真菌形态、环形和味觉味蕾的全镶嵌染色、可视化和分析

摘要

本文描述了整个真菌样、环形和上颚味蕾的组织制备、染色和分析方法，这些味蕾始终如一地产生完整和完整的味蕾（包括支配它们的神经纤维），并保持味蕾内结构与周围之间的关系。

摘要

味蕾是味觉转换细胞的集合，专门用于检测口腔中化学刺激的子集。这些转导细胞与神经纤维进行通信，神经纤维将这些信息传递到大脑。由于味觉转换细胞在整个成年期不断死亡并被替换，因此味蕾环境既复杂又动态，需要对其细胞类型，位置以及它们之间的任何物理关系进行详细分析。详细的分析受到舌组织异质性和密度的限制，这些异质性和密度显著降低了抗体通透性。这些障碍需要切片方案，导致将味蕾分裂到各部分之间，以便测量值仅为近似值，并且丢失细胞关系。为了克服这些挑战，本文描述的方法涉及从三个味觉区域收集，成像和分析整个味蕾和单个末端乔木:真菌状，环状和上颚。收集整个味蕾可减少偏差和技术变异性，并可用于报告特征的绝对数字，包括味蕾体积，总味蕾神经支配，转导细胞计数和单个末端乔木的形态。为了证明这种方法的优点，本文使用一般的味蕾标记和所有味觉纤维的标签，对真菌样和环形味蕾之间的味蕾和神经支配体积进行了比较。还提供了使用味觉神经元稀疏细胞遗传标记（具有味觉转导细胞的标记子集）的工作流程。该工作流程使用图像分析软件分析单个味觉神经乔木的结构，细胞类型数以及细胞之间的物理关系。总之，这些工作流程为组织制备和分析整个味蕾及其支配乔木的完整形态提供了一种新颖的方法。

引言

味蕾是50-100个专门的上皮细胞的集合，它们结合口腔中存在的化学味觉刺激的亚群。味觉转换细胞通常被认为是^{1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型、8型、9}型，最初是基于电子显微镜标准，后来与分子标记相关。II型细胞表达磷脂酶C-β2（PLCβ2）2和瞬时受体电位阳离子通道，亚家族M成员5¹包括转导甜味、苦味和鲜味^1、10的细胞。III型细胞表达碳酸酐酶4（Car4）11和突触体相关蛋白25^8，并表示主要对酸味¹¹作出反应的细胞。转导咸度的细胞没有明确描绘^{12，13，14，}但可能包括I型，II型和III型细胞15，16，17，18，19。味蕾环境是复杂和动态的，因为味觉转换细胞在整个成年期不断翻转，并被基底祖^3，20，21取代。这些味觉转换细胞连接到来自膝状神经节和岩神经节的假单极神经纤维，后者将味觉信息传递到脑干。这些神经元主要根据它们携带的味觉信息^22，23进行分类^，因为直到最近^24，关于它们形态的信息一直难以捉摸。II型细胞通过钙稳态调节蛋白1离子通道²⁵与神经纤维通信，而III型细胞通过经典突触^8，26进行通信。味蕾细胞的进一步表征 - 包括转导细胞类型谱系，影响其分化的因素以及连接乔木的结构都是积极研究的领域。

味蕾研究受到一些技术挑战的阻碍。构成舌头的异质性和致密组织显着降低了免疫组织化学的抗体通透性27，28，29。这些障碍使得切片方案成为必要，导致味蕾在各部分之间分裂，以便根据代表性部分近似测量或跨部分相加。以前，代表性薄片用于近似体积值和探头计数^30。较厚的串行切片允许对所有味蕾切片进行成像，并对每个部分³¹的测量值进行求和。切割如此厚的切片并仅选择整个味蕾偏向于较小的味蕾32，33，34。来自切片味蕾的神经神经支配估计是基于对像素数^13，35的分析，如果量化在所有^{36，37，38。}这些测量完全忽略了单个神经心轴的结构和数量，因为心轴是分裂的（并且通常标记不良）。最后，虽然剥离上皮确实允许整个味蕾被染色^39，40，但它也去除味蕾神经纤维，并可能破坏细胞之间的正常关系。因此，由于染色方法引起的这种破坏，对味蕾内结构关系的研究受到限制。

全结构收集消除了对代表性切片的需求，并允许确定体积，细胞计数和结构形态的绝对值测量^41。这种方法还可以提高准确性，限制偏差并减少技术可变性。最后一个元素很重要，因为味蕾在^{34、42和跨区域43、44}和整个味蕾分析中都显示出相当大的生物变异性，因此可以在对照和实验条件之间比较绝对细胞数量。此外，收集完整味蕾的能力允许分析不同转导细胞与其相关神经纤维之间的物理关系。因为变味细胞⁴⁵可以相互交流，并且确实与神经纤维⁴⁶通信，这些关系对正常功能很重要。因此，功能丧失条件可能不是由于细胞的丧失，而是由于细胞关系的变化。这里提供了一种收集整个味蕾的方法，以实现绝对测量的好处，以改进味蕾及其神经支配，味细胞计数和形状的体积分析，并促进转导细胞关系和神经乔木形态的分析。这种用于组织制备的新型全贴装方法的下游还介绍了两种工作流程:1）用于分析味蕾体积和总神经支配，2）用于味觉神经元的稀疏细胞遗传标记（标记了味觉转导细胞的子集），以及随后分析味神经乔木形态，味觉细胞类型的数量及其形状，以及使用图像分析软件来分析转导细胞与转导细胞之间的物理关系。 细胞及其神经乔木。总之，这些工作流程为组织制备以及整个味蕾及其支配乔木的完整形态的分析提供了一种新颖的方法。

研究方案

注意:所有动物都按照美国公共卫生服务政策关于实验动物的人道护理和使用以及NIH实验动物护理和使用指南制定的指南进行护理。Phox2b-Cre小鼠（MMRRC菌株034613-UCD，NP91Gsat / Mmcd）或TrkB^CreER 小鼠（Ntrk2^{tm3.1（cre / ERT2）Ddg）}与tdTomato报告小鼠（Ai14）一起繁殖。Advillin^CreER47 与Phox2b-flpo⁴⁸ 和Ai65一起繁殖。对于5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）注射液，制备EdU并根据Perea-Martinez等人⁴⁹计算剂量。

1. 准备材料

1. 溶液的制备
   1. 将5.244g磷酸一元酸钠和23.004g磷酸氢钠溶解在双蒸馏水（ddH₂O）中搅拌板上。调节pH值至7.4，并带来总体积，得到1L的0.2M磷酸钠缓冲液（PB）。
   2. 在通风橱中通过加热同时在搅拌板上搅拌直到溶液达到90°C，将多聚甲醛溶解在通风橱中的_{ddH 2}O中。 滴加4M NaOH溶液以清除多聚甲醛，并使用真空锥形瓶和陶瓷过滤器用滤纸过滤溶液。加入等体积的0.2 M PB，并将pH调节至7.4，在0.1 M PB中获得4%的PFA。

2. 组织制备

1. 组织收集
   1. 使用含有10mL无菌盐水和0.25mL含有5g2，2，2-三溴乙醇和5mL叔戊醇的工作溶液使用麻醉过量处死小鼠。经心电图灌注4%PFA，0.1M PB;去除舌头和上颚。
   2. 使用分隔后舌的冠状切口隔离环状味蕾，在颞间隆起后面;用剃刀刀片切掉味蕾;然后将中线的前舌一分为二。在4°C下固定后过夜，在0.1M PB中PFA为4%。
   3. 在4°C下用30%蔗糖冷冻保护组织过夜。
      注意:如果必须在此处暂停该过程，则可以使用2-甲基丁烷在干冰上的烧杯中冷却并在-80°C下储存组织，以最佳切割温度（OCT）化合物冷冻组织。
2. 真菌味蕾
   1. 在干冰上的烧杯中冷却2-甲基丁烷，为步骤2.2.8做准备。
   2. 解冻并以0.1 M PB冲洗舌头。将含有真菌样的前舌头的一半放在解剖显微镜下的载玻片上。
   3. 使用钝头镊子和解剖剪刀去除肌肉。当舌上皮弯曲时，使用钝端镊子保持组织开放，并通过保持粗解剖剪刀的刀片平行于上皮来确保平坦的方向。
   4. 丢弃舌头的腹侧非角化上皮，因为它不含味蕾。
   5. 使用精细解剖剪刀更紧密地解剖角质化上皮的下侧。
      注意:重要的是在靠近上皮的地方解剖，以使剩余的肌有均匀的厚度，并且表面光滑，以确保均匀的抗体渗透。剩余肌肉厚度不均匀的后果是低温恒温器上的切片不均匀，上皮暴露在肌肉较少的区域，而其他区域的肌肉层较厚，这阻碍了抗体的渗透。
   6. 使用钝端镊子将一块上皮细胞放入组织模具（肌肉面朝下），并确保其平放。一旦组织扁平，向组织中添加一滴OCT。
      注意:鉴于舌尖是弯曲的，可能需要在上皮上切开，使其弯曲，以便组织可以平放。
   7. 将组织模具放在解剖镜下的金属底座（先前在干冰中冷却）。继续用镊子轻轻敲击组织，直到OCT冻结，以确保组织尽可能平坦地冻结。
   8. 一旦OCT冷冻，迅速添加额外的OCT，并将模具放入2-甲基丁烷（在干冰中冷却）的烧杯中直到冷冻。
   9. 低温恒温器切片
      注意:低温恒温器用于精细去除剩余的皮下组织，这可能会抑制抗体渗透（图1）。
      1. 将OCT模具安装在低温恒温器上，并切割20μm切片。收集每个部分，并在光学显微镜下观察它以评估其与上皮基底的接近程度（图1E - H）。
      2. 从上皮的下侧剃除组织后，解冻上皮并在摇床上以0.1M PB冲洗两次。
3. 环形味蕾
   1. 使用用剃刀刀片切割的冠状，将环状与前舌分开。使用同一剃须刀片进行两个矢状旁切口，在解剖镜下切除的外侧组织。使用镊子将置于组织模具中，使环状的一个侧边缘朝向组织模具的底部。
      注意:如果必须在此处暂停该过程，则可以使用2-甲基丁烷在干冰上的烧杯中冷却并在-80°C下储存组织。
   2. 在低温恒温器上将组织切成90μm的浮动部分。
4. 味蕾上的味蕾
   1. 切开软腭和硬腭交界处的前硬腭（图2）。使用剪刀将软腭与下层组织分开，确保切除任何剩余的骨碎片。去除额外的肌肉和结缔组织。
      注意:一旦移除，所有剩余的组织将由腺体和松散的结缔组织组成，它们被轻轻地粘附在上颚的下侧。
   2. 用钝头镊子固定上颚，并用剃须刀片轻轻刮除剩余的腺体和松散的结缔组织。
      注意:如果必须在此处暂停该过程，则可以使用2-甲基丁烷在干冰上的烧杯中冷却并在-80°C下储存组织。

3. 免疫组化染色

1. 用0.1 M PB洗涤纸巾，3 x 15分钟。将组织置于1mL管中，用封闭溶液（3%驴血清，0.5%非离子表面活性剂（见 材料表），0.1M PB）在4°C过夜。
2. 除去封闭溶液，并将组织在抗体溶液（0.1M PB，0.5%非离子表面活性剂）中孵育一抗（兔抗PCLβ2）在4°C下5天。
3. 用0.1M PB洗涤，每次洗涤4×15分钟，并在4°C下在抗体溶液中孵育二级驴抗兔488抗体（1:500）2天。
4. 用0.1M PB洗涤，每次洗涤4×15分钟，并在抗体溶液中用5%正常兔血清阻断。
5. 用 0.1 M PB 洗涤，4 x 15 分钟。在4°C下将驴抗兔阻断抗体（20μg/ mL）在抗体溶液中孵育2天。
6. 用0.1M PB洗涤，每次洗涤4×15分钟，然后用与荧光标记偶联的一抗dsRed（兔）在抗体溶液中孵育5天，在4°C下。
7. 用0.1M PB洗涤，每次洗涤4×15分钟，然后用一抗（山羊抗Car4（1:500））在抗体溶液中孵育5天，在4°C下。
8. 用 0.1 M PB 洗涤，每次洗涤 4 x 15 分钟。用二级驴抗山羊647抗体（1:500）在抗体溶液中孵育2天，在4°C下。
9. 用0.1M PB洗涤，每次洗涤4×15分钟，并将（上皮面朝上）安装到水性安装介质中，并在组织切片上放置盖玻片。
   注意:如果使用来自不同物种的抗体，例如仅使用角蛋白-8和dsRed的情况，请在继续步骤3.9之前，将所有一抗添加到步骤3.2中的抗体溶液中，并将步骤3.3中的所有二抗添加到步骤3.9中。

4. 共聚焦成像和解卷积

1. 使用共聚焦显微镜捕获共聚焦图像，物镜为60倍（数值孔径= 1.40），4毫秒/像素，变焦为3，卡尔曼为2，尺寸为1024 x 1024。沿 z 轴选择 0.47 mm 的步长。要捕获对的神经支配，如果缩放范围为 3 的视野太窄而无法捕获的所有神经支配，请使用 2 . 5 的缩放。
2. 要反卷积图像，请注意某些设置将自动与图像一起导入;因此，请填写图像中捕获的模态、物镜、数值孔径、浸没介质、样品介质和荧光团的剩余细节。然后，选择"3D 反卷积"。

5. 图像分析

1. 味蕾和神经支配量
   1. 将解卷积的图像堆栈导入到基于像素的图像分析软件中（参见 材料表），以确定味蕾体积和味蕾内总神经支配量。
      1. 取消选中主对象菜单中的音量。
      2. 从"对象"菜单中选择"添加新曲面"。选择"跳过自动创建，手动编辑"，然后选择"轮廓"。
      3. 单击 "选择" 并观察箭头显示为 +， 以帮助跟踪味蕾的边框。移动切片机，勾勒出每个光学部分的味蕾。轮廓完成后，单击" 创建曲面"。
      4. 观察现在出现在主"对象"菜单中的味蕾音量 对象 。在 "工具"下找到味蕾的体积。
   2. 味蕾内的神经支配量
      1. 选择味蕾对象下的 铅笔 图标，然后选择" 全部遮罩"。
      2. 在下拉菜单中，选择与神经纤维标签对应的 荧光通道 。选中 创建重复通道。
      3. 选中将外表面体素设置为:，然后在框中键入0。
      4. 观察" 显示调整 "窗口中出现的新通道，该通道是味蕾中所选荧光通道的未更改副本。
      5. 在主 "对象 "菜单中，选择" 创建新曲面"。取消选中 跳过自动创建，手动编辑。
      6. 在 蓝色箭头 上单击两次以继续执行下一步。
      7. 单击 "删除"，然后单击 绿色双箭头 以完成表面，这表示味蕾中存在的神经纤维的体积。要查找体积的值，请选择神经纤维对象菜单下的 "工具 "，然后从下拉菜单中选择" 体积 "。
   3. 的神经支配体积
      1. 创建味蕾的体积，如第5.1节所述。
      2. 选择味蕾对象下的 铅笔 图标，然后选择" 全部遮罩"。
      3. 在下拉菜单中，选择与神经纤维标签对应的 荧光通道 。选中 创建重复通道。
      4. 选中将表面内的体素设置为:，然后在框中键入0。单击"确定"。
      5. 通过单击"添加新曲面"来生成曲面。选择"仅细分感兴趣的区域"。
      6. 点击 蓝色箭头，增加Z值，使感兴趣的区域从味蕾的底部开始。
      7. 在 蓝色箭头 上单击两次以继续执行下一步。
      8. 单击删除，然后单击绿色双箭头以完成表面，这表示对的神经支配体积。要查找体积的值，请选择神经纤维对象菜单下的"工具"，然后从下拉菜单中选择"体积"。
   4. 端子心轴接触分析
      1. 图像准备
         1. 转到 "编辑" 菜单，然后选择" 裁剪3D"。裁剪图像的四面八方，去除味蕾外的空间。
            注意:裁剪到靠近味蕾的位置，而不去除任何相关结构 - 任何多余的图像都会延长处理时间。
         2. 从主菜单中选择 编辑 ，单击 更改数据类型。从下拉菜单中选择 "收件人:32 位浮点数 "。
         3. 从"对象"菜单中选择"添加新曲面"。单击"跳过自动创建，手动编辑"，选择"轮廓"，然后将切片位置向右拖动以查找光学切片的总数。
         4. 生成等轴测体素，并确保体素不是矩形 （0.0691 x 0.0691 x 0.474） 作为 XxYxZ，而是体素分别为 0.0691 x 0.0691 x 0.0691，方法是将矩形划分为具有与原始矩形体素相同的荧光强度值的立方体。选择 图像属性。然后，将体素大小的 Z 值除以 X 或 Y 值 （= 0.474/0.0691），并将该值乘以上一步中找到的切片（光学切片）数。
         5. 返回主菜单上的"编辑"，然后选择"重新取样 3D"。
         6. 将 Z 值（切片数）替换为新计算的值。
      2. 创建基于荧光的自动表面
         1. 再次单击" 添加新曲面 "以添加新曲面，取消选择" 仅分割感兴趣的区域"，然后单击" 下一步"。
         2. 从 源通道 下拉菜单中，选择其中一种味觉转换细胞类型的 通道 。取消选择" 平滑"， 然后继续执行下一步。
         3. 不要改变下一个屏幕上显示图像中存在的荧光强度范围的任何内容。再次单击底部的 蓝色箭头 以转到下一步。
         4. 单击 删除，然后单击 绿色双箭头 完成曲面。
         5. 转到屏幕左侧的" 对象 "菜单，其中将显示已完成的单元格表面，并将其称为通用内容，例如 Surface 2。双击 曲面名称 ，根据标签所代表的内容对其进行命名。
            注意:在这种情况下，生成的表面基于 PLCß2 标记的单元。
         6. 如果有点而不是曲面，请在左下角的菜单下，单击" 曲面 "而不是" 中心点"。然后，在出现提示时单击" 确定 "。
         7. 对其他变味细胞标志物和神经纤维标志物重复步骤5.3.2.1-5.3.2.5。
         8. 保存（导出）进度。
         9. 单击主菜单中的单元格类型"表面"。从该对象的菜单中，单击"工具"，然后单击"距离变换"。
         10. 等待标题为"XTDistanceTransformation"的弹出框出现。选择"外部曲面对象"。记下"显示调整"菜单中显示的新通道，该菜单名为"到曲面名称的距离"。
         11. 从"对象"菜单中选择"神经纤维"表面。单击铅笔图标，然后单击"全部遮罩"。
         12. 从显示的下拉菜单中，选择新的通道到曲面的距离名称。记下"显示调整"窗口中显示的新通道，该窗口名为"到曲面的遮罩距离"名称。
         13. 使用 "对象 "主菜单创建新 对象 。取消选择 仅分割感兴趣的区域 ，然后单击 蓝色箭头。选择 到 PLCß2 通道的屏蔽距离 ，然后取消选中 平滑。
         14. 在下一个屏幕上，检查是否有任何区域，其中味觉转换细胞位于此软件可识别的神经纤维的最小距离内。为此，设置0.01-0.11μm的限值，以检查靠近神经纤维的任何受体细胞荧光。
         15. 在左侧的绿色框中键入 0.01 以设置下限阈值，按 Tab键。然后单击 红色按钮 并键入 0.11 以设置阈值上限。按 Tab 键 ，然后单击 底部的蓝色箭头 以继续执行下一步。
         16. 单击" 删除 "，然后单击 绿色双箭头 完成。
         17. 在"对象"菜单中的 PLCß2 的 0.01-0.11 范围内重命名此曲面。在对象菜单中选择在 PLCß2 曲面的 0.01 - 0.11 范围内。
         18. 选择铅笔，然后单击"全部遮罩"。从下拉菜单中选择红色（神经纤维）通道，然后单击"确定"。记下"显示调整"窗口中显示的新通道，该窗口名为"屏蔽 CHS2"。
         19. 点击 频道名称;重命名频道 在 PLCß2 的 0.01 - 0.11 内。
             注:这是一个荧光通道，表示所创建表面中存在的红色荧光通道的副本。
         20. 单击颜色选择器中间的白色。选择与结构颜色形成对比的颜色。
         21. 在此阶段导出（即保存）文件。
         22. 对其他味觉转导细胞标记物重复步骤5.4.2.9-5.4.2.21。
         23. 在此阶段导出（即保存）文件。
             注意:要分析一种标记的细胞类型与另一种细胞类型的接近程度，只需将步骤5.4.2.11（和以下步骤）中的神经纤维表面替换为感兴趣的对象以及与每个后续步骤相关的等效组件。

6. 神经元心轴重建和绝对细胞数定量

1. 末端心轴追踪和分析
   1. 在基于3D矢量的图像分析软件中打开解卷积图像文件（请参阅 材料表），选择 "跟踪"，单击" 神经元"，然后单击" 树突"。
   2. 滚动到图像堆栈中味蕾的底部。在滚动图像堆栈时，将每根光纤跟踪到最后。
   3. 在分支末尾，右键单击末尾并选择结束。在分支点，右键单击并选择"分叉节点"。
      注意:这允许跟踪一个分支到末尾，然后返回到分叉点并跟踪另一个分支，程序会识别此跟踪仍然是同一个神经元。
   4. 将数据文件另存为 .DAT文件，然后可以在基于3D矢量的图像分析软件中打开进行分析。

7. 细胞数定量

1. 在任何图像分析软件包中量化标记的味蕾细胞，只要可以在核水平上放置用于转导锚定在z位置的细胞类型的不同标记即可。

结果

用dsRed和角蛋白-8（一般味蕾标记物）抗体染色舌上皮，标记整个味蕾和所有味蕾神经支配的Phox2b-Cre:tdTomato小鼠^50，51（图3A）。对这些味蕾从毛孔到基底的成像给出了最高分辨率的x-y平面图像（图3A，B）。基于像素的成像程序的轮廓函数被用来勾勒出每个部分的味蕾外围（图3B）?...

讨论

开发一种持续收集和染色来自三个口腔味觉区域（真菌形，环状和味觉）的整个味蕾的方法，为分析味觉转导细胞，跟踪新掺入的细胞，神经支配以及这些结构之间的关系提供了显着的改进。此外，它有助于在标记群体⁵⁰内或外定位潜在的二级神经元标记物。这一点尤其重要，因为味觉也接受强大的躯体感觉神经支配^{52 ， 53 ，}这也可能标记一些味觉神经元。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	ACROS Organics	AC421430100
2-Methylbutane	ACROS	126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	711-007-003	15.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG	Jackson Immuno Research	712-605-150	(1:500)
AutoQuant X3 software	Media Cybernetics
Blunt End Forceps	Fine Science Tools	FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation Kit	Molecular Probes	C10637	Follow kit instructions
Coverglass	Marienfeld	107242
Cytokeratin-8	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826)	Troma1 supernatant	(1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse)	Roboz	RS-5619
Dissection Scissors (fine)	Moria	MC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A21206	(1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555	ThermoFisher Scientific	A31572	(1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgG	Jackson Immuno Research	805-477-008	(1:500)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
Glass slides	Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides)	12-550-15
Goat anti-Car4	R&D Systems	AF2414	(1:500)
Imaris	Bitplane	pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + Explorer	MBF Biosciences	3D vector based image analysis software
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121
Normal Rabbit Serum	Equitech-Bio, Inc	SR30
Olympus FV1000		(multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
Paraformaldehyde	EMD	PX0055-3	4% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRed	Living Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)	632496	(1:500)
Rabbit anti-PLCβ2	Santa Cruz Biotechnology	Cat# sc-206	(1:500)
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher Scientific	BP332-500
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	BP330-500
tert-Amyl alcohol	Aldrich Chemical Company	8.06193
Tissue Molds	Electron Microscopy Sciences	70180
Tissue-Tek® O.C.T. Compound	Sakura	4583
Triton X-100	BIO-RAD	#161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling Kit	ThermoFisher Scientific	Z25305	Follow kit instructions