살아있는 포유류 청각 머리 세포에 있는 나노 규모 해상도를 가진 스테레오실리모들 화상 진찰

요약

여기서 우리는 호핑 프로브 이온 전도 현미경 검사법 (HPICM)에 대한 프로토콜을 제시, 라이브 청각 헤어 셀에서 스테레오실리의 나노 스케일 이미징을 허용하는 비 접촉 스캐닝 프로브 기술.

초록

내이 헤어 셀은 소리 유발 변위를 감지하고 높이가 증가하는 행으로 배열되는 스테레오실리아로 구성된 헤어 번들에서 이러한 자극을 전기 신호로 변환합니다. 스테레오실리아가 편향되면 작은(직경5nm)에 예인선이 교차하는 스테레오시리아를 연결하여 메카노감과감성 트랜스듀션 채널에 힘을 전달합니다. 메카노트랜스덕션은 수십 년 동안 살아있는 모발 세포에서 연구되었지만, 스테레오실리아 의 끝에서 메카노트랜스덕션 기계의 기능적으로 중요한 초구조적 세부 사항(예: 팁 링크 역학 또는 트랜스듀션 의존성 입체 리모델링)은 여전히 전자 현미경 검사를 받은 죽은 세포에서만 연구될 수 있다. 이론적으로, 원자력 현미경 검사법과 같은 스캐닝 프로브 기술은 스테레오실리아의 표면을 시각화하기에 충분한 해상도를 갖습니다. 그러나, 이미징 모드와는 별개로, 스테레오실리와 함께 원자력 현미경 프로브의 사소한 접촉조차도 일반적으로 번들을 손상시합니다. 여기서 우리는 살아있는 설치류 청각 모발 세포의 호핑 프로브 이온 전도성 현미경 검사법 (HPICM) 화상 진찰에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 비접촉 스캐닝 프로브 기술은 모발 세포와 같은 복잡한 지형을 가진 살아있는 세포의 표면의 시간 경과 이미징을 단일 나노미터 해상도로 샘플과 물리적접촉을 하지 않고도 할 수 있습니다. HPICM은 유리 나노피펫을 통과하는 전류를 사용하여 파이펫 가까이에서 셀 표면을 감지하고 3D 포지셔닝 압전 시스템은 표면을 스캔하고 이미지를 생성합니다. HPICM을 사용하면 눈에 띄는 손상없이 몇 시간 동안 살아있는 청각 헤어 셀에서 스테레오실리아를 상호 연결하는 스테레오실리와 연결 된 링크를 이미지 할 수있었습니다. 우리는 HPICM의 사용이 그들의 기능을 더 잘 이해하기 위해 살아있는 머리 세포의 스테레오실리에 있는 초구조적인 변경의 직접적인 탐구를 허용할 것으로 예상합니다.

서문

청각 모발 세포내 의 스테레오실리아가 광학 현미경 검사법에 의해 시각화되고 패치 클램프 실험에서 살아있는 세포에서 편향될 정도로 크다는 사실에도 불구하고 팁 링크와 같은 트랜스듀션 기계의 필수 구조 성분은 죽은 세포에서전자 현미경으로만 이미지화될 수 있다. 포유류 청각 모발 세포에서, 트랜스듀션 기계는 팁 링크의 하부 에 위치하고, 즉, 짧은 행 스테레오실리아^1의 끝에서 스테레오실리아^2의끝에서 신호를 통해 국소적으로^{조절된다 2,3.} 그러나, 살아있는 머리 세포에 있는 이 위치에 있는 표면 구조물의 레이블 없는 화상 진찰은 입체증의 작은 크기 때문에 가능하지 않습니다.

포유류 달팽이관에는 두 가지 유형의 청각 감각 세포가 있습니다: 내부 및 외부 모발 세포. 내부 모발 세포에서, 스테레오실리아는 외발성 세포^4에비해 더 길고 두껍다. 스테레오실리아의 첫 번째 및 두 번째 행은 마우스 또는 쥐 내부 모발 세포에서 300-500 nm의 직경을 갖는다. 빛의 회절로 인해 라벨이 없는 광학 현미경으로 달성할 수 있는 최대 해상도는 약 200nm입니다. 따라서, 내부 헤어 셀 번들의 제1 및 두 번째 행 내에서 개별 입체의 시각화는 광학 현미경으로 비교적 쉽습니다. 대조적으로, 내부 모발 세포및 외부 모발 세포의 모든 스테레오실리아의 짧은 행 스테레오실리는 직경이 100-200 nm이며 광학 현미경^5로시각화할 수 없다. 최근 초분해능 이미징의 진전에도 불구하고, 이러한 근본적인 한계는 광학 라벨없는 이미징에서 지속됩니다. 현재 시판되는 모든 슈퍼 분해능 기술은 일종의 형광 분자^6이필요하며, 이는 응용 프로그램을 제한합니다. 특정 형광 태그 분자에 대한 필요성에 의한 제한 외에도, 강렬한 빛 조사에 노출세포 손상을 유도하고 세포 과정에 영향을 미칠 수 있는 것으로 나타났으며, 이는 살아있는 세포를 연구할 때 큰 단점이다^7.

모발 세포 입체 번들의 초구조적 세부 사항에 대한 현재의 지식은 주로 전자 현미경 검사법(SEM), 전염 전자 현미경 검사법(TEM), 동결 골절 EM 과 같은 다양한 전자 현미경 검사법(EM) 기술로 주로 수득되었으며, 최근에는 이온 빔 또는 냉동-EM 단층 촬영^8,9,10, 10, 10, 10, 10, 10,^{10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 12, 10, 10, 10, 12, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10,12 14,15,16}. 불행히도, 이러한 모든 EM 기술은 시료의 화학적 또는 극저온을 필요로 합니다. 현상의 시간 규모에 따라,이 요구 사항은 불가능하거나 매우 노동 집약적 인 스테레오실리의 끝에서 동적 프로세스의 연구를합니다.

원자력 현미경검사(AFM)^17,18을가진 살아있는 모발 세포의 모발 번들을 이미지하기 위한 제한된 노력이 이루어지고 있다. AFM은 생리적 용액에서 작동하기 때문에 이론적으로 시간이 지남에 따라 살아있는 모발 세포의 스테레오실리아 번들에 동적 변화를 시각화 할 수 있습니다. 문제는 AFM 프로브와 샘플 사이의 특정 물리적 접촉을 의미하는 고해상도 AFM의 원칙에 있습니다, 심지어 가장 손상 "도청"모드⁽¹⁹⁾. AFM 프로브가 스테레오실륨을 마주하면 일반적으로 충돌하여 머리카락 번들의 구조를 손상시니다. 그 결과, 이 기술은 라이브, 또는 고정된 모발 세포 번들^17,18을시각화하는 데 적합하지 않다. 상기 문제점은^{시료(20)의}표면에 유체역학력만을 부과하는 대형 볼 모양의 AFM 프로브를 이용하여 부분적으로 완화될 수 있다. 그러나, 이러한 프로브가^{샘플(21)의}기계적 특성을 테스트하는 데 이상적으로 적합하지만,^Corti(22)의 장기를 이미징할 때 서브 마이크로미터 해상도만 제공하며 여전히 고감도 스테레오실리아 번들에 대해 상당한 힘을 샘플에 적용한다.

스캐닝 이온 전도성 현미경검사(SICM)는 전도성^{용액(23)으로}채워진 유리 파이펫 프로브를 사용하는 스캔 프로브 현미경 검사법의 버전이다. SICM은 파이펫이 전지와 파이펫을 통해 전류에 접근할 때 표면을 감지합니다. 이것은 세포를 접촉하기 전에 잘 일어나기 때문에, SICM은 생리적^{용액(24)에서}살아있는 세포의 비접촉 화상 진찰에 이상적입니다. SICM의 가장 좋은 해상도는 살아있는^{세포(25)의}혈장 막에서 개별 단백질 복합체를 해결할 수 있는 단일 나노미터의 순서에 있다. 그러나 다른 스캐닝 프로브 기술과 마찬가지로 SICM은 비교적 평평한 표면만 이미지할 수 있습니다. 우리는 나노 파이펫이 각 이미징 지점에서 샘플에 접근하는 호핑 프로브 이온 전도성 현미경 (HPICM)^(26)를발명하여 이러한 한계를 극복(도 1A). HPICM을 사용하여 나노 스케일 해상도^27을사용하여 살아있는 청각 모발 세포에서 입체 번들을 이미지 할 수 있었습니다.

이 기술의 또 다른 근본적인 장점은 HPICM이 이미징 도구일 뿐만 아니라는 것입니다. 다른 스캐닝 프로브 기술과는 달리, HPICM/SICM 프로브는 다양한 자극의 전기 기록 및 국소 전달을 위해 세포 생리학에 널리 사용되는 전극이다. 이온 채널 활동은 일반적으로 HPICM 프로브를 통해 전체 전류가 가장 큰 이온^{채널(25)에}의해 생성된 세포외 전류보다 여러 배 더 큰 크기이기 때문에 HPICM 이미징을 방해하지 않는다. 그러나, HPICM은 이^{구조(28)로부터}관심 구조와 후속 단일 채널 패치 클램프 레코딩을 통해 나노피펫의 정확한 포지셔닝을 허용한다. 이것은 우리가 외발 모발 세포^{스테레오실리아(29)의}끝에서 단일 채널 활동의 첫 번째 예비 기록을 획득한 방법입니다. 나노 피펫을 통해 큰 전류조차도 세포 외 배지의 거대한 전기 션트로 인해 플라즈마 멤브레인 전반에 걸쳐 잠재력의 중요한 변화를 생성 할 수 없다는 것을 언급 할 가치가 있다. 그러나, 개별 이온 채널은 나노피펫(30)을 통해 액체의 흐름에 의해 기계적으로 활성화될 수 있거나, 또는^{작용제(31)의}국소 적용에 의해 화학적으로 활성화될 수 있다.

HPICM에서, 상기 이미지는 나노피펫이 한 지점에서 시료에 순차적으로 접근할 때 생성되고, 후퇴한 다음, 측면 방향으로 이동하여접근법(도 1A)을반복한다. 패치 클램프 증폭기는 파이펫(도1B)의AgCl 와이어에 전압을 지속적으로 적용하여 목욕 용액에서 ~1nA의 전류를 생성한다. 피펫이 셀의 표면에서 떨어져 있을 때 이 전류의 값은 참조 전류로 결정된다(I_참조, 도 1C). 이어서, 파이펫은 Z 축에서 이동하여 전류가 사용자에 의해 미리 정의된 양(setpoint)에 의해 감소될 때까지 샘플에 접근한다( 보통 0.2%-1%의 I_심판(도 1C,상단 추적). 그런 다음 이 이미징 점의 X 및 Y 좌표와 함께 이 시점에서 Z 값을 샘플높이로 저장합니다. 이어서, 파이펫은 사용자가 정의한 속도로표면(도 1C,하부 추적)에서 멀리 후퇴하며, 보통 700-900 nm/ms. 후퇴 후, 파이펫(또는, 당사의 경우, 샘플-도 1B참조)는 다음 이미징 지점으로 측면으로 이동되고, 새로운 기준 전류 값이 얻어지고, 파이펫이 다시 한 번 샘플에 접근하여 과정을 반복한다. 파이펫의 X-Y 운동은 전형적으로 모발 세포 메카노트랜스유도 전류의 기록에 사용되는 직립 현미경 설정에서 선호된다. 이 설정에서 HPICM 프로브는 상단이 아니라 각도^32에서헤어 셀 번들에 접근합니다. 그러나, HPICM 이미징의 최상의 해상도는 반전된 현미경설정(도 1A,B)에서달성되며, 여기서 X-Y 방향으로 샘플의 움직임이 나노피펫의 Z-이동으로부터 분리되어 잠재적인 기계적 유물을 제거한다.

HPICM을 사용하여 마우스와 쥐 내부 및 외발 모발 세포 스테레오실리아 번들의 지형 영상을 입수하고, 지름^26,27에서약 5nm인 스테레오실리사이의 링크를 시각화하였다. 이 기술로 모발 세포 번들 이미징의 성공은 여러 가지 요인에 의존합니다. 첫째, 나노피펫 전류의 노이즈(분산)는 HPICM 이미징에 대해 가능한 가장 낮은 설정점을 허용하기 위해 가능한 한 작아야 한다. 낮은 설정점을 사용하면 HPICM 프로브가 더 먼 거리와 프로브 접근법에 대한 모든 각도에서 스테레오시리아 표면을 "감지"할 수 있으며 놀랍게도 HPICM 이미징의 X-Y 해상도를 향상시킵니다(토론 참조). 둘째, 이미징 유물에 직접 기여하기 때문에 시스템의 진동과 드리프트를 10nm 미만으로 감소시켜야 합니다. 마지막으로, HPICM 프로브와 시편 스테이지가 단일 나노미터 이하의 정확도를 갖는 보정된 피드백 제어 압압 액추에이터에 의해 Z 및 X-Y 축으로 이동하더라도 나노피펫 팁의 직경은 전류(감지 부피)의 확산을 결정하고 따라서해상도(그림 1A). 따라서, 살아있는 헤어 세포를 이미징하기 전에, 적절한 파이펫을 당기고, 교정 샘플로 원하는 해상도에 도달하고, 기록 시스템에서 낮은 잡음을 달성하는 것이 중요합니다.

적어도 수십 년 동안, SICM 기술은 상용화되지 않았으며 영국 제국 대학의 Korchev 교수의 선도적 인 실험실과 함께 세계에서 몇 실험실만 개발하고 있습니다. 최근에는 여러 SICM 시스템이 상용화되었습니다(재료 표참조), 이 모든 시스템은 원래 HPICM 원칙을 기반으로 합니다. 그러나, 헤어 셀에서 이미징 스테레오실리아 번들 은 폐쇄된 "즉시 이동" 시스템에서 기술적으로 도전적이거나 불가능한 몇 가지 사용자 지정 수정이 필요합니다. 따라서 일부 구성 요소 통합이 필요합니다. HPICM 설정은 보다 엄격한 진동 및 드리프트 요구 사항과 HPICM 프로브및샘플(그림 1D)의압조 구동 이동을 갖춘 패치 클램프 리그를 나타내기 때문에 패치 클램핑에 능숙한 모든 연구원에게 이러한 통합이 비교적 쉽습니다. 그러나 적절한 배경이없는 과학자는 전기 생리학에 대한 교육이 먼저 필요합니다. 이미징 속도 증가와 같은 남은 과제에도 불구하고(토론참조), 우리는 나노 스케일 해상도로 살아있는 모발 세포에서 스테레오실리아 번들을 손상시키지 않고 이미지화할 수 있었습니다.

이 논문은 우리의 사용자 정의 시스템을 사용하여 젊은 산후 쥐 또는 마우스 달팽이관 이출에 있는 살아있는 청각 머리 세포 번들의 성공적인 HPICM 화상 진찰을 능력을 발휘하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 통합 된 구성 요소는 재료표에나열됩니다. 이 논문은 또한 발생할 수 있는 일반적인 문제와 문제를 해결하는 방법에 대해서도 설명합니다.

프로토콜

연구 결과는 건강의 국가 학회의 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 지침에 있는 권고에 따라 수행되었습니다. 모든 동물 절차는 켄터키 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 00903M2005).

1. 나노 피펫제조 및 테스트

1. 마이크로피펫 풀러에 프로그램을 만들어 약 50-70 nm의 내부 팁 직경에 해당하는 200MΩ에서 400 MΩ 사이의 저항을 가진 파이펫을 얻습니다. 매개 변수는 마이크로 피펫 풀러에 따라 달라집니다. 유연한 미세 팁이 없는 짧은 파이펫을 얻으려면 풀러의 작동 매뉴얼을 체크 인하십시오.
2. 1/0.58mm의 외부/내지 직경의 보로실리케이트 유리 모세혈관과 내부 필라멘트를 사용하여 충전을 용이하게 합니다. 파이펫의 측면 기계적 공명 빈도를 결정하기 때문에 파이펫의 길이가 중요합니다. 파이펫이 길수록 공진 주파수가 낮아지고 이 공명을 피하기가 더 어려워집니다.
   참고: 사용자는 홀더가 수락할 수 있는 가장 짧은 파이펫을 제조해야 합니다. 이 실험에서 나노피펫의 길이는 일반적으로 15-25mm(도 2A)이다.
3. 나노피펫을 중간 지점(그림2A)까지목욕 용액, 라이보비츠의 L-15 또는 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)으로 20mM D-포도당(발진을 조정)으로 채웁니다. 잠재적인 유물을 피하려면 욕조에서 녹음에 사용되는 것과 동일한 솔루션을 사용하십시오.
4. 10배배감이 있는 광학 현미경을 사용하여 파이펫 끝에 있는 모든 기포(도2B)를확인한다. 거품은 전류 흐름을 방지할 수 있습니다. 실험 전에 몇 시간 전에 뽑은 파이펫의 거품을 제거하기가 어렵습니다. 따라서 모든 실험으로 새 파이펫을 당기는 것이 좋습니다.
5. 파이펫이 거품이 없는 후 HPICM 파이펫홀더(그림 2C)에장착하십시오.
6. 시료(조직 또는 교정 표준)를 맞춤형 챔버에 놓고 위에서 언급한 목욕 용액의 4mL를 추가합니다.
7. HPICM 단계에 맞춤형 챔버를 배치하고 솔루션에 접지 전극을 소개합니다.
8. 패치 클램프 증폭기의 파이펫에 적용되는 전압이 0인지 확인합니다.
9. 액체에 닿을 때까지 파이펫을 Z로 이동합니다.
10. 앰프 오프셋을 0으로 설정한 다음 +100 mV를 추가하여 파이펫 전류를 확인합니다.
11. 옴의 법칙에 따라 피펫의 저항과 직경을 계산합니다.
    R = V/I
    여기서 R은 저항(MOhm), V는 나노피펫(mV)에 가해지는 전압이고 나노피펫(nA)을 통해 흐르는 전류이다.
    1. 다음^{공식(12)에}따라 다른 곳에서 설명한 바와 같이 파이펫의 내경을 계산합니다.
       ID_팁 = 1000/ √R
       참고: 이상적인 저항 값은 200MΩ에서 400MΩ 사이입니다. 400MΩ 이상의 저항성을 가진 파이펫은 작은 크기(< 50nm 내경)으로 인해 불안정한 전류로 이어질 수 있습니다. 반대로 200MΩ보다 작은 저항이 있는 파이펫은 너무 크며(70nm 내경 >)이며 작은 특징을 해결하지 는 않습니다. 200MΩ 저항의 파이펫으로 이미징을 시작하는 것이 좋습니다, 그들은 제조하기 쉽고 적은 전기 소음을 제공하는 경향이있다.

2. 샘플 드리프트 및 진동 최소화

참고: 이미징 중 시스템의 기계적 소음을 줄이려면 두꺼운 유리 슬라이드(~1.2mm)를 활용하는 맞춤형 챔버에 샘플을 장착합니다.

1. 50mm 유리 바닥 접시에서 유리 부분을 제거하고 플라스틱 벽을 그대로 둡니다.
2. 실리콘 접착제로 두꺼운 유리 슬라이드 위에 세포 배양 접시의 플라스틱 부분을 접착제.
3. 실리콘 접착제 또는 얇은 양면 테이프를 사용하여 챔버 의 중간에 교정 샘플을 장착 (유리 슬라이드의 상단에).
4. 양면 테이프를 사용하여 HPICM 단계에 챔버를 단단히 고정합니다.
5. 이미징 하는 동안, 패라데이 케이지를 닫고 그에 상응하는 전기 간섭 및 열 드리프트를 최소화하기 위해 담요로 덮습니다.

3.AFM 교정 표준으로 해상도 테스트

참고: 시스템을 문제 해결하고 X-Z-Y 축에서 해상도를 테스트하기 위해 라이브 셀을 이미징하기 전에 AFM 표준(재료 표참조)을 이미지화하는 것이 좋습니다. 교정 표준에는 5 x 5mm 실리콘 칩에 실리콘 이산화소및 다양한 모양의 구멍이 있지만 고정 높이/깊이(예: 20 또는 100 nm)가 있습니다. 100nm 교정 표준을 시작으로 Z 해상도가 100nm 미만임을 보장하는 것이 좋습니다. 이 교정샘플(도 3A)에서기둥 또는 구멍의 성공적인 고해상도 이미지를 달성한 후 20nm 표준으로 이동한다. 후자의 표준의 이미징이 성공하면(도3B),Z 축의 해상도는 20nm 이하로 보장되고 모발 세포 스테레오실리아 번들(12)의 이미징에 적합하다. 다음 단계는 두 교정 표준을 모두 이미지화하는 데 사용됩니다.

1. 실리콘 접착제로 교정 표준을 챔버에 부착합니다.
2. 교정 샘플을 커버하기 위해 챔버에 HBSS 4 mL을 추가합니다. 그런 다음 양면 테이프를 사용하여 HPICM 설정의 XY 단계로 챔버를 고정합니다.
3. 지상 전극의 마그네틱 홀더를 챔버 근처의 스테이지로 고정하고 전극을 목욕 용액(도1B)에침수합니다.
4. 나노피펫을 홀더에 넣고 목욕 용액에 담그고 1항에 설명된 단계에 따라 전류를 ~1nA로 설정한다.
5. 코스 패치 클램프 조작기로 교정 표준의 중심 위에 나노피펫을 배치합니다. 이산화규소 구조로 덮인 영역이 상대적으로 크기 때문에 육안 검사는 일반적으로 이 위치 지정에 충분합니다(1 x 1mm). Corti 각성의 장기와 는 달리 (아래 참조), 교정 표준은 투명하지 않으며, 따라서 광학 이미징에 의해 유도되는 보다 정밀한 위치는 이 샘플에 대해 불가능합니다.
6. 오실로스코프에서 Z 압압 액추에이터의 센서로부터 신호를 실시간으로 모니터링하면서 세트점을 늘립니다. 안정적인 반복 가능한 Z 접근 주기를 설정한 후(그림 1C,아래쪽)에서와 같이, 불안정점 바로 위에 있는 값으로 설정점을 줄입니다. 이 절차는 이 특정 나노피펫에 대한 최적의 설정점을 보장합니다.
7. 피펫을 시료에 도달할 때까지 패치 클램프 미세 조작기로 ~5 μm/s의 속도로 피펫을 아래로 이동합니다. 이 때, 실시간 Z 위치신호(도 1C)의바닥 수준이 증가하여 나노피펫이 샘플 표면을 "감지"하여 철회되었음을 나타냅니다. 나노 피펫의 추가 움직임은 Z 위치 신호의 추가 긍정적 인 변화를 초래할 것이다.
   참고: Z 압압 액추에이터 운동의 상한을 초과하지 않도록 주의하십시오.
8. 저해상도에서 이미징을 시작합니다(표 1참조). AFM 표준의 고르지 않은 장착으로 인해 관심 영역의 가장 높은 지점은 알 수 없습니다. 따라서 파이펫 리트랙션(홉 진폭)의 진폭을 최소 200-500 nm로 설정합니다.
   1. 이미징 영역에서 샘플의 가장 높은 지점이 확인되면 홉 진폭을 줄입니다. 더 작은 홉 진폭은 더 빠른 스캐닝을 가능하게 하며, 이는 드리프트의 감소 효과와 진동 감소로 인해 고해상도 이미징에 선호됩니다.
9. 파이펫을 새로운 X-Y 위치로 이동하기 전에 Z 축에서 약 200 μm을 회수하여 샘플과의 원치 않는 충돌을 방지합니다.
   참고: 나노피펫이 교정 표준의 중심과 일치하지 않는 경우, 스캐닝이 표면 피쳐의 영역에서 바로 벗어날 수 있습니다.
10. 관심 영역이 발견되면 더 높은 해상도에서 이미징을 시작합니다(표 1참조).

4. 달팽이관 이절을 확보하기 위해 맞춤형 챔버 만들기

참고: 유연한 유리 파이펫(4.1단계)또는치실(4.2단계)(도 4B)를활용하는 맞춤형 클램핑 시스템을 갖춘 챔버내의 달팽이관을 탑재한다. 유리 파이펫 챔버는 소독및 코르티의 배양 기관에 사용될 수 있으며, 치과 치실 챔버는 마운팅 시 시료의 보다 안전한 유지 및 스테레오실리모들 방향을 제어합니다. 이러한 맞춤형 챔버는 사전에 준비해야 하지만 여러 이미징 세션에서 세척하고 다시 사용할 수 있습니다.

1. 유연한 유리 파이펫을 사용하여 챔버 만들기
   1. 파이펫 풀러를 사용하여 유리 모세 혈관에서 얇고 유연한 유리 섬유 두 개를 당깁니다. 당겨진 유리 섬유는 일반적으로 길이가 1~2cm이며 매우 유연합니다.
   2. 유리 커버슬립 위에 실리콘 엘라스토머를 조금 떨어뜨립니다. 직경 2cm의 커버립을 사용하십시오.
   3. 실리콘 드롭에 두 개의 유리 섬유의 끝을 놓고 그들 사이의 분리의 작은 정도를 가지고 섬유를 배열(도 4A).
   4. 커버슬립을 핫 플레이트에 놓고 엘라스토머(1~3분)를 빠르게 치료합니다.
   5. 실리콘 엘라스토머의 소량(1-3 μL)을 사용하여 섹션 2에 기술된 챔버의 유리 바닥에 커버슬립을 붙이고 밤새 치료할 수 있도록 합니다.
2. 치실을 사용하여 챔버 만들기:
   1. 50mm 유리 바닥 접시의 유리 부분을 제거하고 플라스틱 벽을 그대로 둡니다. 그런 다음 실리콘 접착제로 1.2mm 두께의 유리 슬라이드 위에 세포 배양 접시의 플라스틱 부분을 접착제로 붙입니다.
   2. 챔버 의 중앙에 동일한 접착제와 하나의 플라스틱 커버 슬립 (6.5 x 6.5 mm)를 마운트합니다. 그런 다음 이전 커버슬립 위에 다른 커버슬립으로 프로세스를 반복합니다.
   3. 실리콘 접착제와 함께 두 개의 작은 텅스텐 또는 금 도금 와이어 (길이 12mm 및 직경 ~0.5 mm)를 마운트, 커버 슬라이드의 반대쪽에 각각 하나. 커버슬라이드(그림 4B)에서충분히 (> 10-15mm)까지 접착제를 붙입니다.
   4. 두 개의 치실 가닥을 분리하고 커버 슬라이드 위에 놓고 매듭을 만들어 전선에 고정하십시오. 두 가닥(그림4B,짧은 화살표)사이에 작은 간격을 둡니다.
3. 사용 후 챔버 청소
   1. 미세 핀셋을 사용하여 챔버에서 조직을 부드럽게 제거하고 남은 조직 잔류물을 가볍게 긁어냅니다.
   2. 챔버를 70% 에탄올로 먼저 헹구고 증류수로 헹구습니다.
   3. 필요한 경우 헹기 주기를 반복합니다.
   4. 다음 실험이 끝날 때까지 챔버를 필터 용지에 거꾸로 놓습니다. 챔버는 코르티의 장기의 배양이 이미징 후 계획되지 않는 한 살균 될 필요가 없습니다.

5. 코르티의 설치류 기관을 해부

1. 다른 곳에서 자세히 설명된 바와 같이 젊은 산후 달팽이관 축출의 해부를 수행^13.
2. HPICM 이미징의 경우, 산후 일 3 과 6 (P3-6) 사이의 마우스에서 코르티의 장기를 해부하고 산후 일 3 과 8 (P3-8) 사이의 쥐로부터 해부하십시오.
   참고: 오래된 모발 세포는 해부 도중 손상에 더 취약하기 때문에, 따라서, 시간 경과 HPICM 화상 진찰을 위해 사용할 수 없습니다.
3. HPICM 이미징 전에 지각 막을 제거하는 것을 잊지 마십시오.
4. 해부 직후, 제4항에 기술된 챔버 중 하나에 조직을 고정하고, 유연한 유리 파이펫 또는 2개의 치실 가닥 아래에 배치한다(도4). 이 챔버를 실내 온도 목욕 용액의 4mL로 미리 채우면 (거품 형성을 최소화하십시오).

6. 청각 모발 세포의 이미징

1. 양면 테이프를 사용하여 X-Y 압전 단계에 코르티의 갓 분리 된 오르간챔버를 마운트하고 X 및 Y 축(도 1B)에서챔버 드리프트를 최소화하기 위해 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오.
2. 섹션 1의 단계를 수행하여 새로운 나노피펫을 배치하고 올바른 파이펫 저항성을 확인합니다.
3. 패치 클램프 마이크로 조작기를 사용하여, 코르티의 장기를 관찰하면서, 모발 세포 부위 에 나노 피펫을 배치, 반전 현미경에 소비.
4. 오실로스코프(도 1C)의실시간 전류 및 Z 위치 신호를 기록하여 시스템이 0.5% 이하의 설정점으로 안정적인지 확인합니다. Z 신호가 안정적이지 않으면 패치 클램프 증폭기의 로우패스 필터의 차단 주파수를 줄이십시오. 그러나, Z 압압 액추에이터의 응답 시간보다 낮을 수 없다(지연된 전류 판독값으로 인해 샘플과의 파이펫 충돌을 피하기 위해).
   참고: 실제로이 필터의 5 kHz 설정이 최적의 것으로 나타났습니다. Z 신호가 여전히 불안정한 경우 나노 피펫을 교체하는 것이 좋습니다.
5. 안정적인 레코딩이 완료되면, 최적의 설정점을 결정하고 위의 단계 3.6-3.7에 설명된 바와 같이 HPICM 파이펫으로 시료에 접근한다.
6. 먼저, 최소 6~8μm의 홉 진폭을 사용하여 저해상도 이미징(표 1참조)을 수행합니다. 헤어 셀 스테레오실리와 같은 키가 큰 구조를 이미지하기 위해 홉 진폭이 이러한 구조와의 충돌을 피하기에 충분한지 확인하십시오.
   참고: 홉 진폭이 충분하지 않으면 파이펫이 스테레오실륨 위로 점프할 수 없으며 충돌이 임박할 것입니다. 스테레오실륨을 가진 HPICM 프로브의 충돌은 모발 번들을 손상시킬 수 있다. 따라서 스테레오실리고 번들의 높이가 불확실한 경우 더 큰 홉 진폭을 사용하십시오.
7. 먼저 전자 현미경 검사(그림 5)로얻은 이미지를 수행 및 / 또는 연구하여 코르티 기관의 지형에 익숙해.
   참고: HPICM 이미지가 모든 이미징 포인트에서 1 μm보다 작은 높이로 균일한 경우 파이펫은 조직이 아닌 유리 바닥을 스캔할 가능성이 높습니다. 대안적으로, 파이펫은 머리 세포로부터 멀리, 달팽이관 의 다른 영역에 "토지"할 수 있습니다.
8. 파이펫을 새로운 X-Y 위치로 이동해야 하는 경우 조직 내의 키가 큰 특징과의 충돌을 피하기 위해 약 500nm를 철회하십시오. 모발 세포에 대한 관심 영역이 발견될 때까지 저해상도 HPICM 이미징을 반복합니다.
9. 관심 영역이 발견되면 더 높은 해상도에서 이미징을 시작합니다(표 1참조). 전체 헤어 번들을 이미징 할 때 15 분 미만을 보내십시오.
   참고: 살아있는 조직에 있는 머리 세포 묶음은 아직도 아닙니다 그러나 그들의 방향을 바꿀 수 있습니다, 예를 들면, 근본적인 지지 세포의 모양 변경 때문에. 따라서 이미지 수집이 너무 느리면 이미지가 무브먼트 아티팩트를 나타낼 수 있습니다.
10. 고해상도 이미징을 위한 홉 진폭을 감소하기 전에 저해상도 이미지에서 가장 높은 기능을 다시 결정합니다. 전체 헤어 셀 번들을 덮는 관심 영역의 경우 홉 진폭을 4-5 μm로 줄이고 번들 내의 비교적 작고 "평평한" 영역(예: 2 x 2 μm)의 경우 홉 진폭을 1 μm 미만으로 더욱 감소시켜 이미징의 속도와 해상도를 증가시킵니다.

7. 이미지 처리

참고: 이미징 유물은 HPICM 이미징에서 일반적입니다. 그들 중 일부는 이미지 수집 매개 변수에 의해 수정 될 수 있습니다. 여기서 가장 일반적인 유물과 SICM 뷰어로 수정하는 방법을 설명합니다.

1. 경사 보정 수행
   참고: 초보자에게는 분명하지 않지만, 이미징 영역이 전체 경사면이 같거나 큰 경우 사람의 눈은 셀 표면에서 마이크로미터 크기의 피처를 해결할 수없습니다(그림 3A,B,왼쪽). 따라서, 이미지 영역의 평균 경사를 결정(HPICM 3D 이미지 데이터를 단일 평면에 피팅하여) HPICM이미지(그림 3A,B,가운데)에서 빼야 한다.
   1. 열려 있는 사진을 클릭하여 SICM 뷰어로 이미지를 엽니다.
   2. 이미지 보정 탭을 선택합니다.
   3. 올바른 경사 탭을 선택합니다.
   4. 자동 경사 보정을 위해 올바른 경사 버튼을 누릅니다.
2. 라인 정렬 수행
   참고: 앞에서 언급했듯이, 기계적 및/또는 열 드리프트뿐만 아니라 세포 운동 유물은 HPICM 이미징에서 중요한 문제를 나타냅니다. 분당 마이크로미터 미만의 속도를 가진 작은 드리프트는 일반적으로 일반 패치 클램프 설정에서 눈에 띄지 않습니다. 그러나 HPICM 이미징에서 수십 나노미터의 유물을 생산할 수 있으며 이는 HPICM의 해상도보다 훨씬 큽니다. 따라서 이미징 중에 인접한 두 HPICM 스캔 라인 사이의 Z 축에서 갑자기 점프하는 것은 드문 일이 아닙니다. 이러한 인접 검색 줄에서 시작(및/또는 끝) Z 값 간의 차이점을 분석하여 수정할 수 있습니다.
   1. 열려 있는 사진을 클릭하여 SICM 뷰어로 이미지를 엽니다.
   2. 이미지 보정 탭을 선택합니다.
   3. 올바른 경사 탭을 선택합니다.
   4. 정렬할 줄의 너비를 선택합니다. 버튼 버튼을 누르면 ButtonDestripeLineLineFit자동 라인 정렬 보정을 위해 적합합니다.
3. 소음 감소 수행
   참고: HPICM로 이미지를 얻는 동안 나노 피펫 전류의 작은 변동은 특히 낮은 설정점으로 샘플 표면에서 멀리 멈추는 나노 피펫으로 이어질 수 있습니다. 이미지에 작은 흰색 점이 표시됩니다. 이 이미징 아티팩트를 수정하기 위해서는 이미징 포인트를 이웃보다 훨씬 큰 Z 값으로 식별하고 이 값을 이웃의 평균으로 대체할 필요가 있습니다. 조정 가능한 중앙값 필터에 의해 수행됩니다.
   1. 열려 있는 사진을 클릭하여 SICM 뷰어로 이미지를 엽니다.
   2. 이미지 처리 탭을 선택합니다.
   3. 노이즈 감소 탭을 선택합니다.
   4. 픽셀을 제거할 임계값 필터(μm)를 설정합니다.

결과

이 논문에 제시된 프로토콜은 복잡한 지형을 가진 살아있는 세포를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 단계에 따라, 우리는 일상적으로 살아있는 쥐 청각 머리 세포 번들의 이미지를 얻을 수 있습니다(그림 6B,D). SEM 이미지와 비교할 때 X-Y 해상도가 낮음에도 불구하고, 우리의 HPICM 이미지는 입체화의 다른 행, 스테레오실리아 팁의 모양, 심지어 인접한 ?...

토론

성공적인 HPICM 이미지를 얻으려면 사용자는 낮은 소음과 낮은 진동 시스템을 구축하고 적절한 파이펫을 제조해야합니다. 우리는 강력하게 어떤 라이브 세포 이미징을 수행하기 전에 시스템의 안정성을 테스트하기 위해 AFM 교정 표준의 사용을 권장합니다. 시스템의 해상도가 테스트되면 사용자는 라이브 셀 이미징을 시도하기 전에 이미징 설정에 익숙해지기 위해 Corti 샘플의 고정 기관을 이미징?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analog oscilloscope	B&K Precision	2160C	Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach
AFM calibration standards	TED PELLA Inc	HS-100MG; HS-20MG	These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system
Benchtop vibration Isolator	AMETEK/TMC	Everstill K-400	Active vibration isolation
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments (WPI)	1B100F-4	Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	To be added to the bath solution to adjust osmolarity
Digitizer	National Instruments Corporation	PCI-6221	Multi-channel input/output digitizer
Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement	Standford Research Systems	SIM900, SIM960, SIM980	Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.
Faraday cage	AMETEK/TMC	Type II	Required to shield electromagnetic interference
Glass bottom dish	World Precision Instruments (WPI)	FD5040-100	Used as the dish for the chamber for the tissue
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	14025092	Extracellular (bath) solution
Instrumentation amplifier	Brownlee Precision	Model 440	Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation
Laser-based micropipette puller	Sutter Instrument	P-2000/G	Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.
Lebovitz's L-15, without phenol red	Gibco, Thermo Fisher Scientific	21083027	Extracellular (bath) solution
Micromanipulator	Scientifica	PatchStar	Used for "course" positioning of the Z piezo actuator
Microscope	Nikon	Eclipse TS100	Inverted optical microscope
Patch amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B	The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette
Piezo amplifier (XY axes)	Physik Instrumente (PI)	E-500.00, E-505.00, E-509.C2A	Amplification and PID control for XY piezo translation stage
Piezo amplifier (Z axis)	Piezosystem jena	ENT 400 & 800	Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA
Plastic Coverslips	TED PELLA Inc	26028	Used in the fabrication of the chambers for the tissue
SICM controller & software*	Ionscope, UK (ionscope.com)	N/A	Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd
Silicone elastomer (Sylgard)	World Precision Instruments (WPI)	SYLG184	Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue
Silicon glue	The Dow Chemical Company	734	Used to glue the different parts of the chamber for the tissue
Tungsten rod	A-M Systems	717500	Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue
XY piezo nanopositioner	Physik Instrumente (PI)	P-733.2DD	XY translation stage with capacitive sensors
Z piezo nanopositioner	Piezosystem jena	RA 12/24 SG	Ring piezoactuator with a strain gage sensor
*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:  NX12-Bio and NX10 SICM,
Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original
HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically
challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one
modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.