大器失调设置为零，然后加+100 mV以检查移液器电流。
11. 根据欧姆定律计算移液器的电阻和直径:
    R = V/I
    其中R是电阻（MOhm），V是施加到纳米移液器（mV）的电压，I是流经纳米移液管（nA）的电流。
    1. 根据以下公式¹²计算移液器的内径，如其他地方所述:
       ID_提示= 1000/ √R
       注:理想电阻值介于200和400 MΩ之间。电阻高于400 MΩ的移液器由于其尺寸小（<50nm内径）而可能导致电流不稳定。相反，电阻小于200 MΩ的移液器太大（>70nm内径），无法解析小特征。建议使用电阻为200 MΩ的移液器开始成像，因为它们更易于制造并且往往提供较少的电噪声。

2.最大限度地减少样品漂移和振动

注:为了降低成像过程中系统中的机械噪声，请将样品安装在使用厚载玻片（~1.2 mm）的定制腔室中:

1. 从50毫米玻璃底皿上取下玻璃部分，保持塑料壁完好无损。
2. 用硅胶将细胞培养皿的塑料部分粘在厚载玻片的顶部。
3. 使用硅胶或薄双面胶带将校准样品安装在腔室中间（载玻片顶部）。
4. 使用双面胶带将腔室牢固地固定在HPICM载物台上。
5. 在成像过程中，关闭法拉第笼并用毯子盖住它，以相应地减少电气干扰和热漂移。

3.使用AFM校准标准测试分辨率

注:强烈建议在对活细胞进行成像之前对AFM标准品进行成像（参见 材料表），以便对系统进行故障排除并在X-Z-Y轴上测试其分辨率。校准标准品在5 x 5 mm硅芯片上具有不同形状但固定高度/深度（即20或100nm）的二氧化硅柱和孔。建议从100 nm校准标准开始，以保证Z分辨率低于100 nm。在获得该校准样品中柱子或孔的成功高分辨率图像（图3A）后，移至20nm标准。如果后一种标准的成像成功（图3B），则Z轴上的分辨率保证低于20nm并且适合于毛细胞立体纤毛束¹²的成像。以下步骤用于对两种校准标准液进行成像。

1. 用硅胶将校准标准品连接到腔室。
2. 向腔室中加入4 mL HBSS以覆盖校准样品。然后，使用双面胶带将腔室固定在HPICM设置的XY阶段。
3. 将接地电极的磁性支架夹在靠近腔室的载物台上，然后将电极浸入浴液中（图1B）。
4. 将纳米移液器安装到支架中，将其浸入浴液中，并按照第1节中所述的步骤将其电流设置为~1 nA。
5. 使用刀状钳机械手将纳米移液器放置在校准标准品中心的大约上方。目视检查通常足以进行这种定位，因为二氧化硅结构覆盖的区域相对较大（1 x 1 mm）。与Corti外植体的器官（见下文）相比，校准标准品是不透明的，因此，对于该样品，不可能通过光学成像进行更精确的定位。
6. 增加设定值，同时实时监控示波器上Z压电致动器传感器的信号。在建立稳定的可重复Z接近循环（如图 1C，底部）后，将设定点降低到刚好高于不稳定点的值。该过程将确保该特定纳米移液器的最佳设定点。
7. 使用膜片钳显微操作器以~5μm/s的速度向下移动移液器，直到其到达样品。此时，实时Z定位信号的底层（图1C）将增加，表明纳米移液器由于"感应"样品表面而被撤回。纳米移液器的任何进一步移动都将导致Z定位信号的进一步正移。
   注:注意不要超过Z压电致动器运动的上限。
8. 以低分辨率开始成像（见 表1）。由于AFM标准的安装不均匀，感兴趣区域的最高点可能是未知的。因此，将移液器缩回的振幅（跳振幅）设置为至少200-500nm。
   1. 一旦确定了成像区域中样品的最高点，就减小跳跃幅度。较小的跳跃幅度允许更快的扫描，这是高分辨率成像的首选，因为漂移的影响减弱，振动减少。
9. 在将移液器移动到新的X-Y位置之前，请在Z轴上将其缩回约200μm，以防止与样品发生任何不希望的碰撞。
   注:当纳米移液器未与校准标准品的中心对齐时，扫描可能刚从表面特征区域开始。
10. 找到感兴趣区域后，以更高的分辨率开始成像（见表1）。

4.制作定制腔室以固定人工耳蜗外植体

注:使用定制夹紧系统的腔室中安装人工耳蜗外植体，该系统使用柔性玻璃移液器（步骤4.1）（图4A）或牙线（步骤4.2）（图4B）。玻璃移液器室可以灭菌并用于Corti的培养器官，而牙线室则在安装过程中提供更安全的样品夹持和控制立体纤毛束方向。这些定制的腔室需要提前准备，但它们可以在几次成像过程中进行清洁和重复使用。

1. 使用柔性玻璃移液器制作腔室
   1. 使用移液器从玻璃毛细管中拉出两根薄而柔韧的玻璃纤维。我们的拉制玻璃纤维通常长度为1至2厘米，并且相当灵活。
   2. 将一小滴有机硅弹性体放在玻璃盖玻片上。使用直径为 2 厘米的盖玻片。
   3. 将两根玻璃纤维的末端放在硅胶滴上，并排列纤维以使它们之间有小程度的分离（图4A）。
   4. 将盖玻片放在热板上以快速固化弹性体（1至3分钟）。
   5. 使用少量（1-3μL）有机硅弹性体将盖玻片粘在第2节所述的腔室的玻璃底部，并使其固化过夜。
2. 使用牙线制作腔室:
   1. 取下50毫米玻璃底碟的玻璃部分，保持塑料壁完好无损。然后用硅胶将细胞培养皿的塑料部分粘在1.2毫米厚的载玻片上。
   2. 用相同的胶水将一个塑料盖玻片（6.5 x 6.5 mm）安装到腔室的中心。然后在前一个盖玻片上用另一个盖玻片重复该过程。
   3. 用硅胶安装两根小钨丝或镀金线（长度为12 mm，直径约0.5 mm），每根导线位于盖子滑动的相对两侧。将它们粘离盖玻片足够远（>10-15毫米）（图4B）。
   4. 将两根牙线分开，将它们放在盖玻片的顶部，并通过打结将它们固定在电线上。在两股线之间留出一个小间隙（图4B，短箭头）。
3. 每次使用后清洁腔室
   1. 使用细镊子轻轻地将组织从腔室中取出，并轻轻刮掉留下的任何组织残留物。
   2. 首先用70%乙醇冲洗腔室，然后用蒸馏水冲洗。
   3. 如果需要，重复冲洗循环。
   4. 将腔室倒置在滤纸上，使其干燥，直到下一次实验。这些腔室不需要消毒，除非在成像后计划培养Corti器官。

5.解剖科尔蒂的啮齿动物器官

1. 如其他地方¹³所述，对年轻的产后耳蜗外植体进行解剖。
2. 对于HPICM成像，在产后第3天和第6天（P3-6）之间从小鼠身上解剖Corti器官，在产后第3天和第8天（P3-8）之间从大鼠身上解剖皮质器官。
   注意:较老的毛细胞在解剖过程中更容易受到损伤，因此不能用于长达数小时的HPICM成像。
3. 不要忘记在HPICM成像之前取下胸膜。
4. 解剖后立即将组织固定在第4节中描述的一个腔室中，将其放在柔性玻璃移液器下或两根牙线下（图4）。用4 mL室温浴溶液预填充这些腔室（以尽量减少气泡的形成）。

6.听觉毛细胞成像

1. 使用双面胶带将带有刚分离的Corti器官的腔室安装在X-Y压电台上，并确保其牢固固定以最大程度地减少X轴和Y轴上的腔室漂移（图1B）。
2. 按照第1节中的步骤放置新的纳米移液器并检查正确的移液器电阻。
3. 使用膜片钳显微操作器，将纳米移液管放置在毛细胞区域，同时在倒置显微镜中观察Corti外植体的器官。
4. 通过记录示波器上的实时电流和Z定位信号，检查系统是否稳定，设定值为0.5%或更低（ 如图1C所示）。如果Z信号不稳定，尝试降低膜片钳放大器的低通滤波器的截止频率。但是，它不能低于Z压电致动器的响应时间（以避免移液器由于延迟电流读数而与样品碰撞）。
   注意:在实践中，此滤波器的 5 kHz 设置被认为是最佳的。如果Z信号仍然不稳定，最好更换纳米移液管。
5. 一旦达到稳定的记录，确定最佳设定点，并按照上述步骤3.6-3.7中所述使用HPICM移液器接近样品。
6. 首先，使用至少6至8μm的跳跃幅度进行低分辨率成像（见表1）。要对高大结构（如毛细胞立体纤毛束）进行成像，请确保啤酒花振幅足以避免与这些结构碰撞。
   注意:如果跳振幅不够，移液器将无法跳过立体纤毛，并且即将发生碰撞。HPICM探针与立体纤毛的碰撞可能会损坏发束。因此，在立体纤毛束高度不确定的情况下，请使用更大的跳跃幅度。
7. 通过首先执行和/或研究使用扫描电子显微镜获得的图像来熟悉Corti器官的地形（图5）。
   注意:如果HPICM图像均匀，每个成像点的高度小于1μm，则移液器可能扫描的是玻璃底部而不是组织。或者，移液器可以"落地"在耳蜗外植体的不同区域，远离毛细胞。
8. 如果需要将移液器移动到新的X-Y位置，请将其缩回约500nm，以避免与组织内的任何高特征发生碰撞。重复低分辨率的HPICM成像，直到找到毛细胞感兴趣的区域。
9. 找到感兴趣区域后，以更高的分辨率开始成像（见 表1）。尝试在对整个发束进行成像时花费少于15分钟。
   注意:活组织中的毛细胞束不是静止的，但可能会改变其方向，例如，由于底层支撑细胞的形状变化。因此，如果图像采集速度太慢，图像可能会出现运动伪影。
10. 再次，在降低高分辨率成像的跳跃幅度之前，确定低分辨率图像中最高的特征。对于覆盖整个毛细胞束的感兴趣区域，将跳振幅降低到4-5μm，而对于束内相对较小且"平坦"的区域（例如，2×2μm），进一步降低跳幅，降至小于1μm，从而提高成像的速度和分辨率。

7.图像处理

注:影像伪影在 HPICM 成像中很常见。其中一些可以通过图像采集参数进行校正，而另一些则需要使用专门的SICM查看器或更通用的数据处理程序（如ImageJ或MatLab）进行后处理。在这里，我们描述了最常见的伪影，以及我们如何使用SICM查看器修复它们。

1. 执行斜率校正
   注意:对于初学者来说，这并不明显，但是如果成像区域的总斜率等于或更大，人眼无法解析细胞表面的亚微米大小特征（图3A，B，左）。因此，有必要确定成像区域的平均斜率（通过将HPICM 3D图像数据拟合到单个平面）并从HPICM图像中减去（图3A，B，中）。
   1. 单击" 打开 "以使用 SICM 查看器打开图像。
   2. 选择 "图像校正 "选项卡。
   3. 选择 正确的坡度 选项卡。
   4. 按 "校正坡度 "按钮进行自动坡度校正。
2. 执行线条对齐
   注意:如前所述，机械和/或热漂移以及细胞运动伪影是HPICM成像中的一个重大问题。在常规的膜片钳设置中，速度小于每分钟一微米的小漂移通常不明显。然而，它可以在HPICM成像中产生几十纳米的伪影，这明显大于HPICM的分辨率。因此，在成像过程中，在两条相邻的HPICM扫描线之间遇到Z轴突然跳跃的情况并不少见。这可以通过分析这些相邻扫描线中开始（和/或结束）Z值之间的差异来纠正。
   1. 单击" 打开 "以使用 SICM 查看器打开图像。
   2. 选择 "图像校正 "选项卡。
   3. 选择 正确的坡度 选项卡。
   4. 选择要对齐的线条的宽度。按下 按钮去条纹线适合按钮，进行自动线对齐校正。
3. 执行降噪
   注意:在使用HPICM获取图像时，纳米移液器电流的微小波动可能导致纳米移液器远离样品表面，特别是在低设定值的情况下。它会导致图像中出现小白点。为了纠正此成像伪影，有必要识别 Z 值明显大于相邻要素的成像点，并将此值替换为相邻要素的平均值。这是通过可调节的中位数滤波器完成的。
   1. 单击" 打开 "以使用 SICM 查看器打开图像。
   2. 选择 图像处理 选项卡。
   3. 选择" 降噪 "选项卡。
   4. 为要删除的像素设置 阈值过滤器 （μm）。

结果

本文中提出的方案可用于可视化具有复杂地形的任何活细胞。按照这些步骤，我们常规获得活大鼠听觉毛细胞束的图像（图6B，D）。尽管与SEM图像相比，我们的X-Y分辨率较低，但我们的HPICM图像可以成功地分辨出立体纤毛的不同行，立体纤毛尖端的形状，甚至是连接相邻立体纤毛的小链接（直径约5nm）（图6F）。此外，HPICM图像具有SEM图像?...

讨论

为了获得成功的HPICM图像，用户需要建立一个低噪音和低振动的系统，并制造合适的移液器。我们强烈建议在尝试进行任何活细胞成像之前使用AFM校准标准品来测试系统的稳定性。一旦测试了系统的分辨率，用户就可以考虑对Corti样本的固定器官进行成像，以熟悉成像设置，然后再尝试任何活细胞成像。

成像的最佳设定点因移液器而异，这取决于其吸头的各个形状（在电子显?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analog oscilloscope	B&K Precision	2160C	Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach
AFM calibration standards	TED PELLA Inc	HS-100MG; HS-20MG	These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system
Benchtop vibration Isolator	AMETEK/TMC	Everstill K-400	Active vibration isolation
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments (WPI)	1B100F-4	Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	To be added to the bath solution to adjust osmolarity
Digitizer	National Instruments Corporation	PCI-6221	Multi-channel input/output digitizer
Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement	Standford Research Systems	SIM900, SIM960, SIM980	Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.
Faraday cage	AMETEK/TMC	Type II	Required to shield electromagnetic interference
Glass bottom dish	World Precision Instruments (WPI)	FD5040-100	Used as the dish for the chamber for the tissue
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	14025092	Extracellular (bath) solution
Instrumentation amplifier	Brownlee Precision	Model 440	Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation
Laser-based micropipette puller	Sutter Instrument	P-2000/G	Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.
Lebovitz's L-15, without phenol red	Gibco, Thermo Fisher Scientific	21083027	Extracellular (bath) solution
Micromanipulator	Scientifica	PatchStar	Used for "course" positioning of the Z piezo actuator
Microscope	Nikon	Eclipse TS100	Inverted optical microscope
Patch amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B	The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette
Piezo amplifier (XY axes)	Physik Instrumente (PI)	E-500.00, E-505.00, E-509.C2A	Amplification and PID control for XY piezo translation stage
Piezo amplifier (Z axis)	Piezosystem jena	ENT 400 & 800	Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA
Plastic Coverslips	TED PELLA Inc	26028	Used in the fabrication of the chambers for the tissue
SICM controller & software*	Ionscope, UK (ionscope.com)	N/A	Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd
Silicone elastomer (Sylgard)	World Precision Instruments (WPI)	SYLG184	Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue
Silicon glue	The Dow Chemical Company	734	Used to glue the different parts of the chamber for the tissue
Tungsten rod	A-M Systems	717500	Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue
XY piezo nanopositioner	Physik Instrumente (PI)	P-733.2DD	XY translation stage with capacitive sensors
Z piezo nanopositioner	Piezosystem jena	RA 12/24 SG	Ring piezoactuator with a strain gage sensor
*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:  NX12-Bio and NX10 SICM,
Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original
HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically
challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one
modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.