Stereozilien-Bündelbildgebung mit nanoskaliger Auflösung in lebenden Säugetier-Hörhaarzellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für die Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM) vor, eine berührungslose Scanning-Sondentechnik, die die nanoskalige Abbildung von Stereozilienbündeln in lebenden auditiven Haarzellen ermöglicht.

Zusammenfassung

Innenohr-Haarzellen detektieren schallinduzierte Verschiebungen und wandeln diese Reize in elektrische Signale in einem Haarbündel um, das aus Stereozilien besteht, die in reihen zunehmender Höhe angeordnet sind. Wenn Stereozilien abgelenkt werden, ziehen sie an winzigen (~ 5 nm Durchmesser) extrazellulären Spitzenverbindungen, die Stereozilien miteinander verbinden, die Kräfte zu den mechanosensitiven Transduktionskanälen transportieren. Obwohl die Mechanotransduktion in lebenden Haarzellen seit Jahrzehnten untersucht wird, können die funktionell wichtigen ultrastrukturellen Details der Mechanotransduktionsmaschinerie an den Spitzen der Stereozilien (wie z.B. Tip-Link-Dynamik oder transduktionsabhängiges Stereozilien-Remodeling) immer noch nur in toten Zellen mit Elektronenmikroskopie untersucht werden. Theoretisch haben Rastersondentechniken wie die Rasterkraftmikroskopie eine ausreichende Auflösung, um die Oberfläche von Stereozilien sichtbar zu machen. Unabhängig vom Bildgebungsmodus beschädigt jedoch selbst der geringste Kontakt der rasterkraftmikroskopischen Sonde mit dem Stereozilienbündel in der Regel das Bündel. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die Hopping-Probe-Ionenleitfähigkeitsmikroskopie (HPICM) Bildgebung von lebenden auditiven Nagetierhaarzellen. Diese berührungslose Scanning-Sondentechnik ermöglicht die Zeitraffer-Bildgebung der Oberfläche lebender Zellen mit einer komplexen Topographie, wie Haarzellen, mit einer Auflösung von nur einem Nanometer und ohne physischen Kontakt mit der Probe. Das HPICM verwendet einen elektrischen Strom, der durch die Glasnanopipette fließt, um die Zelloberfläche in unmittelbarer Nähe zur Pipette zu erfassen, während ein piezoelektrisches 3D-Positionierungssystem die Oberfläche abtastet und ihr Bild erzeugt. Mit HPICM waren wir in der Lage, Stereozilienbündel und die Verbindungen, die Stereozilien in lebenden auditiven Haarzellen miteinander verbinden, mehrere Stunden lang ohne merkliche Schäden abzubilden. Wir gehen davon aus, dass der Einsatz von HPICM eine direkte Erforschung ultrastruktureller Veränderungen in den Stereozilien lebender Haarzellen ermöglichen wird, um deren Funktion besser zu verstehen.

Einleitung

Trotz der Tatsache, dass Stereozilienbündel in den auditiven Haarzellen groß genug sind, um durch optische Mikroskopie sichtbar gemacht und in einem Patch-Clamp-Experiment in lebenden Zellen abgelenkt zu werden, konnten die wesentlichen strukturellen Komponenten der Transduktionsmaschinerie wie Spitzenverbindungen nur mit der Elektronenmikroskopie in toten Zellen abgebildet werden. In den Säugetier-Hörhaarzellen befindet sich die Transduktionsmaschinerie an den unteren Enden der Spitzenverbindungen, d.h. an den Spitzen der kürzeren Reihe Stereozilien¹ und wird lokal durch die Signalübertragung an den Spitzen der Stereozilien^2,3reguliert. Eine markierungsfreie Abbildung der Oberflächenstrukturen an dieser Stelle in lebenden Haarzellen ist jedoch aufgrund der geringen Größe von Stereozilien nicht möglich.

Die Cochlea von Säugetieren hat zwei Arten von auditiven Sinneszellen: innere und äußere Haarzellen. In den inneren Haarzellen sind Stereozilien länger und dicker als in den äußeren Haarzellen⁴. Die erste und zweite Reihe von Stereozilien haben einen Durchmesser von 300-500 nm in inneren Haarzellen von Mäusen oder Ratten. Durch die Beugung des Lichts beträgt die maximale Auflösung, die mit einer markierungsfreien optischen Mikroskopie erreicht werden kann, etwa 200 nm. Daher ist die Visualisierung einzelner Stereozilien in der ersten und zweiten Reihe des inneren Haarzellbündels mit der optischen Mikroskopie relativ einfach. Im Gegensatz dazu haben kürzere Stereozilien in den inneren Haarzellen und alle Stereozilien der äußeren Haarzellen Durchmesser um 100-200 nm und können mit optischer Mikroskopie nicht sichtbar gemacht werden⁵. Trotz der jüngsten Fortschritte bei der hochauflösenden Bildgebung besteht diese grundlegende Einschränkung bei jeder optischen, markierungsfreien Bildgebung fort. Alle derzeit kommerziell erhältlichen Superauflösungstechniken erfordern eine Art fluoreszierende Moleküle⁶, was ihre Anwendungen einschränkt. Zusätzlich zu den Einschränkungen aufgrund des Bedarfs an spezifischen fluoreszenzmarkierten Molekülen hat sich gezeigt, dass die Exposition gegenüber intensiver Lichtbestrahlung zelluläre Schäden induziert und zelluläre Prozesse beeinflussen könnte, was bei der Untersuchung lebender Zellen ein großer Nachteil ist⁷.

Unser aktuelles Wissen über die ultrastrukturellen Details von Haarzell-Stereozilienbündeln wurde hauptsächlich mit verschiedenen Elektronenmikroskopietechniken (EM) wie Rasterelektronenmikroskopie (REM), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Gefrierbruch-EM und kürzlich mit 3D-Techniken wie seriellem Schnitt mit fokussiertem Ionenstrahl oder Kryo-EM-Tomographie^8,9^{,10,11,12,13, 14,15,16}. Leider erfordern alle diese EM-Techniken eine chemische oder Kryofixierung der Probe. Abhängig von der Zeitskala der Phänomene macht diese Anforderung eine Untersuchung der dynamischen Prozesse an den Spitzen der Stereozilien entweder unmöglich oder sehr arbeitsintensiv.

Es wurden begrenzte Anstrengungen unternommen, um Haarbündel lebender Haarzellen mit Rasterkraftmikroskopie (AFM)^{abzubilden 17,18}. Da AFM in physiologischen Lösungen arbeitet, könnte es theoretisch dynamische Veränderungen in den Stereozilienbündeln lebender Haarzellen im Laufe der Zeit visualisieren. Das Problem liegt in den Prinzipien des hochauflösenden AFM, das einen gewissen physikalischen Kontakt zwischen der AFM-Sonde und der Probe impliziert, selbst im am wenigsten schädlichen "Tapping" -Modus¹⁹. Wenn die AFM-Sonde auf ein Stereocilium trifft, prallt sie normalerweise dagegen und beschädigt die Struktur des Haarbündels. Infolgedessen ist diese Technik nicht geeignet, um lebende oder sogar feste Haarzellenbündel^{17,18 zu visualisieren.} Das Problem kann teilweise durch die Verwendung einer großen kugelförmigen AFM-Sonde gelindert werden, die nur hydrodynamische Kräfte auf die Oberfläche der Probe ausübt²⁰. Obwohl eine solche Sonde ideal geeignet ist, um die mechanischen Eigenschaften der Probe²¹zu testen, liefert sie bei der Abbildung des Corti^22-Organs nur eine Auflösung im Submikrometerbereich und übt dennoch eine Kraft auf die Probe aus, die für die hochempfindlichen Stereozilienbündel erheblich sein kann.

Die Rasterionenleitwertmikroskopie (SICM) ist eine Version der Rastersondenmikroskopie, bei der eine Glaspipettensonde verwendet wird, die mit einer leitfähigen Lösung gefüllt ist²³. SICM erkennt die Oberfläche, wenn sich die Pipette der Zelle nähert und der elektrische Strom durch die Pipette abnimmt. Da dies lange vor dem Berühren der Zelle geschieht, eignet sich das SICM ideal für die berührungslose Bildgebung lebender Zellen in physiologischer Lösung²⁴. Die beste Auflösung von SICM liegt in der Größenordnung von einzelnen Nanometern, was die Auflösung einzelner Proteinkomplexe an der Plasmamembran einer lebenden Zelle^{ermöglicht 25}. Ähnlich wie andere Rastersondentechniken ist SICM jedoch in der Lage, nur relativ flache Oberflächen abzubilden. Wir haben diese Einschränkung überwunden, indem wir das Hopping-Probe-Ionenleitfähigkeitsmikroskop (HPICM)²⁶erfunden haben, bei dem sich die Nanopipette an jedem Bildgebungspunkt der Probe nähert (Abbildung 1A). Mit HPICM konnten wir Stereozilienbündel in lebenden auditiven Haarzellen mit nanoskaliger Auflösung^{27 abbilden.}

Ein weiterer grundlegender Vorteil dieser Technik ist, dass HPICM nicht nur ein bildgebendes Werkzeug ist. Im Gegensatz zu anderen Rastersondentechniken ist die HPICM/SICM-Sonde eine Elektrode, die in der Zellphysiologie für elektrische Aufzeichnungen und die lokale Abgabe verschiedener Reize weit verbreitet ist. Die Ionenkanalaktivität stört die HPICM-Bildgebung normalerweise nicht, da der Gesamtstrom durch die HPICM-Sonde um mehrere Größenordnungen größer ist als der extrazelluläre Strom, der von den größten Ionenkanälen erzeugt wird²⁵. HPICM ermöglicht jedoch die präzise Positionierung der Nanopipette über einer interessierenden Struktur und die anschließende einkanalige Patch-Clamp-Aufzeichnung von dieser Struktur²⁸. So erhielten wir die ersten Voraufnahmen der Einkanalaktivität an den Spitzen der äußeren Haarzelle Stereozilien²⁹. Es ist erwähnenswert, dass selbst ein großer Strom durch die Nanopipette aufgrund des enormen elektrischen Shunts des extrazellulären Mediums keine signifikanten Änderungen des Potentials über die Plasmamembran erzeugen kann. Einzelne Ionenkanäle können jedoch mechanisch durch Flüssigkeitsfluss durch die Nanopipette³⁰ oder chemisch durch lokale Anwendung eines Agonisten³¹aktiviert werden.

In HPICM wird das Bild erzeugt, wenn sich eine Nanopipette an einem Punkt sequentiell der Probe nähert, sich zurückzieht und sich dann in lateraler Richtung bewegt, um die Annäherung zu wiederholen (Abbildung 1A). Ein Patch-Clamp-Verstärker legt ständig Spannung an einen AgCl-Draht in der Pipette an (Abbildung 1B), um einen Strom von ~ 1 nA in der Badlösung zu erzeugen. Der Wert dieses Stroms, wenn die Pipette von der Oberfläche der Zelle entfernt ist, wird als Referenzstrom bestimmt (I_ref, Abbildung 1C). Dann bewegt sich die Pipette in der Z-Achse, um sich der Probe zu nähern, bis der Strom um einen vom Benutzer vordefinierten Betrag (Sollwert) reduziert wird, normalerweise 0,2% -1% der _I-Referenz (Abbildung 1C,obere Spur). Das System speichert dann in diesem Moment den Z-Wert als Höhe der Probe zusammen mit X- und Y-Koordinaten dieses Abbildungspunkts. Dann wird die Pipette von der Oberfläche weggezogen(Abbildung 1C,untere Spur) mit einer vom Benutzer definierten Geschwindigkeit, normalerweise 700-900 nm/ms. Nach dem Zurückziehen wird die Pipette (oder in unserem Fall die Probe - siehe Abbildung 1B) seitlich zum nächsten Bildgebungspunkt bewegt, ein neuer Referenzstromwert wird erhalten, und die Pipette nähert sich erneut der Probe und wiederholt den Vorgang. Die X-Y-Bewegung der Pipette wird in einem aufrechten Mikroskopaufbau bevorzugt, der typischerweise für Aufzeichnungen der Mechanotransduktionsströme der Haarzellen verwendet wird. In dieser Einstellung nähert sich die HPICM-Sonde den Haarzellbündeln nicht von oben, sondern in einem Winkel^{von 32}. Die beste Auflösung der HPICM-Bildgebung wird jedoch in einem inversen Mikroskopaufbau (Abbildung 1A,B) erreicht, bei dem die Bewegung der Probe in X-Y-Richtung von der Z-Bewegung der Nanopipette entkoppelt wird, wodurch potenzielle mechanische Artefakte eliminiert werden.

Mit HPICM erhielten wir topographische Bilder von inneren und äußeren Haarzellen-Stereozilienbündeln von Maus und Ratte und visualisierten sogar die Verbindungen zwischen den Stereozilien mit einem Durchmesser von etwa 5 nm^26,27. Der Erfolg der Haarzellbündelbildgebung mit dieser Technik hängt von mehreren Faktoren ab. Erstens sollte das Rauschen (Varianz) des Nanopipettenstroms so gering wie möglich sein, um einen möglichst niedrigen Sollwert für die HPICM-Bildgebung zu ermöglichen. Ein niedriger Sollwert ermöglicht es der HPICM-Sonde, die Stereozillenoberfläche in einem größeren Abstand und in jedem Winkel zum Sondenansatz zu "erfassen" und überraschenderweise die X-Y-Auflösung der HPICM-Bildgebung zu verbessern (siehe Diskussion). Zweitens sollten die Vibrationen und Drifts im System auf weniger als 10 nm reduziert werden, da sie direkt zu den bildgebenden Artefakten beitragen. Obwohl die HPICM-Sonde und der Probentisch in der Z- und X-Y-Achse von den kalibrierten rückkopplungsgesteuerten Piezoaktuatoren bewegt werden, die eine Genauigkeit von einem Nanometer oder besser haben, bestimmt der Durchmesser der Nanopipettenspitze die Ausbreitung des Stroms (Erfassungsvolumen) und damit die Auflösung (Abbildung 1A). Daher ist es vor der Bildgebung lebender Haarzellen wichtig, die entsprechenden Pipetten zu ziehen, die gewünschte Auflösung mit Kalibrierproben zu erreichen und ein geringes Rauschen im Aufnahmesystem zu erreichen.

Seit mindestens ein paar Jahrzehnten ist die SICM-Technik nicht mehr kommerziell verfügbar und wurde nur von wenigen Labors auf der Welt mit dem führenden Labor von Prof. Korchev am Imperial College (UK) entwickelt. In jüngster Zeit sind mehrere SICM-Systeme kommerziell verfügbar geworden (siehe Materialtabelle),die alle auf den ursprünglichen HPICM-Prinzipien basieren. Die Abbildung von Stereozilienbündeln in den Haarzellen erfordert jedoch mehrere kundenspezifische Modifikationen, die in den geschlossenen "ready-to-go"-Systemen technisch anspruchsvoll (oder sogar unmöglich) sind. Daher ist eine gewisse Komponentenintegration erforderlich. Da der HPICM-Aufbau ein Patch-Clamp-Rig mit strengeren Vibrations- und Driftanforderungen und einer piezogetriebenen Bewegung der HPICM-Sonde und der Probe darstellt (Abbildung 1D), ist diese Integration für jeden Forscher, der sich mit Patch-Clamping auskennt, relativ einfach. Ein Wissenschaftler ohne richtigen Hintergrund würde jedoch definitiv zuerst eine Ausbildung in Elektrophysiologie benötigen. Trotz verbleibender Herausforderungen wie der Erhöhung der Bildgebungsgeschwindigkeit (siehe Diskussion)konnten wir Stereozilienbündel in lebenden Haarzellen mit nanoskaliger Auflösung abbilden, ohne sie zu beschädigen.

Dieses Papier stellt ein detailliertes Protokoll vor, um eine erfolgreiche HPICM-Bildgebung der lebenden auditiven Haarzellbündel in jungen postnatalen Ratten- oder Maus-Cochlea-Explantaten mit unserem benutzerdefinierten System durchzuführen. Die integrierten Komponenten sind in der Materialtabelle aufgeführt. In diesem Dokument werden auch häufige Probleme beschrieben, die auftreten können, und wie Sie diese beheben können.

Protokoll

Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren der National Institutes of Health durchgeführt. Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Kentucky genehmigt (Protokoll 00903M2005).

1. Herstellung und Prüfung der Nanopipetten

1. Erstellen Sie im Mikropipettenzieher ein Programm, um Pipetten mit einem Widerstand zwischen 200 und 400 MΩ zu erhalten, was Innenspitzendurchmessern von ca. 50-70 nm entspricht. Die Parameter hängen vom Mikropipettenabzieher ab. Um kurze Pipetten mit unflexiblen Feinspitzen zu erhalten, schauen Sie in der Bedienungsanleitung des Abziehers nach.
2. Verwenden Sie Borosilikatglaskapillaren mit Außen-/Innendurchmessern von 1/0,58 mm und einem inneren Filament, um das Füllen zu erleichtern. Die Länge der Pipette ist entscheidend, da sie die Frequenz der lateralen mechanischen Resonanz der Pipette bestimmt. Je länger die Pipette ist, desto niedriger ist die Resonanzfrequenz und desto schwieriger ist es, diese Resonanz zu vermeiden.
   HINWEIS: Der Benutzer sollte versuchen, die kürzeste Pipette herzustellen, die der Halter aufnehmen kann. Die Länge der Nanopipetten beträgt in diesem Experiment üblicherweise 15-25 mm (Abbildung 2A).
3. Füllen Sie die Nanopipette bis zur Mitte (Abbildung 2A) mit einer Badelösung, entweder Leibovitz's L-15 oder mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), ergänzt mit 20 mM D-Glucose (zur Einstellung der Osmolarität). Um potenzielle Artefakte zu vermeiden, verwenden Sie die gleiche Lösung, die im Bad für Aufnahmen verwendet wird.
4. Überprüfen Sie mit einem optischen Mikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerung auf Blasen an der Spitze der Pipette (Abbildung 2B). Die Blasen würden den Stromfluss verhindern. Es ist schwieriger, Blasen in den Pipetten zu entfernen, die einige Stunden vor dem Experiment gezogen wurden. Daher wird empfohlen, bei jedem Experiment neue Pipetten zu ziehen.
5. Sobald die Pipette frei von Blasen ist, montieren Sie sie im HPICM Pipettenhalter (Abbildung 2C).
6. Legen Sie die Probe (Gewebe oder Kalibrierstandard) auf die speziell angefertigte Kammer und fügen Sie 4 mL der oben genannten Badelösung hinzu.
7. Stellen Sie die speziell angefertigte Kammer auf die HPICM-Stufe und führen Sie die Masseelektrode in die Lösung ein.
8. Stellen Sie sicher, dass die Spannung, die vom Patch-Clamp-Verstärker an die Pipette angelegt wird, Null ist.
9. Bewegen Sie die Pipette in Z, bis sie die Flüssigkeit berührt.
10. Stellen Sie den Verstärkerversatz auf Null und addieren Sie dann +100 mV, um den Pipettenstrom zu überprüfen.
11. Berechnen Sie den Widerstand und den Durchmesser der Pipette basierend auf dem Ohmschen Gesetz:
    R = V/I
    wobei R der Widerstand (MOhm), V die an die Nanopipette angelegte Spannung (mV) und I der Strom ist, der durch die Nanopipette fließt (nA).
    1. Berechnen Sie den Innendurchmesser der Pipette wie an anderer Stelle beschrieben nach folgender Formel¹²:
       _ID-Tipp = 1000/ √R
       HINWEIS: Der ideale Widerstandswert liegt zwischen 200 und 400 MΩ. Pipetten mit einem Widerstand von mehr als 400 MΩ können aufgrund ihrer geringen Größe (< 50 nm Innendurchmesser) zu einem instabilen Strom führen. Im Gegenteil, Pipetten mit Widerständen kleiner als 200 MΩ sind zu groß (> 70 nm Innendurchmesser) und würden kleine Merkmale nicht auflösen. Es wird empfohlen, mit der Bildgebung mit den Pipetten mit einem Widerstand von 200 MΩ zu beginnen, da sie einfacher herzustellen sind und tendenziell weniger elektrisches Rauschen liefern.

2. Minimierung von Probendriften und Vibrationen

HINWEIS: Um das mechanische Rauschen im System während der Bildgebung zu verringern, montieren Sie die Proben auf den speziell angefertigten Kammern, die dicke Glasobjektträger (~ 1,2 mm) verwenden:

1. Entfernen Sie den Glasanteil von einer 50 mm großen Glasbodenschale und lassen Sie die Kunststoffwände intakt.
2. Kleben Sie den Kunststoffteil der Zellkulturschale mit Silikonkleber auf den dicken Glasträger.
3. Montieren Sie die Kalibrierprobe in der Mitte der Kammer (oben auf dem Glasobjektträger) entweder mit Silikonkleber oder dünnem doppelseitigem Klebeband.
4. Befestigen Sie die Kammer mit doppelseitigem Klebeband fest auf der HPICM-Bühne.
5. Schließen Sie während der Bildgebung den Faradayschen Käfig und bedecken Sie ihn mit einer Decke, um elektrische Störungen und thermische Drift entsprechend zu minimieren.

3.Testen der Auflösung mit AFM-Kalibrierstandards

HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, AFM-Standards (siehe Materialtabelle)abzubilden, bevor Sie lebende Zellen abbilden, um Fehler für das System zu beheben und seine Auflösung in den X-Z-Y-Achsen zu testen. Die Kalibrierstandards haben Siliziumdioxidsäulen und Löcher unterschiedlicher Form, aber feste Höhen/Tiefen (d.h. 20 oder 100 nm) auf einem 5 x 5 mm Großen Siliziumchip. Es wird empfohlen, mit dem 100 nm Kalibrierstandard zu beginnen, um zu gewährleisten, dass die Z-Auflösung unter 100 nm liegt. Nachdem Sie ein erfolgreiches hochauflösendes Bild der Säulen oder Löcher in dieser Kalibrierprobe erhalten haben (Abbildung 3A), wechseln Sie zum 20-nm-Standard. Gelingt die Abbildung des letztgenannten Standards (Abbildung 3B), liegt die Auflösung in der Z-Achse garantiert unter 20 nm und ist für die Abbildung der Haarzell-Stereozilienbündel^{geeignet 12}. Die folgenden Schritte werden verwendet, um beide Kalibrierstandards abzubilden.

1. Befestigen Sie den Kalibrierstandard mit Silikonkleber an der Kammer.
2. Geben Sie 4 ml HBSS in die Kammer, um die Kalibrierprobe abzudecken. Befestigen Sie dann die Kammer mit doppelseitigem Klebeband an der XY-Stufe des HPICM-Setups.
3. Klemmen Sie den Magnethalter der Masseelektrode an die Bühne in der Nähe der Kammer und tauchen Sie die Elektrode in die Badlösung ein (Abbildung 1B).
4. Montieren Sie die Nanopipette in den Halter, tauchen Sie sie in die Badlösung ein und stellen Sie ihren Strom auf ~ 1 nA ein, indem Sie die in Abschnitt 1 beschriebenen Schritte ausführen.
5. Positionieren Sie die Nanopipette mit einem Kurs-Patch-Clamp-Manipulator ungefähr über der Mitte des Kalibrierstandards. Für diese Positionierung reicht in der Regel eine Sichtprüfung aus, da die von Siliziumdioxidstrukturen bedeckte Fläche relativ groß ist (1 x 1 mm). Im Gegensatz zum Organ der Corti-Explantate (siehe unten) ist der Kalibrierstandard intransparent und daher ist eine präzisere Positionierung durch optische Bildgebung für diese Probe nicht möglich.
6. Erhöhen Sie den Sollwert, während Sie das Signal vom Sensor des Z-Piezoaktors auf einem Oszilloskop in Echtzeit überwachen. Nachdem Sie einen stabilen wiederholbaren Z-Ansatzzyklus festgelegt haben (wie in Abbildung 1C, unten), verringern Sie den Sollwert auf den Wert, der knapp über dem Punkt der Instabilität liegt. Dieses Verfahren würde den optimalen Sollwert für diese spezielle Nanopipette gewährleisten.
7. Bewegen Sie die Pipette mit einer Geschwindigkeit von ~ 5 μm/s mit einem Patch-Clamp-Mikromanipulator nach unten, bis sie die Probe erreicht. In diesem Moment nimmt die unterste Ebene des Echtzeit-Z-Positionierungssignals (Abbildung 1C) zu, was darauf hindeutet, dass die Nanopipette aufgrund der "Erfassung" der Probenoberfläche zurückgezogen wird. Jede weitere Bewegung der Nanopipette führt zu einer weiteren positiven Verschiebung des Z-Positionierungssignals.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, die obere Grenze der Z-Piezo-Aktuatorbewegung nicht zu überschreiten.
8. Beginnen Sie mit der Bildgebung mit niedriger Auflösung (siehe Tabelle 1). Aufgrund der ungleichmäßigen Montage des AFM-Standards kann der höchste Punkt des Interessengebiets unbekannt sein. Stellen Sie daher die Amplitude der Pipettenrettraktion (Hopamplitude) auf mindestens 200-500 nm ein.
   1. Sobald der höchste Punkt der Probe im Bildgebungsbereich identifiziert ist, verringern Sie die Hop-Amplitude. Eine kleinere Hop-Amplitude ermöglicht ein schnelleres Scannen, das für hochauflösende Bildgebung aufgrund der verminderten Auswirkungen der Drifts und der verringerten Vibration bevorzugt wird.
9. Bevor Sie die Pipette an eine neue X-Y-Position bewegen, ziehen Sie sie um etwa 200 μm in die Z-Achse ein, um unerwünschte Kollisionen mit der Probe zu vermeiden.
   HINWEIS: In Fällen, in denen die Nanopipette nicht mit der Mitte des Kalibrierstandards ausgerichtet ist, ist es möglich, dass die Abtastung direkt an der Fläche der Oberflächenmerkmale beginnt.
10. Nachdem der Interessenbereich gefunden wurde, beginnen Sie mit der Bildgebung mit einer höheren Auflösung (siehe Tabelle 1).

4. Herstellung maßgeschneiderter Kammern zur Sicherung der Cochlea-Explantate

HINWEIS: Montieren Sie die Cochlea-Explantate in den Kammern mit speziell angefertigten Spannsystemen, die entweder flexible Glaspipetten (Schritt 4.1)(Abbildung 4A)oder Zahnseide (Schritt 4.2) verwenden (Abbildung 4B). Die Glaspipettenkammer könnte sterilisiert und für die kultivierten Organe von Corti verwendet werden, während die Zahnseidekammer eine sicherere Aufbewahrung der Probe und eine Kontrolle über die Ausrichtung der Stereozilienbündel während der Montage bietet. Diese speziell angefertigten Kammern müssen im Voraus vorbereitet werden, aber sie können gereinigt und in mehreren Bildgebungssitzungen wiederverwendet werden.

1. Machen Sie eine Kammer mit flexiblen Glaspipetten
   1. Ziehen Sie mit einem Pipettenzieher zwei dünne und flexible Glasfasern aus Glaskapillaren. Unsere gezogenen Glasfasern sind in der Regel 1 bis 2 cm lang und ziemlich flexibel.
   2. Legen Sie einen kleinen Tropfen des Silikonelastomers auf einen Glasdeckglas. Verwenden Sie Deckgläser mit einem Durchmesser von 2 cm.
   3. Legen Sie die Enden von zwei Glasfasern auf den Silikontropfen und ordnen Sie die Fasern so an, dass sie einen kleinen Abstand zwischen ihnen haben (Abbildung 4A).
   4. Legen Sie den Deckglas auf eine Heizplatte, um das Elastomer schnell auszuhärten (1 bis 3 min).
   5. Kleben Sie den Deckglas mit einer kleinen Menge (1-3 μL) Silikonelastomer auf den in Abschnitt 2 beschriebenen Glasboden der Kammer und lassen Sie ihn über Nacht aushärten.
2. Herstellung einer Kammer mit Zahnseide:
   1. Entfernen Sie den Glasteil einer 50 mm Glasbodenschale und lassen Sie die Kunststoffwände intakt. Kleben Sie dann den Kunststoffteil der Zellkulturschale mit Silikonkleber auf einen 1,2 mm dicken Glasträger.
   2. Montieren Sie einen Kunststoff-Deckglas (6,5 x 6,5 mm) mit dem gleichen Kleber in der Mitte der Kammer. Wiederholen Sie dann den Vorgang mit einem weiteren Deckglas auf dem vorherigen.
   3. Montieren Sie zwei kleine Wolfram- oder vergoldete Drähte (12 mm Länge und ~ 0,5 mm Durchmesser) mit Silikonkleber, die sich jeweils an gegenüberliegenden Seiten der Abdeckschlitten befinden. Kleben Sie sie weit genug (> 10-15 mm) von den Abdeckdias ab (Abbildung 4B).
   4. Trennen Sie zwei Zahnseidestränge und legen Sie sie auf die Abdeckungsobjektträger und befestigen Sie sie an den Drähten, indem Sie einen Knoten bilden. Lassen Sie einen kleinen Spalt zwischen beiden Strängen(Abbildung 4B, kurze Pfeile).
3. Reinigen Sie die Kammern nach jedem Gebrauch
   1. Entfernen Sie das Gewebe vorsichtig mit einer feinen Pinzette aus der Kammer und kratzen Sie zurückgelassene Gewebereste leicht ab.
   2. Spülen Sie die Kammer zuerst mit 70% Ethanol und dann mit destilliertem Wasser ab.
   3. Wiederholen Sie bei Bedarf den Spülzyklus.
   4. Legen Sie die Kammer kopfüber auf ein Filterpapier, um sie bis zum nächsten Experiment trocknen zu lassen. Die Kammern müssen nicht sterilisiert werden, es sei denn, nach der Bildgebung ist eine Kultivierung des Corti-Organs geplant.

5. Das Nagetierorgan von Corti sezieren

1. Führen Sie eine Dissektion der jungen postnatalen Cochlea-Explantate durch, wie an anderer Stelle ausführlich beschrieben¹³.
2. Für die HPICM-Bildgebung sezieren Sie das Corti-Organ von Mäusen zwischen postnatalen Tagen 3 und 6 (P3-6) und von Ratten zwischen postnatalen Tagen 3 und 8 (P3-8).
   HINWEIS: Ältere Haarzellen sind anfälliger für Schäden während der Dissektion und können daher nicht für stundenlange HPICM-Bildgebung verwendet werden.
3. Vergessen Sie nicht, die Tectorialmembran vor der HPICM-Bildgebung zu entfernen.
4. Unmittelbar nach der Dissektion ist das Gewebe in einer der in Abschnitt 4 beschriebenen Kammern zu sichern, indem Sie es entweder unter die flexiblen Glaspipetten oder unter die beiden Zahnseidestränge legen (Abbildung 4). Füllen Sie diese Kammern mit 4 ml der Raumtemperatur-Badlösung vor (um die Blasenbildung zu minimieren).

6. Bildgebung der auditiven Haarzellen

1. Montieren Sie die Kammer mit einem frisch isolierten Corti-Organ auf der X-Y-Piezostufe mit doppelseitigem Klebeband und stellen Sie sicher, dass sie fest befestigt ist, um die Kammerdrift in der X- und Y-Achse zu minimieren (Abbildung 1B).
2. Befolgen Sie die Schritte in Abschnitt 1, um eine neue Nanopipette zu platzieren und den korrekten Pipettenwiderstand zu überprüfen.
3. Positionieren Sie mit einem Patch-Clamp-Mikromanipulator die Nanopipette über der Haarzellregion, während Sie das Organ der Corti-Explant in einem inversen Mikroskop beobachten.
4. Überprüfen Sie, ob das System mit einem Sollwert von 0,5% oder weniger stabil ist, indem Sie den Echtzeitstrom und das Z-Positionierungssignal auf dem Oszilloskop aufzeichnen (wie in Abbildung 1C). Wenn das Z-Signal nicht stabil ist, versuchen Sie, die Grenzfrequenz des Tiefpassfilters des Patch-Clamp-Verstärkers zu verringern. Sie darf jedoch nicht niedriger sein als die Ansprechzeit des Z-Piezoaktors (um eine Pipettenkollision mit der Probe aufgrund verzögerter Strommessungen zu vermeiden).
   HINWEIS: In der Praxis erweist sich die 5-kHz-Einstellung dieses Filters als optimal. Es ist besser, die Nanopipette zu ersetzen, wenn das Z-Signal noch instabil ist.
5. Sobald eine stabile Aufzeichnung erreicht ist, bestimmen Sie den optimalen Sollwert und nähern Sie sich der Probe mit der HPICM-Pipette, wie in den Schritten 3.6-3.7 oben beschrieben.
6. Führen Sie zunächst eine Bildgebung mit niedriger Auflösung (siehe Tabelle 1) mit einer Hop-Amplitude von mindestens 6 bis 8 μm durch. Um hohe Strukturen wie die Haarzellen-Stereozilienbündel abzubilden, stellen Sie sicher, dass die Hop-Amplitude ausreicht, um eine Kollision mit diesen Strukturen zu vermeiden.
   HINWEIS: Wenn die Hop-Amplitude nicht ausreicht, kann die Pipette nicht über ein Stereocilium springen und es kommt zu einer bevorstehenden Kollision. Die Kollision der HPICM-Sonde mit einem Stereocilium kann das Haarbündel schädigen. Verwenden Sie daher in Fällen, in denen die Höhe des Stereozilienbündels unsicher ist, eine größere Hop-Amplitude.
7. Machen Sie sich mit der Topographie des Corti-Organs vertraut, indem Sie zunächst Bilder aus der Rasterelektronenmikroskopie durchführen und/oder studieren (Abbildung 5).
   HINWEIS: Wenn das HPICM-Bild einheitlich ist und die Höhen kleiner als 1 μm in jedem Bildgebungspunkt sind, scannt die Pipette wahrscheinlich den Glasboden und nicht das Gewebe. Alternativ kann die Pipette auf einer anderen Region der Cochlea-Explant, weg von den Haarzellen, "landen".
8. Wenn die Pipette an eine neue X-Y-Position bewegt werden muss, ziehen Sie sie etwa 500 nm ein, um Kollisionen mit hohen Merkmalen im Gewebe zu vermeiden. Wiederholen Sie die HPICM-Bildgebung mit niedriger Auflösung, bis die Region von Interesse mit den Haarzellen gefunden ist.
9. Nachdem der interessierende Bereich gefunden wurde, beginnen Sie mit der Bildgebung mit einer höheren Auflösung (siehe Tabelle 1). Versuchen Sie, weniger als 15 Minuten zu verbringen, wenn Sie sich ein ganzes Haarbündel vorstellen.
   HINWEIS: Die Haarzellbündel im lebenden Gewebe sind nicht still, sondern können ihre Orientierung ändern, beispielsweise aufgrund von Formveränderungen in den darunter liegenden Stützzellen. Daher können die Bilder Bewegungsartefakte aufweisen, wenn die Bildaufnahme zu langsam ist.
10. Bestimmen Sie erneut die höchsten Merkmale in den Bildern mit niedriger Auflösung, bevor Sie die Hop-Amplitude für hochauflösende Bildgebung verringern. Für eine Region von Interesse, die das gesamte Haarzellbündel abdeckt, reduzieren Sie die Hopamplitude auf 4-5 μm, während für einen relativ kleinen und "flachen" Bereich innerhalb des Bündels (z. B. 2 x 2 μm) die Hopamplitude noch weiter auf weniger als 1 μm reduziert wird, wodurch die Geschwindigkeit und Auflösung der Bildgebung erhöht wird.

7. Bildverarbeitung

HINWEIS: Bildgebende Artefakte sind in der HPICM-Bildgebung häufig. Einige von ihnen können durch Bildaufnahmeparameter korrigiert werden, während andere eine Nachbearbeitung entweder mit einem speziellen SICM-Viewer oder mit allgemeineren Datenverarbeitungsprogrammen wie ImageJ oder MatLab erfordern. Hier beschreiben wir die häufigsten Artefakte und wie wir sie mit dem SICM-Viewer beheben.

1. Steigungskorrektur durchführen
   HINWEIS: Es ist für einen Anfänger nicht offensichtlich, aber das menschliche Auge kann Merkmale einer Submikrometergröße an der Oberfläche einer Zelle nicht auflösen, wenn der Bildgebungsbereich eine Gesamtneigung von gleicher oder größerer Größe aufweist(Abbildung 3A,B, links). Daher ist es notwendig, die durchschnittliche Steigung eines abgebildeten Bereichs zu bestimmen (durch Anpassen von HPICM 3D-Bilddaten an eine einzelne Ebene) und vom HPICM-Bild zu subtrahieren(Abbildung 3A,B, Mitte).
   1. Klicken Sie auf Öffnen, um ein Bild mit dem SICM-Viewer zu öffnen.
   2. Wählen Sie die Registerkarte Bildkorrektur aus.
   3. Wählen Sie die Registerkarte Korrekte Steigung aus.
   4. Drücken Sie die Taste Steigung korrigieren, um eine automatische Steigungskorrektur zu erhalten.
2. Linienausrichtung durchführen
   HINWEIS: Wie bereits erwähnt, stellen mechanische und/oder thermische Drifts sowie Zellbewegungsartefakte ein erhebliches Problem in der HPICM-Bildgebung dar. Eine kleine Drift mit einer Geschwindigkeit von weniger als einem Mikrometer pro Minute ist bei einem normalen Patch-Clamp-Setup in der Regel nicht bemerkbar. Dennoch könnte es Artefakte von mehreren zehn Nanometern in der HPICM-Bildgebung erzeugen, was deutlich größer ist als die Auflösung von HPICM. Daher ist es nicht ungewöhnlich, dass während der Bildgebung plötzliche Sprünge in der Z-Achse zwischen zwei benachbarten HPICM-Scanlinien auftreten. Dies könnte korrigiert werden, indem Unterschiede zwischen Start- (und/oder End-) Z-Werten in diesen benachbarten Scanzeilen analysiert werden.
   1. Klicken Sie auf Öffnen, um ein Bild mit dem SICM-Viewer zu öffnen.
   2. Wählen Sie die Registerkarte Bildkorrektur aus.
   3. Wählen Sie die Registerkarte Korrekte Steigung aus.
   4. Wählen Sie die Breite der Linien aus, die ausgerichtet werden sollen. Drücken Sie auf die Taste ButtonDestripeLineFit für eine automatisierte Linienausrichtungskorrektur.
3. Rauschunterdrückung durchführen
   HINWEIS: Bei der Aufnahme von Bildern mit HPICM können kleine Schwankungen des Nanopipettenstroms dazu führen, dass die Nanopipette weit von der Oberfläche der Probe entfernt anhält, insbesondere bei niedrigen Sollwerten. Dies führt zum Auftreten kleiner weißer Punkte im Bild. Um dieses Abbildungsartefakt zu korrigieren, ist es notwendig, die Abbildungspunkte mit dem Z-Wert deutlich größer als den der Nachbarn zu identifizieren und diesen Wert durch einen Durchschnitt der Nachbarn zu ersetzen. Dies geschieht durch einen einstellbaren Medianfilter.
   1. Klicken Sie auf Öffnen, um ein Bild mit dem SICM-Viewer zu öffnen.
   2. Wählen Sie die Registerkarte Bildverarbeitung aus.
   3. Wählen Sie die Registerkarte Rauschunterdrückung aus.
   4. Legen Sie den Schwellenwertfilter (μm) für die zu entfernenden Pixel fest.

Ergebnisse

Das in diesem Artikel vorgestellte Protokoll kann verwendet werden, um lebende Zellen mit komplexer Topographie zu visualisieren. Nach diesen Schritten erhalten wir routinemäßig Bilder von lebenden auditiven Haarzellbündeln der Ratte (Abbildung 6B, D). Trotz der im Vergleich zu REM-Bildern niedrigeren X-Y-Auflösung können unsere HPICM-Bilder die verschiedenen Reihen von Stereozilien, die Form der Stereozilienspitzen und sogar die kleinen Glieder (~ 5 nm Durchmesser), di...

Diskussion

Um erfolgreiche HPICM-Bilder zu erhalten, müssen Benutzer ein rausch- und vibrationsarmes System einrichten und geeignete Pipetten herstellen. Wir empfehlen dringend die Verwendung von AFM-Kalibrierstandards, um die Stabilität des Systems zu testen, bevor Sie versuchen, eine Lebendzellbildgebung durchzuführen. Sobald die Auflösung des Systems getestet wurde, können Benutzer die Bildgebung eines festen Organs von Corti-Proben in Betracht ziehen, um sich mit den Bildgebungseinstellungen vertraut zu machen, bevor sie e...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analog oscilloscope	B&K Precision	2160C	Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach
AFM calibration standards	TED PELLA Inc	HS-100MG; HS-20MG	These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system
Benchtop vibration Isolator	AMETEK/TMC	Everstill K-400	Active vibration isolation
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments (WPI)	1B100F-4	Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	To be added to the bath solution to adjust osmolarity
Digitizer	National Instruments Corporation	PCI-6221	Multi-channel input/output digitizer
Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement	Standford Research Systems	SIM900, SIM960, SIM980	Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.
Faraday cage	AMETEK/TMC	Type II	Required to shield electromagnetic interference
Glass bottom dish	World Precision Instruments (WPI)	FD5040-100	Used as the dish for the chamber for the tissue
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	14025092	Extracellular (bath) solution
Instrumentation amplifier	Brownlee Precision	Model 440	Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation
Laser-based micropipette puller	Sutter Instrument	P-2000/G	Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.
Lebovitz's L-15, without phenol red	Gibco, Thermo Fisher Scientific	21083027	Extracellular (bath) solution
Micromanipulator	Scientifica	PatchStar	Used for "course" positioning of the Z piezo actuator
Microscope	Nikon	Eclipse TS100	Inverted optical microscope
Patch amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B	The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette
Piezo amplifier (XY axes)	Physik Instrumente (PI)	E-500.00, E-505.00, E-509.C2A	Amplification and PID control for XY piezo translation stage
Piezo amplifier (Z axis)	Piezosystem jena	ENT 400 & 800	Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA
Plastic Coverslips	TED PELLA Inc	26028	Used in the fabrication of the chambers for the tissue
SICM controller & software*	Ionscope, UK (ionscope.com)	N/A	Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd
Silicone elastomer (Sylgard)	World Precision Instruments (WPI)	SYLG184	Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue
Silicon glue	The Dow Chemical Company	734	Used to glue the different parts of the chamber for the tissue
Tungsten rod	A-M Systems	717500	Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue
XY piezo nanopositioner	Physik Instrumente (PI)	P-733.2DD	XY translation stage with capacitive sensors
Z piezo nanopositioner	Piezosystem jena	RA 12/24 SG	Ring piezoactuator with a strain gage sensor
*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:  NX12-Bio and NX10 SICM,
Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original
HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically
challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one
modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.