Stereocilia Bundle Imaging con risoluzione su scala nanometrica in cellule ciliate uditive di mammiferi vivi

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per la Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), una tecnica di scansione senza contatto che consente l'imaging su scala nanometrica di fasci di stereocilia in cellule ciliate uditive vive.

Abstract

Le cellule ciliate dell'orecchio interno rilevano gli spostamenti indotti dal suono e trasducono questi stimoli in segnali elettrici in un fascio di capelli costituito da stereociglia disposte in file di altezza crescente. Quando gli stereocili vengono deviati, tirano su minuscoli (~ 5 nm di diametro) collegamenti di punta extracellulari che interconnettono stereociglia, che trasmettono forze ai canali di trasduzione meccanosensibili. Sebbene la meccanotrasduzione sia stata studiata nelle cellule ciliate vive per decenni, i dettagli ultrastrutturali funzionalmente importanti del meccanismo di meccanotrasduzione alle punte degli stereocilia (come la dinamica del collegamento della punta o il rimodellamento degli stereociglia dipendenti dalla trasduzione) possono ancora essere studiati solo nelle cellule morte con microscopia elettronica. Teoricamente, le tecniche di scansione della sonda, come la microscopia a forza atomica, hanno una risoluzione sufficiente per visualizzare la superficie degli stereociglia. Tuttavia, indipendentemente dalla modalità di imaging, anche il minimo contatto della sonda al microscopio a forza atomica con il fascio di stereociglia di solito danneggia il fascio. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'imaging al microscopio a conduttanza ionica della sonda saltellante (HPICM) di cellule ciliate uditive di roditori vivi. Questa tecnica di scansione senza contatto consente l'imaging time lapse della superficie di cellule vive con una topografia complessa, come le cellule ciliate, con risoluzione di singoli nanometri e senza entrare in contatto fisico con il campione. L'HPICM utilizza una corrente elettrica che passa attraverso la nanopipetta di vetro per rilevare la superficie della cella nelle immediate vicinanze della pipetta, mentre un sistema piezoelettrico di posizionamento 3D scansiona la superficie e genera la sua immagine. Con HPICM, siamo stati in grado di visualizzare fasci di stereocilia e collegamenti che interconnettono stereociglia nelle cellule ciliate uditive vive per diverse ore senza danni evidenti. Prevediamo che l'uso di HPICM consentirà l'esplorazione diretta dei cambiamenti ultrastrutturali nelle stereociglia delle cellule ciliate vive per una migliore comprensione della loro funzione.

Introduzione

Nonostante il fatto che i fasci di stereocilia nelle cellule ciliate uditive siano abbastanza grandi da essere visualizzati al microscopio ottico e deviati nelle cellule vive in un esperimento di patch clamp, i componenti strutturali essenziali del meccanismo di trasduzione come i collegamenti di punta potrebbero essere ripresi solo con la microscopia elettronica nelle cellule morte. Nelle cellule ciliate uditive dei mammiferi, il meccanismo di trasduzione si trova alle estremità inferiori dei collegamenti della punta, cioè alle punte delle stereociglia della fila più corta¹ e regolato localmente attraverso la segnalazione alle punte degli stereocili^2,3. Tuttavia, l'imaging senza etichette delle strutture superficiali in questa posizione nelle cellule ciliate vive non è possibile a causa delle piccole dimensioni degli stereocili.

La coclea dei mammiferi ha due tipi di cellule sensoriali uditive: cellule ciliate interne ed esterne. Nelle cellule ciliate interne, gli stereociglia sono più lunghi e più spessi rispetto a quelli delle cellule ciliate^{esterne 4}. La prima e la seconda fila di stereociglia hanno un diametro di 300-500 nm nelle cellule ciliate interne di topo o ratto. A causa della diffrazione della luce, la risoluzione massima ottenibile con una microscopia ottica senza etichetta è di circa 200 nm. Quindi, la visualizzazione delle singole stereociglia all'interno della prima e della seconda fila del fascio interno di cellule ciliate è relativamente facile con la microscopia ottica. Al contrario, le stereociglia a fila più corte nelle cellule ciliate interne e tutte le stereociglia delle cellule ciliate esterne hanno diametri intorno a 100-200 nm e non possono essere visualizzate con la microscopia ottica⁵. Nonostante i recenti progressi nell'imaging a super-risoluzione, questa limitazione fondamentale persiste in qualsiasi imaging ottico senza etichette. Tutte le attuali tecniche di super-risoluzione disponibili in commercio richiedono una sorta di molecole fluorescenti⁶, che limita le loro applicazioni. Oltre alle limitazioni dovute alla necessità di specifiche molecole marcate fluorescentemente, l'esposizione a un'intensa irradiazione luminosa ha dimostrato di indurre danni cellulari e potrebbe influenzare i processi cellulari, il che è un grande svantaggio quando si studiano le cellule vive⁷.

La nostra attuale conoscenza dei dettagli ultrastrutturali dei fasci di stereociglia delle cellule ciliate è stata ottenuta principalmente con varie tecniche di microscopia elettronica (EM), come la microscopia elettronica a scansione (SEM), la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), la frattura da congelamento EM e recentemente con tecniche 3D come il sezionamento seriale con fascio ionico focalizzato o la tomografia crio-EM^{8,9,10,11,12,13, 14,15,16}. Sfortunatamente, tutte queste tecniche EM richiedono la criofissazione chimica o criofissazione del campione. A seconda della scala temporale dei fenomeni, questo requisito rende impossibile o molto laborioso uno studio dei processi dinamici alle punte degli stereotipi.

Sforzi limitati sono stati fatti per visualizzare fasci di capelli di cellule ciliate vive con microscopia a forza atomica (AFM)^17,18. Poiché l'AFM opera in soluzioni fisiologiche, potrebbe, in teoria, visualizzare i cambiamenti dinamici nei fasci di stereociglia delle cellule ciliate vive nel tempo. Il problema sta nei principi dell'AFM ad alta risoluzione, che implica un certo contatto fisico tra la sonda AFM e il campione, anche nella modalità "tapping" meno dannosa¹⁹. Quando la sonda AFM incontra uno stereocilio, di solito si schianta contro di esso, danneggiando la struttura del fascio di capelli. Di conseguenza, questa tecnica non è adatta per visualizzare dal vivo, o anche fissi, fasci di cellule ciliate^17,18. Il problema può essere parzialmente alleviato utilizzando una grande sonda AFM a forma di sfera che impone solo forze idrodinamiche alla superficie del campione²⁰. Tuttavia, anche se tale sonda è ideale per testare le proprietà meccaniche del campione²¹, fornisce solo una risoluzione sub-micrometrica quando si esegue l'imaging dell'organo di Corti²² e applica ancora al campione una forza che può essere sostanziale per i fasci di stereociglia altamente sensibili.

La microscopia a scansione a conduttanza ionica (SICM) è una versione della microscopia a scansione a sonda che utilizza una sonda a pipetta di vetro riempita con una soluzione conduttiva²³. SICM rileva la superficie quando la pipetta si avvicina alla cella e la corrente elettrica attraverso la pipetta diminuisce. Poiché ciò avviene ben prima di toccare la cellula, il SICM è ideale per l'imaging senza contatto di cellule vive in soluzione fisiologica²⁴. La migliore risoluzione di SICM è dell'ordine dei singoli nanometri, che consente di risolvere singoli complessi proteici sulla membrana plasmatica di una cellula vivente²⁵. Tuttavia, simile ad altre tecniche di scansione della sonda, SICM è in grado di visualizzare solo superfici relativamente piatte. Abbiamo superato questa limitazione inventando il microscopio a conduttanza ionica a sonda luppolabile (HPICM)²⁶, in cui la nanopipetta si avvicina al campione in ogni punto di imaging (Figura 1A). Utilizzando HPICM, siamo stati in grado di visualizzare fasci di stereociglia in cellule ciliate uditive vive con risoluzione su scala nanometrica²⁷.

Un altro vantaggio fondamentale di questa tecnica è che l'HPICM non è solo uno strumento di imaging. A differenza di altre tecniche di scansione della sonda, la sonda HPICM / SICM è un elettrodo ampiamente utilizzato nella fisiologia cellulare per le registrazioni elettriche e la consegna locale di vari stimoli. L'attività del canale ionico di solito non interferisce con l'imaging HPICM, perché la corrente totale attraverso la sonda HPICM è di diversi ordini di grandezza più grande della corrente extracellulare generata dai più grandi canali^{ionici 25}. Tuttavia, HPICM consente il posizionamento preciso della nanopipetta su una struttura di interesse e la successiva registrazione patch-clamp a canale singolo da questa struttura²⁸. È così che abbiamo ottenuto le prime registrazioni preliminari dell'attività a canale singolo alle punte delle stereociglia ciliate^{esterne 29}. Vale la pena ricordare che anche una grande corrente attraverso la nanopipetta non può produrre cambiamenti significativi del potenziale attraverso la membrana plasmatica a causa dell'enorme shunt elettrico del mezzo extracellulare. Tuttavia, i singoli canali ionici possono essere attivati meccanicamente dal flusso di liquido attraverso la nanopipetta³⁰ o chimicamente mediante l'applicazione locale di un agonista³¹.

In HPICM, l'immagine viene generata quando una nanopipetta si avvicina sequenzialmente al campione in un punto, si ritrae e quindi si muove in direzione laterale per ripetere l'approccio (Figura 1A). Un amplificatore patch clamp applica costantemente tensione a un filo AgCl nella pipetta (Figura 1B) per generare una corrente di ~ 1 nA nella soluzione del bagno. Il valore di questa corrente quando la pipetta è lontana dalla superficie della cella è determinato come corrente di riferimento (I_ref, Figura 1C). Quindi, la pipetta si sposta nell'asse Z per avvicinarsi al campione fino a quando la corrente non viene ridotta di una quantità predefinita dall'utente (setpoint), di solito 0,2% -1% del _riferimento I (Figura 1C,traccia superiore). Il sistema salva quindi il valore Z in questo momento come altezza del campione, insieme alle coordinate X e Y di questo punto di imaging. Quindi, la pipetta viene ritratta lontano dalla superficie(Figura 1C,traccia inferiore) ad una velocità definita dall'utente, di solito 700-900 nm / ms. Dopo la retrazione, la pipetta (o, nel nostro caso, il campione - vedi Figura 1B) viene spostata lateralmente al punto di imaging successivo, si ottiene un nuovo valore di corrente di riferimento e la pipetta si avvicina ancora una volta al campione, ripetendo il processo. Il movimento X-Y della pipetta è preferito in una configurazione al microscopio verticale che viene tipicamente utilizzata per le registrazioni delle correnti di meccanotrasduzione delle cellule ciliate. In questa impostazione, la sonda HPICM si avvicina ai fasci di cellule ciliate non dall'alto ma con un angolo³². Tuttavia, la migliore risoluzione dell'imaging HPICM si ottiene in una configurazione al microscopio invertito (Figura 1A,B), in cui il movimento del campione nelle direzioni X-Y viene disaccoppiato dal movimento Z della nanopipetta, eliminando così potenziali artefatti meccanici.

Utilizzando HPICM, abbiamo ottenuto immagini topografiche di fasci di stereociglia interne ed esterne di cellule ciliate interne ed esterne di topo e abbiamo persino visualizzato i collegamenti tra le stereociglia che sono di circa 5 nm di diametro^26,27. Il successo dell'imaging a fascio di cellule ciliate con questa tecnica si basa su diversi fattori. In primo luogo, il rumore (varianza) della corrente della nanopipetta dovrebbe essere il più piccolo possibile per consentire il setpoint più basso possibile per l'imaging HPICM. Un setpoint basso consente alla sonda HPICM di "rilevare" la superficie stereocilia a una distanza maggiore e con qualsiasi angolo rispetto all'approccio della sonda e, sorprendentemente, migliora la risoluzione X-Y dell'imaging HPICM (vedi Discussione). In secondo luogo, le vibrazioni e le derive nel sistema dovrebbero essere ridotte a meno di 10 nm, poiché contribuiscono direttamente agli artefatti di imaging. Infine, anche se la sonda HPICM e lo stadio del campione sono spostati sugli assi Z e X-Y dagli attuatori piezoelettrici calibrati controllati da feedback che hanno una precisione di un singolo nanometro o superiore, il diametro della punta della nanopipetta determina la diffusione della corrente (volume di rilevamento) e quindi la risoluzione (Figura 1A). Pertanto, prima di eseguire l'imaging di cellule ciliate vive, è fondamentale tirare le pipette adeguate, raggiungere la risoluzione desiderata con campioni di calibrazione e ottenere un basso rumore nel sistema di registrazione.

Per almeno un paio di decenni, la tecnica SICM non è stata disponibile in commercio ed è stata sviluppata solo da pochi laboratori al mondo con il laboratorio leader del Prof. Korchev nell'Imperial College (Regno Unito). Recentemente, diversi sistemi SICM sono diventati disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali),tutti basati sui principi ORIGINALI HPICM. Tuttavia, l'imaging di fasci di stereocilia nelle cellule ciliate richiede diverse modifiche personalizzate che sono tecnicamente impegnative (o addirittura impossibili) nei sistemi chiusi "pronti all'uso". Pertanto, è necessaria una certa integrazione dei componenti. Poiché la configurazione HPICM rappresenta un patch clamp rig con requisiti di vibrazione e deriva più rigorosi e un movimento piezoelettrico della sonda HPICM e del campione (Figura 1D), questa integrazione è relativamente facile per qualsiasi ricercatore, che è esperto nel patch clamping. Tuttavia, uno scienziato senza un background adeguato avrebbe sicuramente bisogno di una formazione in elettrofisiologia prima. Nonostante le sfide rimanenti come l'aumento della velocità di imaging (vedi Discussione), siamo stati in grado di visualizzare fasci di stereocilia in cellule ciliate vive con risoluzione su scala nanometrica senza danneggiarle.

Questo documento presenta un protocollo dettagliato per eseguire con successo l'imaging HPICM dei fasci di cellule ciliate uditive vive in giovani espianti cocleari di ratto postnatale o topo utilizzando il nostro sistema personalizzato. I componenti integrati sono elencati nella Tabella dei Materiali. Il documento descrive anche i problemi comuni che possono essere riscontrati e come risolverli.

Protocollo

Lo studio è stato condotto in conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health. Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Kentucky (protocollo 00903M2005).

1. Produzione e test delle nanopipette

1. Creare un programma nell'estrattore di micropipette per ottenere pipette con una resistenza compresa tra 200 e 400 MΩ, che corrisponde a diametri interni della punta di circa 50-70 nm. I parametri dipenderanno dall'estrattore di micropipette. Per ottenere pipette corte con punte sottili non flessibili, controllare nel manuale operativo dell'estrattore.
2. Utilizzare capillari di vetro borosilicato con diametri esterni/interni di 1/0,58 mm e un filamento interno per facilitare il riempimento. La lunghezza della pipetta è cruciale perché determina la frequenza della risonanza meccanica laterale della pipetta. Più lunga è la pipetta, minore è la frequenza di risonanza e più difficile è evitare questa risonanza.
   NOTA: l'utente deve cercare di produrre la pipetta più corta che il supporto può accettare. La lunghezza delle nanopipette in questo esperimento è solitamente di 15-25 mm (Figura 2A).
3. Riempire la nanopipetta fino al suo punto intermedio (Figura 2A) con una soluzione da bagno, L-15 di Leibovitz o con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) integrata con 20 mM di D-glucosio (per regolare l'osmolarità). Per evitare potenziali artefatti, utilizzare la stessa soluzione che verrà utilizzata nella vasca da bagno per le registrazioni.
4. Utilizzando un microscopio ottico con un ingrandimento di 10x, verificare la presenza di eventuali bolle sulla punta della pipetta (Figura 2B). Le bolle impedirebbero il flusso di corrente. È più difficile rimuovere le bolle nelle pipette che sono state tirate diverse ore prima dell'esperimento. Pertanto, si consiglia di tirare nuove pipette ad ogni esperimento.
5. Una volta che la pipetta è priva di bolle, montarla nel porta pipette HPICM (Figura 2C).
6. Posizionare il campione (tessuto o standard di calibrazione) sulla camera costruita su misura e aggiungere 4 ml della soluzione da bagno sopra menzionata.
7. Posizionare la camera personalizzata sullo stadio HPICM e introdurre l'elettrodo di terra nella soluzione.
8. Assicurarsi che la tensione applicata alla pipetta dall'amplificatore a morsetto patch sia pari a zero.
9. Spostare la pipetta in Z fino a quando non tocca il liquido.
10. Impostare l'offset dell'amplificatore a zero e quindi aggiungere +100 mV per controllare la corrente della pipetta.
11. Calcola la resistenza e il diametro della pipetta, in base alla legge di Ohm:
    R = V/I
    dove R è la resistenza (MOhm), V è la tensione applicata alla nanopipetta (mV) e I è la corrente che scorre attraverso la nanopipetta (nA).
    1. Calcolare il diametro interno della pipetta come descritto altrove secondo la seguente formula¹²:
       _Suggerimento ID = 1000 / √R
       NOTA: il valore di resistenza ideale è compreso tra 200 e 400 MΩ. Le pipette con una resistenza superiore a 400 MΩ potrebbero portare a una corrente instabile a causa delle loro piccole dimensioni (< diametro interno di 50 nm). Al contrario, le pipette con resistenze inferiori a 200 MΩ sono troppo grandi (> diametro interno di 70 nm) e non risolverebbero piccole caratteristiche. Si consiglia di iniziare l'imaging con le pipette di resistenza a 200 MΩ, in quanto sono più facili da produrre e tendono a fornire meno rumore elettrico.

2. Ridurre al minimo le derive e le vibrazioni del campione

NOTA: per ridurre il rumore meccanico nel sistema durante l'imaging, montare i campioni sulle camere personalizzate che utilizzano vetrine spesse (~ 1,2 mm):

1. Rimuovere la porzione di vetro da un piatto con fondo di vetro da 50 mm, lasciando intatte le pareti di plastica.
2. Incollare la parte di plastica del piatto di coltura cellulare sopra il vetrino spesso con colla siliconica.
3. Montare il campione di calibrazione al centro della camera (sulla parte superiore della diapositiva di vetro) utilizzando colla siliconica o nastro biadesivo sottile.
4. Fissare saldamente la camera sul palco HPICM utilizzando nastro biadesivo.
5. Durante l'imaging, chiudere la gabbia di Faraday e coprirla con una coperta per ridurre al minimo le interferenze elettriche e la deriva termica, di conseguenza.

3.Testare la risoluzione con gli standard di calibrazione AFM

NOTA: si consiglia vivamente di visualizzare gli standard AFM (vedere Tabella dei materiali)prima di creare immagini di cellule vive al fine di risolvere i problemi del sistema e testarne la risoluzione negli assi X-Z-Y. Gli standard di calibrazione hanno pilastri e fori di biossido di silicio di diverse forme ma altezze / profondità fisse (cioè 20 o 100 nm) su un chip di silicio 5 x 5 mm. Si consiglia di iniziare con lo standard di calibrazione a 100 nm, per garantire che la risoluzione Z sia inferiore a 100 nm. Dopo aver ottenuto un'immagine ad alta risoluzione dei pilastri o dei fori in questo campione di calibrazione (Figura 3A), passare allo standard a 20 nm. Se l'imaging di quest'ultimo standard ha successo (Figura 3B), la risoluzione nell'asse Z è garantita per essere inferiore a 20 nm e appropriata per l'imaging dei fasci di stereociglia delle cellule ciliate¹². I seguenti passaggi vengono utilizzati per visualizzare entrambi gli standard di calibrazione.

1. Collegare lo standard di calibrazione alla camera con colla siliconica.
2. Aggiungere 4 mL di HBSS alla camera per coprire il campione di calibrazione. Quindi, fissare la camera allo stadio XY della configurazione HPICM utilizzando nastro biadesivo.
3. Bloccare il supporto magnetico dell'elettrodo di terra allo stadio vicino alla camera e immergere l'elettrodo nella soluzione da bagno (Figura 1B).
4. Montare la nanopipetta nel supporto, immergerla nella soluzione del bagno e impostare la sua corrente su ~1 nA seguendo i passaggi descritti nella Sezione 1.
5. Posizionare la nanopipetta approssimativamente sopra il centro dello standard di calibrazione utilizzando un manipolatore patch-clamp di corso. L'ispezione visiva è di solito sufficiente per questo posizionamento, poiché l'area coperta da strutture di biossido di silicio è relativamente grande (1 x 1 mm). A differenza dell'organo degli espianti Corti (vedi sotto), lo standard di calibrazione non è trasparente e, pertanto, non è possibile un posizionamento più preciso guidato dall'imaging ottico per questo campione.
6. Aumentare il setpoint mentre si monitora il segnale dal sensore dell'attuatore piezoelettrico Z su un oscilloscopio in tempo reale. Dopo aver stabilito un ciclo di avvicinamento Z ripetibile stabile (come nella Figura 1C, in basso), diminuire il setpoint al valore che è appena sopra il punto di instabilità. Questa procedura garantirebbe il setpoint ottimale per questa particolare nanopipetta.
7. Spostare la pipetta verso il basso ad una velocità di ~ 5 μm / s con un micromanipolatore a morsetto patch fino a raggiungere il campione. In questo momento, il livello inferiore del segnale di posizionamento Z in tempo reale (Figura 1C) aumenterà, indicando che la nanopipetta viene ritirata a causa del "rilevamento" della superficie del campione. Qualsiasi ulteriore movimento della nanopipetta comporterà un ulteriore spostamento positivo del segnale di posizionamento Z.
   NOTA: Fare attenzione a non superare il limite superiore del movimento dell'attuatore piezoelettrico Z.
8. Avviare l'imaging a bassa risoluzione (vedere Tabella 1). A causa del montaggio irregolare dello standard AFM, il punto più alto dell'area di interesse potrebbe essere sconosciuto. Pertanto, impostare l'ampiezza della retrazione della pipetta (ampiezza del salto) su almeno 200-500 nm.
   1. Una volta identificato il punto più alto del campione nell'area di imaging, diminuire l'ampiezza del luppolo. Un'ampiezza di hop più piccola consente una scansione più rapida, che è preferita per l'imaging ad alta risoluzione a causa degli effetti diminuiti delle derive e della diminuzione delle vibrazioni.
9. Prima di spostare la pipetta in una nuova posizione X-Y, ritraerla di circa 200 μm nell'asse Z per evitare collisioni indesiderate con il campione.
   NOTA: nei casi in cui la nanopipetta non è allineata con il centro dello standard di calibrazione, è possibile che la scansione inizi appena fuori dall'area delle caratteristiche superficiali.
10. Dopo aver trovato l'area di interesse, iniziare a visualizzare l'imaging a una risoluzione più elevata (vedere Tabella 1).

4. Realizzazione di camere su misura per fissare gli espianti cocleari

NOTA: Montare gli espianti cocleari nelle camere con sistemi di serraggio personalizzati che utilizzano pipette di vetro flessibili (fase 4.1) (Figura 4A) o filo interdentale (fase 4.2) (Figura 4B). La camera della pipetta di vetro potrebbe essere sterilizzata e utilizzata per gli organi coltivati di Corti, mentre la camera del filo interdentale fornisce una tenuta più sicura del campione e un controllo sull'orientamento del fascio stereocilia durante il montaggio. Queste camere personalizzate devono essere preparate in anticipo, ma possono essere pulite e riutilizzate in diverse sessioni di imaging.

1. Crea una camera usando pipette di vetro flessibili
   1. Estrarre due fibre di vetro sottili e flessibili dai capillari di vetro utilizzando un estrattore di pipette. Le nostre fibre di vetro tirate misurano in genere da 1 a 2 cm di lunghezza e sono abbastanza flessibili.
   2. Posizionare una piccola goccia dell'elastomero siliconico sopra una copertura di vetro. Utilizzare coverslips di 2 cm di diametro.
   3. Posizionare le estremità di due fibre di vetro sulla goccia di silicone e disporre le fibre in modo da avere un piccolo grado di separazione tra loro (Figura 4A).
   4. Posizionare il coperchio su una piastra calda per polimerizzare rapidamente l'elastomero (da 1 a 3 minuti).
   5. Incollare il coperchio sul fondo di vetro della camera descritto nella sezione 2 utilizzando una piccola quantità (1-3 μL) di elastomero siliconico e lasciandolo polimerizzare durante la notte.
2. Fare una camera usando il filo interdentale:
   1. Rimuovere la porzione di vetro di un piatto con fondo di vetro da 50 mm, lasciando intatte le pareti di plastica. Quindi incollare la parte in plastica del piatto di coltura cellulare sopra un vetrino di 1,2 mm di spessore con colla siliconica.
   2. Montare un coperchio di plastica (6,5 x 6,5 mm) con la stessa colla al centro della camera. Quindi ripetere il processo con un altro coverslip sopra il precedente.
   3. Montare due piccoli fili di tungsteno o placcati in oro (12 mm di lunghezza e ~ 0,5 mm di diametro) con colla siliconica, ciascuno ai lati opposti delle diapositive del coperchio. Incollarli abbastanza lontano (> 10-15 mm) dalle diapositive di copertura (Figura 4B).
   4. Separare due fili di filo interdentale e posizionarli sopra le diapositive di copertura e fissarli ai fili facendo un nodo. Lasciare un piccolo spazio tra i due fili (Figura 4B, frecce corte).
3. Pulire le camere dopo ogni utilizzo
   1. Rimuovere delicatamente il tessuto dalla camera con una pinzetta fine e raschiare leggermente eventuali residui di tessuto lasciati.
   2. Risciacquare prima la camera con etanolo al 70% e poi con acqua distillata.
   3. Ripetere il ciclo di risciacquo se necessario.
   4. Posizionare la camera capovolta su una carta da filtro per lasciarla asciugare fino al prossimo esperimento. Le camere non hanno bisogno di essere sterilizzate, a meno che la coltura dell'organo di Corti non sia pianificata dopo l'imaging.

5. Dissezionare l'organo roditore di Corti

1. Eseguire la dissezione dei giovani espianti cocleari postnatali come descritto in dettaglio altrove¹³.
2. Per l'imaging HPICM, sezionare l'organo di Corti dai topi tra i giorni postnatali 3 e 6 (P3-6) e dai ratti tra i giorni postnatali 3 e 8 (P3-8).
   NOTA: le cellule ciliate più vecchie sono più suscettibili al danno durante la dissezione e, pertanto, non possono essere utilizzate per l'imaging HPICM di ore di intervallo di tempo.
3. Non dimenticare di rimuovere la membrana tectoriale prima dell'imaging HPICM.
4. Immediatamente dopo la dissezione, fissare il tessuto in una delle camere descritte nella sezione 4, posizionandolo sotto le pipette di vetro flessibili o sotto i due fili di filo interdentale (Figura 4). Pre-riempire queste camere con 4 ml della soluzione da bagno a temperatura ambiente (per ridurre al minimo la formazione di bolle).

6. Imaging delle cellule ciliate uditive

1. Montare la camera con un organo appena isolato di Corti sullo stadio piezoelettrico X-Y usando nastro biadesivo e assicurarsi che sia saldamente fissato per ridurre al minimo la deriva della camera negli assi X e Y (Figura 1B).
2. Seguire i passaggi descritti nella Sezione 1 per posizionare una nuova nanopipetta e verificare la corretta resistenza della pipetta.
3. Utilizzando il micromanipolatore patch clamp, posizionare la nanopipetta sulla regione delle cellule ciliate, osservando l'organo di Corti espiantare in un microscopio invertito.
4. Controllare se il sistema è stabile con un setpoint pari o inferiore allo 0,5% registrando la corrente in tempo reale e il segnale di posizionamento Z sull'oscilloscopio (come in Figura 1C). Se il segnale Z non è stabile, provare a ridurre la frequenza di taglio del filtro passa-basso dell'amplificatore patch clamp. Tuttavia, non può essere inferiore al tempo di risposta dell'attuatore piezoelettrico Z (per evitare la collisione della pipetta con il campione a causa di letture di corrente ritardate).
   NOTA: In pratica, l'impostazione a 5 kHz di questo filtro risulta essere ottimale. È meglio sostituire la nanopipetta, se il segnale Z è ancora instabile.
5. Una volta ottenuta una registrazione stabile, determinare il setpoint ottimale e avvicinarsi al campione con pipetta HPICM come descritto nei passaggi 3.6-3.7 di cui sopra.
6. In primo luogo, eseguire l'imaging a bassa risoluzione (vedere Tabella 1), utilizzando un'ampiezza di hop di almeno 6-8 μm. Per visualizzare strutture alte come i fasci di stereociglia delle cellule ciliate, assicurarsi che l'ampiezza del salto sia sufficiente per evitare la collisione con queste strutture.
   NOTA: Se l'ampiezza del luppolo non è sufficiente, la pipetta non sarà in grado di saltare sopra uno stereocilium e ci sarà una collisione imminente. La collisione della sonda HPICM con uno stereocilium può danneggiare il fascio di capelli. Pertanto, nei casi in cui l'altezza del fascio stereocilia è incerta, utilizzare un'ampiezza di hop maggiore.
7. Acquisire familiarità con la topografia dell'organo di Corti eseguendo e/o studiando prima le immagini ottenute con la microscopia elettronica a scansione (Figura 5).
   NOTA: se l'immagine HPICM è uniforme con altezze inferiori a 1 μm in ogni punto di imaging, è probabile che la pipetta stia scansionando il fondo di vetro e non il tessuto. In alternativa, la pipetta può "atterrare" su una regione diversa dell'espianto cocleare, lontano dalle cellule ciliate.
8. Se la pipetta deve essere spostata in una nuova posizione X-Y, ritraerla di circa 500 nm per evitare collisioni con qualsiasi caratteristica alta all'interno del tessuto. Ripeti l'imaging HPICM a bassa risoluzione fino a trovare la regione di interesse con le cellule ciliate.
9. Dopo aver trovato la regione di interesse, iniziare a visualizzare l'imaging a una risoluzione più elevata (vedere Tabella 1). Cerca di spendere meno di 15 minuti quando immagini un fascio di capelli interi.
   NOTA: i fasci di cellule ciliate nel tessuto vivo non sono fermi ma possono cambiare il loro orientamento, ad esempio, a causa di cambiamenti di forma nelle cellule di supporto sottostanti. Pertanto, le immagini possono presentare artefatti di movimento se l'acquisizione dell'immagine è troppo lenta.
10. Ancora una volta, determinare le caratteristiche più alte nelle immagini a bassa risoluzione prima di diminuire l'ampiezza di hop per l'imaging ad alta risoluzione. Per una regione di interesse che copre l'intero fascio di cellule ciliate, ridurre l'ampiezza del luppolo a 4-5 μm, mentre per una regione relativamente piccola e "piatta" all'interno del fascio (ad esempio, 2 x 2 μm) ridurre ulteriormente l'ampiezza del luppolo, fino a meno di 1 μm, aumentando così la velocità e la risoluzione dell'imaging.

7. Elaborazione delle immagini

NOTA: gli artefatti di imaging sono comuni nell'imaging HPICM. Alcuni di essi possono essere corretti da parametri di acquisizione delle immagini, mentre altri richiedono la post-elaborazione con un visualizzatore SICM specializzato o con programmi di elaborazione dati più generali come ImageJ o MatLab. Qui descriviamo gli artefatti più comuni e come li risolviamo con il visualizzatore SICM.

1. Eseguire la correzione della pendenza
   NOTA: non è ovvio per un principiante, ma l'occhio umano non può risolvere le caratteristiche di dimensioni sub-micrometriche sulla superficie di una cellula, se l'area di imaging ha una pendenza complessiva di dimensioni uguali o maggiori(Figura 3A,B,a sinistra). Pertanto, è necessario determinare la pendenza media di un'area ripresa (adattando i dati dell'immagine HPICM 3D a un singolo piano) e sottrarla dall'immagine HPICM (Figura 3A,B, al centro).
   1. Fare clic su Apri per aprire un'immagine con il visualizzatore SICM.
   2. Selezionare la scheda Correzione immagine.
   3. Selezionare la scheda Pendenza corretta.
   4. Premere il pulsante Pendenza corretta per una correzione automatica della pendenza.
2. Eseguire l'allineamento delle linee
   NOTA: Come accennato in precedenza, le derive meccaniche e/o termiche e gli artefatti del movimento cellulare rappresentano un problema significativo nell'imaging HPICM. Una piccola deriva con una velocità inferiore a un micrometro al minuto di solito non è evidente in una normale configurazione del morsetto patch. Tuttavia, potrebbe produrre artefatti di diverse decine di nanometri nell'imaging HPICM, che è significativamente più grande della risoluzione di HPICM. Pertanto, non è raro incontrare salti improvvisi nell'asse Z tra due linee di scansione HPICM vicine durante l'imaging. Questo potrebbe essere corretto analizzando le differenze tra i valori Z iniziali (e / o finali) in queste linee di scansione vicine.
   1. Fare clic su Apri per aprire un'immagine con il visualizzatore SICM.
   2. Selezionare la scheda Correzione immagine.
   3. Selezionare la scheda Pendenza corretta.
   4. Scegli la larghezza delle linee da allineare. Premere il pulsante ButtonDestripeLineFit per una correzione automatica dell'allineamento delle linee.
3. Eseguire la riduzione del rumore
   NOTA: durante l'ottenimento di immagini con HPICM, piccole fluttuazioni nella corrente della nanopipetta possono portare la nanopipetta a fermarsi lontano dalla superficie del campione, specialmente con setpoint bassi. Si traduce nella comparsa di piccoli punti bianchi nell'immagine. Per correggere questo artefatto di imaging, è necessario identificare i punti di imaging con il valore Z significativamente più grande di quello dei vicini e sostituire questo valore con una media dei vicini. Questo viene fatto da un filtro mediano regolabile.
   1. Fare clic su Apri per aprire un'immagine con il visualizzatore SICM.
   2. Selezionare la scheda Elaborazione immagini.
   3. Selezionare la scheda Riduzione rumore.
   4. Impostate il filtro Soglia (μm) per i pixel da rimuovere.

Risultati

Il protocollo presentato in questo documento può essere utilizzato per visualizzare qualsiasi cellula viva con topografia complessa. Seguendo questi passaggi, otteniamo regolarmente immagini di fasci di cellule ciliate uditive di ratto vivo (Figura 6B, D). Nonostante abbiano una risoluzione X-Y inferiore rispetto alle immagini SEM, le nostre immagini HPICM possono risolvere con successo le diverse file di stereociglia, la forma delle punte stereociglia e persino i piccoli c...

Discussione

Per ottenere immagini HPICM di successo, gli utenti devono stabilire un sistema a basso rumore e basse vibrazioni e produrre pipette appropriate. Raccomandiamo vivamente l'uso di standard di calibrazione AFM per testare la stabilità del sistema prima di tentare di eseguire qualsiasi imaging di cellule vive. Una volta testata la risoluzione del sistema, gli utenti possono prendere in considerazione l'imaging di organi fissi di campioni Corti per familiarizzare con le impostazioni di imaging prima di tentare qualsiasi ima...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analog oscilloscope	B&K Precision	2160C	Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach
AFM calibration standards	TED PELLA Inc	HS-100MG; HS-20MG	These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system
Benchtop vibration Isolator	AMETEK/TMC	Everstill K-400	Active vibration isolation
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments (WPI)	1B100F-4	Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	To be added to the bath solution to adjust osmolarity
Digitizer	National Instruments Corporation	PCI-6221	Multi-channel input/output digitizer
Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement	Standford Research Systems	SIM900, SIM960, SIM980	Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.
Faraday cage	AMETEK/TMC	Type II	Required to shield electromagnetic interference
Glass bottom dish	World Precision Instruments (WPI)	FD5040-100	Used as the dish for the chamber for the tissue
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	14025092	Extracellular (bath) solution
Instrumentation amplifier	Brownlee Precision	Model 440	Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation
Laser-based micropipette puller	Sutter Instrument	P-2000/G	Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.
Lebovitz's L-15, without phenol red	Gibco, Thermo Fisher Scientific	21083027	Extracellular (bath) solution
Micromanipulator	Scientifica	PatchStar	Used for "course" positioning of the Z piezo actuator
Microscope	Nikon	Eclipse TS100	Inverted optical microscope
Patch amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B	The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette
Piezo amplifier (XY axes)	Physik Instrumente (PI)	E-500.00, E-505.00, E-509.C2A	Amplification and PID control for XY piezo translation stage
Piezo amplifier (Z axis)	Piezosystem jena	ENT 400 & 800	Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA
Plastic Coverslips	TED PELLA Inc	26028	Used in the fabrication of the chambers for the tissue
SICM controller & software*	Ionscope, UK (ionscope.com)	N/A	Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd
Silicone elastomer (Sylgard)	World Precision Instruments (WPI)	SYLG184	Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue
Silicon glue	The Dow Chemical Company	734	Used to glue the different parts of the chamber for the tissue
Tungsten rod	A-M Systems	717500	Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue
XY piezo nanopositioner	Physik Instrumente (PI)	P-733.2DD	XY translation stage with capacitive sensors
Z piezo nanopositioner	Piezosystem jena	RA 12/24 SG	Ring piezoactuator with a strain gage sensor
*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:  NX12-Bio and NX10 SICM,
Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original
HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically
challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one
modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.