Визуализация пучка стереоцилий с наноразмерным разрешением в слуховых волосковых клетках живых млекопитающих

Резюме

Здесь мы представляем протокол для микроскопии ионной проводимости Hopping Probe (HPICM), бесконтактного метода сканирования, который позволяет наноразмерную визуализацию пучков стереоцилий в живых слуховых волосковых клетках.

Аннотация

Волосковые клетки внутреннего уха обнаруживают звуковые смещения и преобразуют эти стимулы в электрические сигналы в пучке волос, который состоит из стереоцилий, расположенных в рядах увеличивающейся высоты. Когда стереоцилии отклоняются, они тянут крошечные (~ 5 нм в диаметре) внеклеточные кончиковые звенья, соединяющие стереоцилии, которые передают силы механочувствительным каналам трансдукции. Хотя механотрансдукция изучалась в живых волосковых клетках в течение десятилетий, функционально важные ультраструктурные детали механотрансдукционного механизма на кончиках стереоцилий (такие как динамика кончиковых звеньев или трансдукционно-зависимое ремоделирование стереоцилий) все еще могут быть изучены только в мертвых клетках с помощью электронной микроскопии. Теоретически, методы сканирования зондов, такие как атомно-силовая микроскопия, имеют достаточное разрешение для визуализации поверхности стереоцилий. Однако, независимо от режима визуализации, даже малейший контакт зонда атомно-силовой микроскопии со пучком стереоцилий обычно повреждает пучок. Здесь мы представляем подробный протокол для микроскопии ионной проводимости прыжкового зонда (HPICM) визуализации слуховых волосковых клеток живых грызунов. Этот бесконтактный метод сканирования зонда позволяет проводить покадровую визуализацию поверхности живых клеток со сложной топографией, такой как волосковые клетки, с разрешением в один нанометр и без физического контакта с образцом. HPICM использует электрический ток, проходящий через стеклянную нанопипетку, для обнаружения поверхности ячейки в непосредственной близости от пипетки, в то время как пьезоэлектрическая система 3D-позиционирования сканирует поверхность и генерирует ее изображение. С помощью HPICM мы смогли визуализировать пучки стереоцилий и звенья, соединяющие стереоцилии в живых слуховых волосковых клетках в течение нескольких часов без заметных повреждений. Мы ожидаем, что использование HPICM позволит непосредственно исследовать ультраструктурные изменения в стереоцилиях живых волосковых клеток для лучшего понимания их функции.

Введение

Несмотря на то, что пучки стереоцилий в слуховых волосковых клетках достаточно велики, чтобы их можно было визуализировать оптической микроскопией и отклонять в живых клетках в эксперименте с зажимом, основные структурные компоненты механизма трансдукции, такие как кончиковые звенья, могут быть изображены только с помощью электронной микроскопии в мертвых клетках. В слуховых волосковых клетках млекопитающих механизм трансдукции расположен на нижних концах кончиковых звеньев, т. е. на кончиках стереоцилий более короткого ряда¹ и регулируется локально через сигнализацию на кончиках стереоцилий^2,3. Тем не менее, безметочная визуализация поверхностных структур в этом месте в живых волосковых клетках невозможна из-за небольших размеров стереоцилий.

Улитка млекопитающих имеет два типа слуховых сенсорных клеток: внутренние и наружные волосковые клетки. Во внутренних волосковых клетках стереоцилии длиннее и толще по сравнению с стереоцилиями во внешних волосковых клетках^4. Первый и второй ряд стереоцилий имеют диаметр 300-500 нм во внутренних волосковых клетках мыши или крысы. Благодаря дифракции света максимальное разрешение, достижимое при оптической микроскопии без меток, составляет примерно 200 нм. Следовательно, визуализация отдельных стереоцилий в пределах первого и второго рядов внутреннего пучка волосковых клеток относительно проста с помощью оптической микроскопии. Напротив, более короткие рядные стереоцилии во внутренних волосковых клетках и все стереоцилии наружных волосковых клеток имеют диаметр около 100-200 нм и не могут быть визуализированы с помощью оптической микроскопии^5. Несмотря на недавний прогресс в области визуализации со сверхвысоким разрешением, это фундаментальное ограничение сохраняется в любой оптической визуализации без меток. Все современные коммерчески доступные методы сверхвысокого разрешения требуют каких-то флуоресцентных молекул^6,что ограничивает их применение. В дополнение к ограничениям из-за необходимости специфических флуоресцентно помеченных молекул, было показано, что воздействие интенсивного светового облучения вызывает повреждение клеток и может влиять на клеточные процессы, что является большим недостатком при изучении живых клеток^7.

Наши текущие знания об ультраструктурных деталях пучков стереоцилий волосковых клеток были получены в основном с помощью различных методов электронной микроскопии (ЭМ), таких как сканирующая электронная микроскопия (SEM), просвечивающая электронная микроскопия (TEM), замораживание-разрушение EM, а в последнее время с помощью 3D-методов, таких как последовательное сечение с фокусированным ионным пучком или крио-ЭМ томография^{8,9,10,11,12,13, 14,15,16}. К сожалению, все эти методы ЭМ требуют химической или криофиксации образца. В зависимости от временной шкалы явлений это требование делает изучение динамических процессов на кончиках стереоцилий либо невозможным, либо очень трудоемким.

Ограниченные усилия были предприняты для изображения волосяных пучков живых волосковых клеток с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM)^17,18. Поскольку AFM работает в физиологических растворах, теоретически он может визуализировать динамические изменения в пучках стереоцилий живых волосковых клеток с течением времени. Проблема заключается в принципах АСМ высокого разрешения, которые подразумевают определенный физический контакт между зондом АСМ и образцом даже в наименее повреждающем режиме «постукивания»^19. Когда зонд AFM сталкивается со стереоцилием, он обычно разбивается о него, повреждая структуру пучка волос. В результате данная методика не подходит для визуализации живых, или даже фиксированных, пучков волосковых клеток^17,18. Проблема может быть частично облегчена с помощью большого шарообразного зонда AFM, который накладывает только гидродинамические силы на поверхность образца^20. Однако, несмотря на то, что такой зонд идеально подходит для проверки механических свойств образца^21,он обеспечивает только субмикрометровое разрешение при визуализации органа Corti²² и по-прежнему применяет к образцу силу, которая может быть существенной для высокочувствительных пучков стереоцилий.

Сканирующая ионно-проводящая микроскопия (SICM) представляет собой версию сканирующей зондовой микроскопии, в которой используется стеклянный пипеточный зонд, заполненный проводящим раствором^23. SICM обнаруживает поверхность, когда пипетка приближается к ячейке и электрический ток через пипетку уменьшается. Поскольку это происходит задолго до прикосновения к клетке, SICM идеально подходит для бесконтактной визуализации живых клеток в физиологическом^{растворе 24.} Наилучшее разрешение SICM составляет порядка одного нанометра, что позволяет разрешать отдельные белковые комплексы на плазматической мембране живой клетки^25. Однако, подобно другим методам сканирования зондов, SICM способен отображать только относительно плоские поверхности. Мы преодолели это ограничение, изобретя прыгающий зондовый ионный электропроводный микроскоп (HPICM)^26,в котором нанопипетка приближается к образцу в каждой точке визуализации(рисунок 1A). Используя HPICM, мы смогли изобразить пучки стереоцилий в живых слуховых волосковых клетках с наноразмерным разрешением^27.

Еще одним фундаментальным преимуществом этого метода является то, что HPICM является не только инструментом визуализации. В отличие от других методов сканирования, зонд HPICM / SICM является электродом, широко используемым в физиологии клеток для электрических записей и локальной доставки различных стимулов. Активность ионных каналов обычно не мешает визуализации HPICM, потому что общий ток через зонд HPICM на несколько порядков больше, чем внеклеточный ток, генерируемый крупнейшими ионными каналами^25. Тем не менее, HPICM позволяет точно позиционировать нанопипетту над интересующей структурой и последующую одноканальную запись патч-зажима из этой структуры^28. Так мы получили первые предварительные записи одноканальной активности на кончиках стереоцилии наружных волосковых клеток^29. Стоит отметить, что даже большой ток через нанопипетку не может произвести значительные изменения потенциала через плазматическую мембрану из-за огромного электрического шунта внеклеточной среды. Однако отдельные ионные каналы могут быть активированы механически протеканием жидкости через нанопипетку³⁰ или химически локальным применением агониста^31.

В HPICM изображение генерируется, когда нанопипетка последовательно приближается к образцу в одной точке, втягивается, а затем движется в боковом направлении, чтобы повторить подход(рисунок 1A). Зажимной усилитель постоянно подает напряжение на провод AgCl в пипетке(рисунок 1B)для генерации тока ~1 нА в растворе ванны. Значение этого тока, когда пипетка находится вдали от поверхности ячейки, определяется как опорный ток(I_ref, рисунок 1C). Затем пипетка перемещается по оси Z, чтобы приблизиться к образцу до тех пор, пока ток не уменьшится на величину, предопределенную пользователем (заданное значение), обычно 0,2%-1% от I_ref (рисунок 1C,верхняя трассировка). Затем система сохраняет значение Z в этот момент как высоту образца вместе с координатами X и Y этой точки изображения. Затем пипетку убирают от поверхности(рисунок 1С,нижняя трассировка) со скоростью, определенной пользователем, обычно 700-900 нм/мс. После втягивания пипетка (или, в нашем случае, образец – см. Рисунок 1В)перемещается латерально к следующей точке визуализации, получается новое значение опорного тока, и пипетка вновь приближается к образцу, повторяя процесс. Движение пипетки X-Y предпочтительно в вертикальном микроскопе, который обычно используется для записи токов механотрансдукции волосковых клеток. В этом случае зонд HPICM приближается к пучкам волосковых клеток не сверху, а под^{углом 32.} Однако наилучшее разрешение визуализации HPICM достигается в установке инвертированного микроскопа(рисунок 1A,B),где движение образца в направлениях X-Y отделено от Z-движения нанопипетки, тем самым устраняя потенциальные механические артефакты.

Используя HPICM, мы получили топографические изображения пучков стереоцилий внутренних и наружных волосковых клеток мыши и крысы и даже визуализировали связи между стереоцилиями, которые составляют около 5 нм в диаметре^26,27. Успех визуализации пучков волосковых клеток с помощью этой техники зависит от нескольких факторов. Во-первых, шум (дисперсия) тока нанопипетки должен быть как можно меньше, чтобы обеспечить минимально возможное заданное значение для визуализации HPICM. Низкое заданное значение позволяет зонду HPICM «ощущать» поверхность стереоцилий на большем расстоянии и под любым углом к приближению зонда и, что удивительно, улучшает разрешение X-Y изображений HPICM (см. Обсуждение). Во-вторых, вибрации и дрейфы в системе должны быть уменьшены до менее чем 10 нм, поскольку они вносят непосредственный вклад в артефакты изображения. Наконец, несмотря на то, что зонд HPICM и ступень образца перемещаются по осям Z и X-Y калиброванными пьезоприводами с обратной связью, которые имеют точность один нанометр или лучше, диаметр наконечника нанопипетки определяет распространение тока (чувствительный объем) и, следовательно, разрешение(рисунок 1A). Поэтому, прежде чем визуализировать живые волосковые клетки, жизненно важно вытащить адекватные пипетки, достичь желаемого разрешения с калибровочными образцами и достичь низкого уровня шума в системе записи.

По крайней мере, пару десятилетий техника SICM не была коммерчески доступна, и она разрабатывалась лишь несколькими лабораториями в мире с ведущей лабораторией профессора Корчева в Имперском колледже (Великобритания). Недавно несколько систем SICM стали коммерчески доступными (см. Таблицу материалов),все из которых основаны на оригинальных принципах HPICM. Тем не менее, визуализация пучков стереоцилий в волосковых клетках требует нескольких пользовательских модификаций, которые технически сложны (или даже невозможны) в закрытых «готовых к работе» системах. Поэтому необходима некоторая интеграция компонентов. Поскольку установка HPICM представляет собой патч-зажим с более строгими требованиями к вибрации и дрейфу и пьезоприводным движением зонда HPICM и образца(рисунок 1D),эта интеграция относительно проста для любого исследователя, который владеет зажимом патча. Тем не менее, ученый без надлежащего образования определенно нуждается в некоторой подготовке в области электрофизиологии в первую очередь. Несмотря на остающиеся проблемы, такие как увеличение скорости визуализации (см. Обсуждение),мы смогли визуализировать пучки стереоцилий в живых волосковых клетках с наноразмерным разрешением, не повреждая их.

В этой статье представлен подробный протокол для выполнения успешной визуализации HPICM живых слуховых пучков волосковых клеток у молодых послеродовых кохлеарных эксплантов крыс или мышей с использованием нашей специальной системы. Интегрированные компоненты перечислены в Таблице материалов. В документе также описываются распространенные проблемы, с которыми можно столкнуться, и способы их устранения.

протокол

Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию Национальными институтами здравоохранения. Все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Кентукки (протокол 00903M2005).

1. Производство и тестирование нанопипет

1. Создайте программу в съемнике микропипетки для получения пипеток с сопротивлением от 200 до 400 МОм, что соответствует внутренним диаметрам наконечника примерно 50-70 нм. Параметры будут зависеть от съемника микропипетки. Чтобы получить короткие пипетки с негибкими тонкими наконечниками, ознакомьтесь с руководством по эксплуатации съемника.
2. Используйте боросиликатные стеклянные капилляры с наружным/внутренним диаметром 1/0,58 мм и внутренней нитью накала для облегчения наполнения. Длина пипетки имеет решающее значение, поскольку она определяет частоту бокового механического резонанса пипетки. Чем длиннее пипетка, тем ниже резонансная частота и тем труднее избежать этого резонанса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователь должен попытаться изготовить самую короткую пипетку, которую может принять держатель. Длина нанопипеток в этом эксперименте обычно составляет 15-25 мм(рисунок 2А).
3. Заполните нанопипетку до ее средней точки(рисунок 2A)раствором для ванны, либо L-15 Лейбовица, либо сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS), дополненным 20 мМ D-глюкозы (для регулировки осмолярности). Чтобы избежать потенциальных артефактов, используйте тот же раствор, который будет использоваться в ванне для записей.
4. Используя оптический микроскоп с увеличением в 10 раз, проверьте наличие пузырьков на кончике пипетки(рисунок 2B). Пузырьки будут препятствовать течению тока. Сложнее удалить пузырьки в пипетках, которые были вытянуты за несколько часов до эксперимента. Поэтому рекомендуется тянуть новые пипетки с каждым экспериментом.
5. Как только пипетка освободится от пузырьков, установите ее в держатель пипетки HPICM(рисунок 2C).
6. Поместите образец (тканевый или калибровочный стандарт) в специально изготовленную камеру и добавьте 4 мл вышеупомянутого раствора для ванны.
7. Поместите изготовленную по индивидуальному заказу камеру на ступень HPICM и вставьте заземляющий электрод в раствор.
8. Убедитесь, что напряжение, подаваемое на пипетку усилителем патч-зажима, равно нулю.
9. Перемещайте пипетку в Z, пока она не коснется жидкости.
10. Установите смещение усилителя на ноль, а затем добавьте +100 мВ, чтобы проверить ток пипетки.
11. Рассчитайте сопротивление и диаметр пипетки, основываясь на законе Ома:
    R = V/I
    где R — сопротивление (MOhm), V — напряжение, приложенное к нанопипетке (мВ), а I — ток, протекающий через нанопипетку (nA).
    1. Рассчитайте внутренний диаметр пипетки, как описано в другом месте, по следующей формуле^12:
       ID_{Наконечник} = 1000/ √R
       ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальное значение сопротивления составляет от 200 до 400 МОм. Пипетки с сопротивлением выше 400 МОм могут привести к нестабильному току из-за их небольшого размера (< внутреннего диаметра 50 нм). Напротив, пипетки с сопротивлением менее 200 МОм слишком велики (внутренний диаметр > 70 нм) и не решают мелкие особенности. Рекомендуется начинать съемку с пипеток сопротивления 200 МОм, так как они проще в изготовлении и, как правило, обеспечивают меньше электрического шума.

2. Минимизация дрейфа и вибраций образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить механический шум в системе во время визуализации, установите образцы на специально изготовленные камеры, в которых используются толстые стеклянные слайды (~1,2 мм):

1. Снимите стеклянную часть с тарелки со стеклянным дном диаметром 50 мм, оставив пластиковые стенки нетронутыми.
2. Приклейте пластиковую часть чашки для культивирования клеток поверх толстого стеклянного слайда силиконовым клеем.
3. Установите калибровочный образец в середине камеры (поверх стеклянного слайда) с помощью силиконового клея или тонкой двусторонней ленты.
4. Надежно закрепите камеру на ступени HPICM с помощью двусторонней ленты.
5. Во время съемки закройте клетку Фарадея и накройте ее одеялом, чтобы свести к минимуму электрические помехи и тепловой дрейф соответственно.

3.Тестирование разрешения с помощью калибровочных стандартов AFM

ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется создавать изображения стандартов AFM (см. Таблицу материалов) перед визуализацией живыхклеток, чтобы устранить неполадки системы и проверить ее разрешение по осям X-Z-Y. Калибровочные стандарты имеют столбы диоксида кремния и отверстия различной формы, но фиксированные высоты / глубины (т. Е. 20 или 100 нм) на кремниевом чипе 5 x 5 мм. Рекомендуется начиная со стандарта калибровки 100 нм, чтобы гарантировать, что разрешение Z ниже 100 нм. После успешного получения изображения с высоким разрешением стоек или отверстий в данном калибровочном образце(рисунок 3А),перейдите к стандарту 20 нм. Если визуализация последнего стандарта является успешной(фиг.3B),разрешение по оси Z гарантированно будет ниже 20 нм и подходит для визуализации пучков стереоцилий волосковых клеток^12. Следующие шаги используются для получения изображения обоих калибровочных стандартов.

1. Прикрепите калибровочный стандарт к камере с помощью силиконового клея.
2. Добавьте 4 мл HBSS в камеру, чтобы покрыть калибровочный образец. Затем закрепите камеру на ступени XY установки HPICM с помощью двусторонней ленты.
3. Зажмите магнитный держатель заземленного электрода к ступени возле камеры и погрузите электрод в раствор ванны(рисунок 1B).
4. Установите нанопипетку в держатель, погрузите ее в раствор ванны и установите ее ток на ~1 нА, следуя шагам, описанным в разделе 1.
5. Расположите нанопипетку примерно над центром калибровочного стандарта с помощью манипулятора с зажимом курса. Для такого позиционирования обычно достаточно визуального осмотра, так как площадь, покрытая структурами диоксида кремния, относительно велика (1 х 1 мм). В отличие от органа эксплантов Корти (см. ниже), калибровочный стандарт является непрозрачным и, следовательно, для этого образца невозможно более точное позиционирование с помощью оптической визуализации.
6. Увеличьте заданное значение при мониторинге сигнала от датчика Z-пьезопривода на осциллографе в режиме реального времени. После установления стабильного повторяемого цикла подхода Z (как на рисунке 1C,внизу) уменьшите заданное значение до значения, которое чуть выше точки нестабильности. Эта процедура обеспечит оптимальное заданное значение для этой конкретной нанопипетки.
7. Перемещайте пипетку вниз со скоростью ~5 мкм/с с помощью микроманипулятора зажимного зажима, пока она не достигнет образца. В этот момент нижний уровень сигнала позиционирования Z в реальномвремени (рисунок 1C)увеличится, что указывает на то, что нанопипетка изымается из-за «зондирования» поверхности образца. Любое дальнейшее движение нанопипетки приведет к дальнейшему положительному сдвигу сигнала Z-позиционирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не превысить верхний предел движения Z-пьезопривода.
8. Начните обработку изображений с низким разрешением (см. таблицу 1). Из-за неравномерного монтажа стандарта AFM самая высокая точка интересующей области может быть неизвестна. Поэтому установите амплитуду втягивания пипетки (амплитуду прыжка) не менее 200-500 нм.
   1. Как только самая высокая точка образца в области визуализации идентифицирована, уменьшите амплитуду прыжка. Меньшая амплитуда прыжка позволяет быстрее сканировать, что предпочтительно для изображений с высоким разрешением из-за уменьшения эффектов дрейфов и снижения вибрации.
9. Прежде чем переместить пипетку в новое место X-Y, втяните ее примерно на 200 мкм по оси Z, чтобы предотвратить нежелательные столкновения с образцом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случаях, когда нанопипетка не выровнена с центром калибровочного стандарта, возможно, что сканирование начинается только с области поверхностных особенностей.
10. После того, как интересующая область найдена, начните съемку с более высоким разрешением (см. таблицу 1).

4. Изготовление камер на заказ для крепления кохлеарных эксплантов

ПРИМЕЧАНИЕ: Установите кохлеарные экспланты в камерах с помощью специально изготовленных зажимных систем, в которых используются либо гибкие стеклянные пипетки (этап 4.1)(рисунок 4A),либо зубная нить (этап 4.2)(рисунок 4B). Стеклянная пипеточная камера может быть стерилизована и использована для культивируемых органов Корти, в то время как камера зубной нити обеспечивает более надежное удержание образца и контроль над ориентацией пучка стереоцилий во время монтажа. Эти специально изготовленные камеры должны быть подготовлены заранее, но они могут быть очищены и повторно использованы в нескольких сеансах визуализации.

1. Сделайте камеру с помощью гибких стеклянных пипеток
   1. Вытяните два тонких и гибких стеклянных волокна из стеклянных капилляров с помощью съемника пипетки. Наши вытянутые стеклянные волокна обычно имеют длину от 1 до 2 см и довольно гибкие.
   2. Поместите небольшую каплю силиконового эластомера поверх стеклянной крышки. Используйте чехлы диаметром 2 см.
   3. Поместите концы двух стеклянных волокон на силиконовую каплю и расположите волокна так, чтобы они имели небольшую степень разделения между ними(рисунок 4А).
   4. Поместите крышку на горячую плиту, чтобы быстро вылечить эластомер (от 1 до 3 мин).
   5. Приклейте крышку на стеклянное дно камеры, описанной в разделе 2, используя небольшое количество (1-3 мкл) силиконового эластомера и позволяя ему отверждаться в течение ночи.
2. Изготовление камеры с использованием зубной нити:
   1. Снимите стеклянную часть стеклянной тарелки толщиной 50 мм, оставив пластиковые стенки нетронутыми. Затем приклейте пластиковую часть чашки для культивирования клеток поверх стеклянного слайда толщиной 1,2 мм с силиконовым клеем.
   2. Установите одну пластиковую крышку (6,5 х 6,5 мм) с тем же клеем к центру камеры. Затем повторите процесс с другой крышкой поверх предыдущей.
   3. Установите две небольшие вольфрамовые или позолоченные проволоки (12 мм длиной и ~ 0,5 мм в диаметре) с силиконовым клеем, каждая из которых находится на противоположных сторонах направляющих крышки. Приклейте их достаточно далеко (> 10-15 мм) от направляющих(рисунок 4В).
   4. Отделите две нити зубной нити и поместите их поверх направляющих крышки и закрепите их на проводах, сделав узел. Оставьте небольшой зазор между обеими нитями(рисунок 4B,короткие стрелки).
3. Очищайте камеры после каждого использования
   1. Аккуратно удалите ткань из камеры с помощью тонкого пинцета и слегка соскоблите остатки ткани, оставшиеся позади.
   2. Промыть камеру сначала 70% этанолом, а затем дистиллированной водой.
   3. При необходимости повторите цикл ополаскивания.
   4. Поместите камеру вверх ногами на фильтровальную бумагу, чтобы она высохла до следующего эксперимента. Камеры не нуждаются в стерилизации, если только культивирование органа Корти не планируется после визуализации.

5. Рассечение органа грызунов Корти

1. Выполняют рассечение молодых послеродовых кохлеарных эксплантов, как подробно описано в другом месте^13.
2. Для визуализации HPICM рассекайте орган Корти у мышей между постнатальными днями 3 и 6 (P3-6) и у крыс между постнатальными днями 3 и 8 (P3-8).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Старые волосковые клетки более восприимчивы к повреждению во время рассечения и, следовательно, не могут использоваться для многочасовой покадровой визуализации HPICM.
3. Не забудьте удалить текториальную мембрану перед визуализацией HPICM.
4. Сразу после рассечения закрепите ткань в одной из камер, описанных в разделе 4, либо поместив ее под гибкие стеклянные пипетки, либо под две нити зубной нити(рисунок 4). Предварительно заполните эти камеры 4 мл раствора для ванны комнатной температуры (чтобы свести к минимуму образование пузырьков).

6. Визуализация слуховых волосковых клеток

1. Установите камеру со свежеизолированным органом Corti на пьезо-сцену X-Y с помощью двусторонней ленты и убедитесь, что она надежно закреплена, чтобы свести к минимуму дрейф камеры по осям X и Y(рисунок 1B).
2. Выполните действия, описанные в разделе 1, чтобы поместить новую нанопипетку и проверить правильность сопротивления пипетки.
3. Используя зажимной микроманипулятор, расположите нанопипетку над областью волосковых клеток, наблюдая при этом за органом эксплантата Корти в перевернутом микроскопе.
4. Проверьте, стабильна ли система с заданным значением 0,5% или ниже, записав ток в реальном времени и сигнал позиционирования Z на осциллографе (как на рисунке 1C). Если сигнал Z не стабилен, попробуйте уменьшить частоту среза фильтра нижних частот усилителя патч-зажима. Однако оно не может быть ниже времени отклика Z-пьезопривода (во избежание столкновения пипетки с образцом из-за задержки показаний тока).
   ПРИМЕЧАНИЕ: На практике оптимальным является установка этого фильтра на частоту 5 кГц. Лучше заменить нанопипетку, если Z-сигнал еще нестабилен.
5. Как только будет достигнута стабильная запись, определите оптимальное заданное значение и подойдите к образцу с помощью пипетки HPICM, как описано в шагах 3.6-3.7 выше.
6. Во-первых, выполняют визуализацию с низким разрешением (см. Таблицу 1),используя амплитуду прыжка от 6 до 8 мкм. Чтобы сфотографировать высокие структуры, такие как пучки стереоцилий волосковых клеток, убедитесь, что амплитуды прыжка достаточно, чтобы избежать столкновения с этими структурами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если амплитуды прыжка недостаточно, пипетка не сможет перепрыгнуть через стереоцилиум и произойдет неизбежное столкновение. Столкновение зонда HPICM со стереоцилием может повредить пучок волос. Поэтому в тех случаях, когда высота пучка стереоцилий неопределенна, используйте большую амплитуду прыжка.
7. Ознакомиться с топографией органа Корти, сначала выполнив и/или изучив изображения, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии(рисунок 5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если изображение HPICM однородно с высотой менее 1 мкм в каждой точке визуализации, пипетка, скорее всего, сканирует дно стекла, а не ткань. В качестве альтернативы, пипетка может «приземляться» на другую область кохлеарного эксплантата, вдали от волосковых клеток.
8. Если пипетку необходимо переместить в новое место X-Y, втяните ее примерно на 500 нм, чтобы избежать столкновений с какими-либо высокими особенностями в ткани. Повторяйте визуализацию HPICM с низким разрешением до тех пор, пока не будет найдена интересующая область с волосковыми клетками.
9. После того, как область интереса найдена, запустите визуализацию с более высоким разрешением (см. таблицу 1). Постарайтесь потратить менее 15 минут на визуализацию целого пучка волос.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пучки волосковых клеток в живой ткани не остаются неподвижными, но могут менять свою ориентацию, например, из-за изменения формы в нижележащих поддерживающих клетках. Поэтому изображения могут демонстрировать артефакты движения, если получение изображения происходит слишком медленно.
10. Еще раз определите самые высокие объекты на изображениях с низким разрешением перед уменьшением амплитуды прыжка для изображений с высоким разрешением. Для интересующей области, охватывающей весь пучок волосковых клеток, уменьшите амплитуду прыжка до 4-5 мкм, в то время как для относительно небольшой и «плоской» области внутри пучка (например, 2 х 2 мкм) уменьшите амплитуду прыжка еще больше, до менее чем 1 мкм, тем самым увеличив скорость и разрешение изображения.

7. Обработка изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Артефакты визуализации распространены в HPICM-визуализации. Некоторые из них могут быть исправлены параметрами получения изображения, в то время как другие требуют постобработки либо с помощью специализированного средства просмотра SICM, либо с помощью более общих программ обработки данных, таких как ImageJ или MatLab. Здесь мы опишем наиболее распространенные артефакты и то, как мы их исправляем с помощью SICM viewer.

1. Выполнить коррекцию уклона
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это не очевидно для новичка, но человеческий глаз не может определить субмикрометровые особенности размера на поверхности клетки, если область визуализации имеет общий наклон равного или большего размера(рисунок 3A,B,слева). Поэтому необходимо определить средний наклон изображенной области (путем подгонки данных 3D-изображения HPICM к одной плоскости) и вычесть его из изображения HPICM(рисунок 3A,B,середина).
   1. Нажмите кнопку Открыть, чтобы открыть изображение с помощью средства просмотра SICM.
   2. Выберите вкладку Коррекция изображения.
   3. Выберите вкладку Правильный наклон.
   4. Нажмите кнопку «Правильный наклон» для автоматической коррекции уклона.
2. Выполнение выравнивания линий
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как упоминалось ранее, механические и/или тепловые дрейфы, а также артефакты движения клеток представляют собой значительную проблему в визуализации HPICM. Небольшой дрейф со скоростью менее микрометра в минуту обычно не заметен в обычной установке патч-зажима. Тем не менее, он может производить артефакты в несколько десятков нанометров в изображениях HPICM, что значительно больше, чем разрешение HPICM. Поэтому нередко можно столкнуться с внезапными скачками оси Z между двумя соседними линиями сканирования HPICM во время визуализации. Это можно исправить, проанализировав различия между начальными (и/или конечными) Z-значениями в этих соседних линиях сканирования.
   1. Нажмите кнопку Открыть, чтобы открыть изображение с помощью средства просмотра SICM.
   2. Выберите вкладку Коррекция изображения.
   3. Выберите вкладку Правильный наклон.
   4. Выберите ширину выравниваемых линий. Нажмите на кнопку ButtonDestripeLineFit для автоматической коррекции выравнивания линии.
3. Снижение уровня шума
   ПРИМЕЧАНИЕ: При получении изображений с помощью HPICM небольшие колебания тока нанопипетки могут привести к остановке нанопипетки далеко от поверхности образца, особенно при низких заданных значениях. Это приводит к появлению небольших белых точек на изображении. Для того чтобы исправить этот артефакт изображения, необходимо идентифицировать точки визуализации со значением Z, значительно большим, чем у соседей, и заменить это значение средним значением соседей. Это делается с помощью регулируемого медианного фильтра.
   1. Нажмите кнопку Открыть, чтобы открыть изображение с помощью средства просмотра SICM.
   2. Выберите вкладку Обработка изображений.
   3. Выберите вкладку Шумоподавление.
   4. Установите фильтр «Пороговое значение» (мкм) для удаляемых пикселов.

Результаты

Протокол, представленный в данной работе, может быть использован для визуализации любых живых клеток со сложной топографией. Следуя этим шагам, мы обычно получаем изображения живых слуховых пучков волосковых клеток крыс(рисунок 6B,D). Несмотря на более низкое ра...

Обсуждение

Для получения успешных изображений HPICM пользователям необходимо установить систему с низким уровнем шума и вибрации и изготовить соответствующие пипетки. Мы настоятельно рекомендуем использовать калибровочные стандарты AFM для проверки стабильности системы перед попыткой выполнени?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analog oscilloscope	B&K Precision	2160C	Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach
AFM calibration standards	TED PELLA Inc	HS-100MG; HS-20MG	These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system
Benchtop vibration Isolator	AMETEK/TMC	Everstill K-400	Active vibration isolation
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments (WPI)	1B100F-4	Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	To be added to the bath solution to adjust osmolarity
Digitizer	National Instruments Corporation	PCI-6221	Multi-channel input/output digitizer
Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement	Standford Research Systems	SIM900, SIM960, SIM980	Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.
Faraday cage	AMETEK/TMC	Type II	Required to shield electromagnetic interference
Glass bottom dish	World Precision Instruments (WPI)	FD5040-100	Used as the dish for the chamber for the tissue
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	14025092	Extracellular (bath) solution
Instrumentation amplifier	Brownlee Precision	Model 440	Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation
Laser-based micropipette puller	Sutter Instrument	P-2000/G	Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.
Lebovitz's L-15, without phenol red	Gibco, Thermo Fisher Scientific	21083027	Extracellular (bath) solution
Micromanipulator	Scientifica	PatchStar	Used for "course" positioning of the Z piezo actuator
Microscope	Nikon	Eclipse TS100	Inverted optical microscope
Patch amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B	The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette
Piezo amplifier (XY axes)	Physik Instrumente (PI)	E-500.00, E-505.00, E-509.C2A	Amplification and PID control for XY piezo translation stage
Piezo amplifier (Z axis)	Piezosystem jena	ENT 400 & 800	Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA
Plastic Coverslips	TED PELLA Inc	26028	Used in the fabrication of the chambers for the tissue
SICM controller & software*	Ionscope, UK (ionscope.com)	N/A	Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd
Silicone elastomer (Sylgard)	World Precision Instruments (WPI)	SYLG184	Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue
Silicon glue	The Dow Chemical Company	734	Used to glue the different parts of the chamber for the tissue
Tungsten rod	A-M Systems	717500	Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue
XY piezo nanopositioner	Physik Instrumente (PI)	P-733.2DD	XY translation stage with capacitive sensors
Z piezo nanopositioner	Piezosystem jena	RA 12/24 SG	Ring piezoactuator with a strain gage sensor
*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:  NX12-Bio and NX10 SICM,
Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original
HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically
challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one
modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.