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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt Methoden zur Gewebevorbereitung, Färbung und Analyse von ganzen Fungiform-, Zirkumvallat- und Gaumengeschmacksknospen, die konsistent ganze und intakte Geschmacksknospen (einschließlich der Nervenfasern, die sie innervieren) ergeben und die Beziehungen zwischen Strukturen innerhalb der Geschmacksknospen und der umgebenden Papille aufrechterhalten.

Zusammenfassung

Geschmacksknospen sind Ansammlungen von geschmackstransduzierenden Zellen, die darauf spezialisiert sind, Untergruppen chemischer Reize in der Mundhöhle zu erkennen. Diese transduzierenden Zellen kommunizieren mit Nervenfasern, die diese Informationen zum Gehirn transportieren. Da geschmackstransduzierende Zellen während des Erwachsenenalters kontinuierlich absterben und ersetzt werden, ist die Geschmacksknospenumgebung sowohl komplex als auch dynamisch und erfordert detaillierte Analysen ihrer Zelltypen, ihrer Standorte und aller physischen Beziehungen zwischen ihnen. Detaillierte Analysen wurden durch Zungen-Gewebe-Heterogenität und -Dichte eingeschränkt, die die Antikörperpermeabilität signifikant reduziert haben. Diese Hindernisse erfordern Schnittprotokolle, die dazu führen, dass Geschmacksknospen auf Abschnitte aufgeteilt werden, so dass Messungen nur angenähert werden und Zellbeziehungen verloren gehen. Um diese Herausforderungen zu meistern, umfassen die hier beschriebenen Methoden das Sammeln, Abbilden und Analysieren ganzer Geschmacksknospen und einzelner terminaler Dorne aus drei Geschmacksregionen: fungiforme Papillen, zirkumvallate Papillen und gaumen. Das Sammeln ganzer Geschmacksknospen reduziert Verzerrungen und technische Variabilität und kann verwendet werden, um absolute Zahlen für Merkmale wie Geschmacksknospenvolumen, Gesamtinnervation der Geschmacksknospen, Transduktionszellzahlen und die Morphologie einzelner terminaler Dorne zu melden. Um die Vorteile dieser Methode zu demonstrieren, bietet dieses Papier Vergleiche von Geschmacksknospen und Innervationsvolumina zwischen Fungiform- und Circumvallat-Geschmacksknospen unter Verwendung eines allgemeinen Geschmacksknospenmarkers und eines Etiketts für alle Geschmacksfasern. Ein Workflow für die Verwendung der spärlichzelligen genetischen Markierung von Geschmacksneuronen (mit markierten Untergruppen von geschmackstransduzierenden Zellen) wird ebenfalls bereitgestellt. Dieser Workflow analysiert die Strukturen einzelner Geschmacksnervendorne, Zelltypnummern und die physikalischen Beziehungen zwischen Zellen mit Hilfe von Bildanalysesoftware. Zusammen bieten diese Workflows einen neuartigen Ansatz für die Gewebevorbereitung und Analyse sowohl ganzer Geschmacksknospen als auch der vollständigen Morphologie ihrer innervierenden Dorne.

Einleitung

Geschmacksknospen sind Ansammlungen von 50-100 spezialisierten Epithelzellen, die Untergruppen von chemischen Geschmacksreizen in der Mundhöhle binden. Geschmackstransduzierende Zellen werden allgemein als Typen 1,2,3,4,5,6,7,8,9angesehen, zunächst basierend auf elektronenmikroskopischen Kriterien, die später mit molekularen Markern korreliert wurden. Typ-II-Zellen exprimieren Phospholipase C-beta 2 (PLCβ2)2 und transienten Rezeptorpotential-Kationenkanal, Unterfamilie M-Mitglied5 1 und umfassen Zellen, die süß, bitter und Umami transduzieren1,10. Typ-III-Zellen exprimieren Carboanhydrase 4 (Car4)11 und synaptosomal-assoziiertes Protein25 8 und bezeichnen Zellen, die primär auf sauren Geschmack reagieren11. Die Zellen, die Salzigkeit transduzieren, wurden nicht so klar abgegrenzt12,13,14, könnten aber möglicherweise Typ I, Typ II und Typ III Zellen15,16,17,18,19umfassen. Die Geschmacksknospenumgebung ist komplex und dynamisch, da sich geschmackstransduzierende Zellen während des gesamten Erwachsenenalters kontinuierlich umdrehen und durch basale Vorläufer3,20,21ersetzt werden. Diese geschmackstransduzierenden Zellen verbinden sich mit pseudo-unipolaren Nervenfasern aus den genikulären und petrosalen Ganglien, die Geschmacksinformationen an den Hirnstamm weitergeben. Diese Neuronen wurden in erster Linie auf der Grundlage der Art von Geschmacksinformationenkategorisiert,die sie tragen22,23, weil Informationen über ihre Morphologie bis vor kurzem schwer fassbar waren24. Typ-II-Zellen kommunizieren mit Nervenfasern über Calcium-Homöostase-Modulator-Protein 1 Ionenkanäle25,während Typ-III-Zellen über klassische Synapsen8,26kommunizieren. Die weitere Charakterisierung von Geschmacksknospenzellen - einschließlich transduzierender Zelltyplinien, Faktoren, die ihre Differenzierung beeinflussen, und der Strukturen von Verbindungslauben sind alle Bereiche der aktiven Untersuchung.

Geschmacksknospenstudien wurden durch mehrere technische Herausforderungen behindert. Die heterogenen und dichten Gewebe, aus denen die Zunge besteht, reduzieren die Antikörperdurchlässigkeit für die Immunhistochemie signifikant27,28,29. Diese Hindernisse haben Schnittprotokolle erforderlich gemacht, die zur Aufteilung der Geschmacksknospen auf Abschnitte führen, so dass die Messungen entweder auf der Grundlage repräsentativer Abschnitte angenähert oder über Abschnitte hinweg summiert werden. Bisher wurden repräsentative Dünnschliffe verwendet, um sowohl Volumenwerte als auch transduzierende Zellzahlen30zu approximieren. Dickere serielle Schnitte ermöglichen die Abbildung aller Geschmacksknospenabschnitte und die Summierung der Messungen aus jeder Sektion31. Das Schneiden solcher dicken Abschnitte und die Auswahl nur ganzer Geschmacksknospen verzerrt die Probenahme zu kleineren Geschmacksknospen32,33,34. Nerveninnervationsschätzungen aus geschnittenen Geschmacksknospen basieren auf Analysen der Pixelzahlen13,35, wenn überhaupt quantifiziert36,37,38. Diese Messungen ignorieren die Struktur und Anzahl der einzelnen Nervenlauben vollständig, da Die Dorne gespalten (und in der Regel schlecht beschriftet) sind. Schließlich, obwohl das Abziehen des Epithels es ermöglicht, ganze Geschmacksknospen zufärben 39,40, entfernt es auch Geschmacksknospennervenfasern und könnte die normalen Beziehungen zwischen den Zellen stören. Daher waren untersuchungen der strukturellen Beziehungen innerhalb der Geschmacksknospen aufgrund dieser störung durch färbende Ansätze begrenzt.

Die Gesamtstruktursammlung macht repräsentative Abschnitte überflüssig und ermöglicht die Bestimmung von Absolutwertmessungen von Volumen, Zellzahlen und Strukturmorphologien41. Dieser Ansatz erhöht auch die Genauigkeit, begrenzt Verzerrungen und reduziert die technische Variabilität. Dieses letzte Element ist wichtig, da Die Geschmacksknospen sowohl innerhalb von34,42 als auch über die Regionen43,44hinweg eine beträchtliche biologische Variabilität aufweisen und Analysen des gesamten Geschmacksknospen es ermöglichen, absolute Zellzahlen zwischen Kontroll- und Versuchsbedingungen zu vergleichen. Darüber hinaus erlaubt die Fähigkeit, intakte Geschmacksknospen zu sammeln, die Analyse der physikalischen Beziehungen zwischen verschiedenen transduzierenden Zellen und den damit verbundenen Nervenfasern. Da geschmackstransduzierende Zellen miteinander kommunizieren können45 und mit Nervenfasernkommunizieren 46, sind diese Beziehungen wichtig für die normale Funktion. Daher können Funktionsverlustbedingungen nicht auf einen Verlust von Zellen zurückzuführen sein, sondern auf Veränderungen in den Zellbeziehungen. Hier ist eine Methode zum Sammeln ganzer Geschmacksknospen vorgesehen, um die Vorteile absoluter Messungen zur Verfeinerung von Volumenanalysen sowohl für Geschmacksknospen als auch für ihre Innervationen, Geschmackszellzahlen und -formen sowie zur Erleichterung der Analyse von transduzierenden Zellbeziehungen und Nerven-Dorn-Morphologien zu erreichen. Zwei Workflows werden auch nach dieser neuartigen Whole-Mount-Methode zur Gewebevorbereitung vorgestellt: 1) zur Analyse des Geschmacksknospenvolumens und der Gesamtinnervation und 2) zur spärlichen zellgenegenten genetischen Markierung von Geschmacksneuronen (mit Untergruppen von geschmackstransduzierenden Zellen) und anschließenden Analysen der Geschmacksnervenbaummorphologie, der Anzahl der Geschmackszelltypen und ihrer Formen sowie der Verwendung von Bildanalysesoftware zur Analyse der physikalischen Beziehungen zwischen transduzierenden Zellen und denen zwischen transduzierenden Zellen Zellen und ihre Nervenlauben. Zusammen bieten diese Arbeitsabläufe einen neuartigen Ansatz zur Gewebevorbereitung und für die Analyse ganzer Geschmacksknospen und der vollständigen Morphologie ihrer innervierenden Dorne.

Protokoll

HINWEIS: Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der U.S. Public Health Service Policy on the Humane Care and Use of Laboratory Animals und dem NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals betreut. Phox2b-Cre-Mäuse (MMRRC-Stamm 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) oder TrkBCreER-Mäuse (Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg) wurden mit tdTomato-Reportermäusen (Ai14) gezüchtet. AdvillinCreER47 wurden mit Phox2b-flpo48 und Ai65 gezüchtet. Für 5-Ethynyl-2′-desoxyuridin (EdU)-Injektionen wurde die EdU hergestellt und die Dosen gemäß Perea-Martinez et al.49berechnet.

1. Vorbereitung der Materialien

  1. Vorbereitung von Lösungen
    1. 5.244 g einbasisches Natriumphosphat und 23.004 g zweibasisches Natriumphosphat werden indoppelt destilliertem Wasser (ddH2O) auf einer Rührplatte gelöst. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein und bringen Sie das Gesamtvolumen, um 1 l 0,2 M Natriumphosphatpuffer (PB) zu erhalten.
    2. Paraformaldehyd in ddH2O ineinemAbzug durch Erhitzen unter Rühren auf einer Rührplatte lösen, bis die Lösung 90 °C erreicht. 4 M NaOH-Lösung tropfenweise zugeben, um das Paraformaldehyd zu entfernen, und die Lösung mit einem Vakuum-Erlenmeyerkolben und einem Keramikfilter mit Filterpapier filtriert. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 0,2 M PB hinzu und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, um 4% PFA in 0,1 M PB zu erhalten.

2. Gewebeaufbereitung

  1. Gewebeentnahme
    1. Opfern Sie Mäuse unter Verwendung einer Anästhesieüberdosierung mit einer Arbeitslösung, die 10 ml sterile Kochsalzlösung und 0,25 ml einer Stammlösung mit 5 g 2,2,2-Tribromethanol und 5 ml tert-Amylalkohol enthält. Transkarde perfundieren mit 4% PFA in 0,1 M PB; Entfernen Sie die Zungen und den Gaumen.
    2. Isolieren Sie die zirkumvallaten Geschmacksknospen mit einem koronalen Schnitt, der die hintere Zunge hinter der intermolaren Eminenz trennt; schneiden Sie die Geschmacksknospen mit einer Rasierklinge ab; und dann die vordere Zunge an der Mittellinie halbieren. Post-Fix über Nacht bei 4 °C mit 4% PFA in 0,1 M PB.
    3. Kryoschutz des Gewebes in 30% Saccharose über Nacht bei 4 °C.
      HINWEIS: Das Gewebe kann in optimaler Schneidtemperatur (OCT) mit 2-Methylbutan eingefroren werden, das in einem Becherglas auf Trockeneis gekühlt und bei -80 ° C gelagert wird, wenn das Verfahren hier unterbrochen werden muss.
  2. Fungiform Geschmacksknospen
    1. 2-Methylbutan in einem Becherglas auf Trockeneis in Vorbereitung auf Schritt 2.2.8 abkühlen.
    2. Tauen und spülen Sie die Zunge in 0,1 M PB. Legen Sie eine Hälfte der vorderen Zunge, die die fungiformen Papillen enthält, unter einem Seziermikroskop auf einen Glasobjektträger.
    3. Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette und eine Dissektionsschere, um den Muskel zu entfernen. Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um das Gewebe offen zu halten, während das Lingualepithel gekrümmt ist, und sorgen Sie für eine flache Ausrichtung, indem Sie die Klingen der groben Dissektionsschere parallel zum Epithel halten.
    4. Verwerfen Sie das ventrale nicht keratinisierte Epithel der Zunge, da es keine Geschmacksknospen enthält.
    5. Verwenden Sie eine feine Dissektionsschere für eine engere Dissektion an der Unterseite des keratinisierten Epithels.
      HINWEIS: Es ist wichtig, in der Nähe des Epithels zu sezieren, so dass der verbleibende Muskel von gleichmäßiger Dicke ist und die Oberfläche glatt ist, um eine gleichmäßige Antikörperpenetration zu gewährleisten. Die Folge einer ungleichmäßigen Dicke des verbleibenden Muskels ist eine ungleichmäßige Schnittbildung auf dem Kryostaten, wobei das Epithel in Bereichen mit weniger Muskeln und einer dickeren Muskelschicht für andere Bereiche freigelegt wird, was das Eindringen von Antikörpern behindert.
    6. Verwenden Sie die stumpfe Pinzette, um ein Stück Epithel in eine Gewebeform (Muskelseite nach unten) zu legen, und stellen Sie sicher, dass es flach liegt. Sobald das Gewebe flach ist, fügen Sie dem Gewebe einen Tropfen OCT hinzu.
      HINWEIS: Da die Zungenspitze gekrümmt ist, kann es notwendig sein, einen Schnitt im Epithel zu machen, wo es gekrümmt ist, so dass das Gewebe flach gelegt werden kann.
    7. Legen Sie die Gewebeform auf eine Metallbasis (zuvor in Trockeneis abgekühlt) unter dem Sezierfernrohr. Klopfen Sie mit der Pinzette leicht auf das Gewebe, bis das OCT eingefroren ist, um sicherzustellen, dass das Gewebe so flach wie möglich gefriert.
    8. Sobald das OCT gefroren ist, fügen Sie schnell zusätzliches OCT hinzu und legen Sie die Form in ein Becherglas aus 2-Methylbutan (in Trockeneis abgekühlt), bis es eingefroren ist.
    9. Kryostaten-Schnitt
      HINWEIS: Der Kryostat wird zur Feinentfernung des verbleibenden Unterhautgewebes verwendet, was die Antikörperpenetration hemmen kann (Abbildung 1).
      1. Montieren Sie die OCT-Formen auf dem Kryostaten und schneiden Sie 20 μm Abschnitte. Sammeln Sie jeden Abschnitt und betrachten Sie ihn unter dem Lichtmikroskop, um seine Nähe zur Basis des Epithels zu beurteilen (Abbildung 1E - H).
      2. Nachdem das Gewebe von der Unterseite des Epithels rasiert wurde, tauen Sie das Epithel auf und spülen Sie es zweimal in 0,1 M PB auf einem Shaker ab.
  3. Umlaufende Geschmacksknospen
    1. Mit einem koronalen Schnitt mit einer Rasierklinge trennen Sie die zirkumvallate Papille von der vorderen Zunge. Verwenden Sie zwei parasagittale Schnitte mit der gleichen Rasierklinge, um das Gewebe seitlich zur Papille unter einem Sezierfernrohr zu entfernen. Legen Sie die Papille mit einer Pinzette in eine Gewebeform, so dass eine seitliche Kante der umlaufenden Papille dem Boden der Gewebeform zugewandt ist.
      HINWEIS: Das Gewebe kann in OCT mit 2-Methylbutan eingefroren werden, in einem Becherglas auf Trockeneis gekühlt und bei -80 °C gelagert werden, wenn das Verfahren hier unterbrochen werden muss.
    2. Schneiden Sie das Gewebe in 90 μm schwimmende Abschnitte auf dem Kryostaten.
  4. Geschmacksknospen am Gaumen
    1. Schneiden Sie den harten Gaumen anterior bis zur Verbindung von weichem und hartem Gaumen (Abbildung 2). Verwenden Sie eine Schere, um den weichen Gaumen vom darunter liegenden Gewebe zu trennen, und stellen Sie sicher, dass alle verbleibenden Knochenfragmente weggeschnitten werden. Entfernen Sie zusätzliches Muskel- und Bindegewebe.
      HINWEIS: Nach der Entfernung besteht alles verbleibende Gewebe aus Drüsen und losem Bindegewebe, die leicht an der Unterseite des Gaumens haften.
    2. Halten Sie den Gaumen mit einer stumpfen Pinzette und entfernen Sie die verbleibenden Drüsen und das lose Bindegewebe, indem Sie sie vorsichtig mit einer Rasierklinge abkratzen.
      HINWEIS: Das Gewebe kann in OCT mit 2-Methylbutan eingefroren werden, in einem Becherglas auf Trockeneis gekühlt und bei -80 °C gelagert werden, wenn das Verfahren hier unterbrochen werden muss.

3. Immunhistochemische Färbung

  1. Waschen Sie das Taschentuch mit 0,1 M PB, 3 x 15 min. Legen Sie die Gewebe in 1 ml Röhrchen mit Blocklösung (3% Eselserum, 0,5% nichtionisches Tensid (siehe Materialtabelle),0,1 M PB) bei 4 °C über Nacht.
  2. Entfernen Sie die Blockierende Lösung und inkubieren Sie das Gewebe in primärer Antikörper (Kaninchen-Anti-PCLβ2) in Antikörperlösung (0,1 M PB, 0,5% nichtionisches Tensid) für 5 Tage bei 4 °C.
  3. Mit 0,1 M PB, 4 x 15 min pro Wäsche waschen und in sekundärem Esel Anti-Kaninchen 488 Antikörper (1:500) in Antikörperlösung für 2 Tage bei 4 °C inkubieren.
  4. Mit 0,1 M PB, jeweils 4 x 15 min waschen und mit 5% normalem Kaninchenserum in Antikörperlösung blockieren.
  5. Waschen mit 0,1 M PB, 4 x 15 min. Inkubieren sie mit einem Esel-Anti-Kaninchen-blockierenden Antikörper (20 μg/ml) in Antikörperlösung für 2 Tage bei 4 °C.
  6. Mit 0,1 M PB, 4 x 15 min pro Wäsche waschen, und dann mit dem primären Antikörper dsRed (Kaninchen) konjugiert zu einer fluoreszierenden Markierung (gemäß Herstellerangaben) in einer Antikörperlösung für 5 Tage bei 4 °C inkubieren.
  7. Mit 0,1 M PB, 4 x 15 min pro Wäsche waschen und dann mit dem primären Antikörper (Ziegen-Anti-Car4 (1:500)) in Antikörperlösung für 5 Tage bei 4 °C inkubieren.
  8. Waschen mit 0,1 M PB, 4 x 15 min pro Wäsche. Inkubieren mit sekundärem Esel Anti-Ziege 647 Antikörper (1:500) in Antikörperlösung für 2 Tage bei 4 °C.
  9. Waschen Sie mit 0,1 M PB, 4 x 15 min pro Wäsche, und montieren Sie (Epithelseite nach oben) in wässrigen Montagemedien und legen Sie einen Deckglas über den Gewebeabschnitt.
    ANMERKUNG: Wenn Sie Antikörper von verschiedenen Spezies verwenden, wie dies nur bei Keratin-8 und dsRed der Antikörperlösung der Fall ist, werden alle primären Antikörper in Schritt 3.2 und alle sekundären Antikörper in Schritt 3.3 hinzugefügt, bevor Sie mit Schritt 3.9 fortfahren.

4. Konfokale Bildgebung und Dekonvolution

  1. Erfassen Sie konfokale Bilder mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 60-fachen Objektiv (numerische Apertur = 1,40), 4 ms/Pixel, einem Zoom von 3, einem Kalman von 2 und einer Größe von 1024 x 1024. Wählen Sie eine Schrittweite von 0,47 mm entlang der z-Achse. Um die Innervation zur Papille zu erfassen, verwenden Sie einen Zoom von 2,5, wenn das Sichtfeld mit einem Zoom von 3 zu eng ist, um die gesamte Innervation zur Papille zu erfassen.
  2. Um die Bilder zu dekonvolutieren, beachten Sie, dass einige Einstellungen automatisch mit dem Bild importiert werden. Füllen Sie daher die restlichen Details für Modalität, Objektivlinse, numerische Apertur, Immersionsmedium, Probenmedium und im Bild aufgenommene Fluorophore aus. Wählen Sie dann 3D Deconvolutionaus.

5. Bildanalyse

  1. Geschmacksknospen und Innervationsvolumen
    1. Importieren Sie deconvolute Bildstapel in eine pixelbasierte Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle),um das Geschmacksknospenvolumen und das Volumen der Gesamtinnervation innerhalb der Geschmacksknospe zu bestimmen.
      1. Deaktivieren Sie Volume im Hauptmenü Objekt.
      2. Wählen Sie im Menü Objekt die Option Neue Flächen hinzufügen aus. Wählen Sie Automatische Erstellung überspringen, manuell bearbeitenund dann Konturaus.
      3. Klicken Sie auf Auswählen und beobachten Sie den Pfeil, der als + angezeigt wird, um den Rand der Geschmacksknospe zu verfolgen. Bewegen Sie den Datenschnitt und umreißen Sie die Geschmacksknospen in jedem optischen Abschnitt. Sobald die Konturen fertig sind, klicken Sie auf Fläche erzeugen.
      4. Beobachten Sie das Taste-Bud-Volumenobjekt, das jetzt im Hauptmenü Objekt angezeigt wird. Suchen Sie das Volumen der Geschmacksknospe unter Werkzeuge.
    2. Volumen der Innervation in der Geschmacksknospe
      1. Wählen Sie das Stiftsymbol unter dem Geschmacksknospenobjekt aus, und wählen Sie dann Alle maskierenaus.
      2. Wählen Sie im Dropdown-Menü den Fluoreszenzkanal aus, der der Nervenfasermarkierung entspricht. Aktivieren Sie Doppelte Kanal erstellen.
      3. Aktivieren Sie Voxel außerhalb der Fläche festlegen auf:, und geben Sie 0 in das Feld ein.
      4. Beobachten Sie den neuen Kanal, der im Fenster "Display-Anpassung" angezeigt wird und ein unverändertes Duplikat des fluoreszierenden Kanals ist, der in der Geschmacksknospe ausgewählt wurde.
      5. Wählen Sie im Hauptmenü Objekt die Option Neue Fläche erstellen aus. Deaktivieren Sie Automatische Erstellung überspringen, manuell bearbeiten.
      6. Klicken Sie zweimal auf den blauen Pfeil, um mit dem nächsten Schritt fortzufahren.
      7. Klicken Sie auf Löschenund dann auf den grünen Doppelpfeil, um die Oberfläche zu vervollständigen, die das Volumen der in der Geschmacksknospe vorhandenen Nervenfasern darstellt. Um den Wert für das Volume zu ermitteln, wählen Sie im Menü "Objekt" der Nervenfaser die Option "Werkzeuge" und dann im Dropdown-Menü die Option "Lautstärke".
    3. Volumen der Innervation zur Papille
      1. Erstellen Sie ein Volumen der Geschmacksknospe wie in Abschnitt 5.1 beschrieben.
      2. Wählen Sie das Stiftsymbol unter dem Tastenknospenobjekt aus, und wählen Sie dann Alle maskierenaus.
      3. Wählen Sie im Dropdown-Menü den Fluoreszenzkanal aus, der der Nervenfasermarkierung entspricht. Aktivieren Sie Doppelte Kanal erstellen.
      4. Aktivieren Sie Voxel innerhalb der Oberfläche festlegen auf: und geben Sie 0 in das Feld ein. Klicken Sie auf OK.
      5. Generieren Sie eine Fläche, indem Sie auf Neue Fläche hinzufügenklicken. Wählen Sie Nur eine Region von Interesse segmentieren aus.
      6. Klicken Sie auf den blauen Pfeilund erhöhen Sie den Z-Wert, so dass die Region von Interesse an der Basis der Geschmacksknospe beginnt.
      7. Klicken Sie zweimal auf den blauen Pfeil, um mit dem nächsten Schritt fortzufahren.
      8. Klicken Sie auf Löschenund dann auf den grünen Doppelpfeil, um die Oberfläche zu vervollständigen, die das Volumen der Innervation zur Papille darstellt. Um den Wert für das Volume zu ermitteln, wählen Sie im Menü "Objekt" der Nervenfaser die Option "Werkzeuge" und dann im Dropdown-Menü die Option "Lautstärke".
    4. Terminal Arbor Kontaktanalyse
      1. Bildvorbereitung
        1. Gehen Sie zum Menü Bearbeiten und wählen Sie 3D zuschneiden. Schneiden Sie das Bild auf allen Seiten zu und entfernen Sie Platz außerhalb der Geschmacksknospe.
          HINWEIS: Schneiden Sie so nah an der Geschmacksknospe zu, ohne eine relevante Struktur zu entfernen - jedes überschüssige Bild verlängert die Verarbeitungszeit.
        2. Wählen Sie im Hauptmenü Bearbeiten aus, und klicken Sie auf Datentyp ändern. Wählen Sie To: 32 Bit Float aus dem Dropdown-Menü.
        3. Wählen Sie im Menü Objekt die Option Neue Flächen hinzufügen aus. Klicken Sie auf Automatische Erstellung überspringen, manuell bearbeiten, Konturauswählen und dann die Slice-Position nach rechts ziehen, um die Gesamtzahl der optischen Slices zu ermitteln.
        4. Generieren Sie isometrische Voxel und stellen Sie sicher, dass die Voxel anstelle der Rechtecke (0,0691 x 0,0691 x 0,474) als XxYxZ bzw. 0,0691 x 0,0691 x 0,0691 x 0,0691 sind, indem Sie die Rechtecke in Würfel mit identischen Werten für die Fluoreszenzintensität wie das ursprüngliche, rechteckige Voxel unterteilen. Wählen Sie Bildeigenschaftenaus. Dividieren Sie dann den Z-Wert für Voxel size durch den X- oder Y-Wert (= 0,474/0,0691) und multiplizieren Sie diesen Wert mit der Anzahl der slices (optischen Abschnitte), die im vorherigen Schritt gefunden wurden.
        5. Gehen Sie im Hauptmenü zurück zu Bearbeiten und wählen Sie 3D neu berechnen.
        6. Ersetzen Sie den Z-Wert (Anzahl der Slices) durch den neu berechneten Wert.
      2. Automatische Oberflächen basierend auf Fluoreszenz erzeugen
        1. Klicken Sie erneut auf Neues Surface hinzufügen, um eine neue Fläche hinzuzufügen, deaktivieren Sie die Option Nur einen Interessenbereich segmentierenund klicken Sie auf Weiter.
        2. Wählen Sie im Dropdown-Menü Quellkanal den Kanal für einen der geschmackstransprimierenden Zelltypen aus. Deaktivieren Sie "Glätten" und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
        3. Ändern Sie auf dem nächsten Bildschirm nichts, was den Bereich der fluoreszierenden Intensitäten im Bild anzeigt. Klicken Sie erneut auf den blauen Pfeil unten, um zum nächsten Schritt zu gelangen.
        4. Klicken Sie auf Löschenund dann auf den grünen Doppelpfeil, um die Oberfläche zu vervollständigen.
        5. Wechseln Sie zum Menü Objekt auf der linken Seite des Bildschirms, in dem die fertige Zellenoberfläche angezeigt wird und als generisches Element wie Surface 2bezeichnet wird. Doppelklicken Sie auf den Oberflächennamen, um ihn entsprechend der Bezeichnung zu benennen.
          HINWEIS: In diesem Fall basiert die erzeugte Oberfläche auf der plcß2-markierten Zelle.
        6. Wenn anstelle einer Fläche Punkte vorhanden sind, klicken Sie im Menü in der unteren linken Ecke auf Fläche anstelle von Mittelpunkt. Klicken Sie dann auf OK, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
        7. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.2.1-5.3.2.5 für die anderen geschmackstransduzierenden Zellmarker und den Nervenfasermarker.
        8. Speichern (exportieren) Sie den Fortschritt.
        9. Klicken Sie im Hauptmenü auf einen Zellentyp Surface. Klicken Sie im Menü dieses Objekts auf Extrasund dann auf Entfernungstransformation.
        10. Warten Sie, bis ein Popup-Fenster mit dem Namen XTDistanceTransformation angezeigt wird. Wählen Sie Externes Flächenobjekt. Notieren Sie sich den neuen Kanal, der im Menü "Darstellungsanpassung" mit dem Namen Abstand zur Flächeangezeigt wird.
        11. Wählen Sie im Menü Objekt (Object) die Oberfläche Nervenfaser (Nerve Fiber) aus. Klicken Sie auf das Stiftsymbol und dann auf Alle maskieren.
        12. Wählen Sie im angezeigten Dropdown-Menü den namen des neuen Kanals Abstand zur Fläche aus. Notieren Sie sich den neuen Kanal, der im Fenster "Darstellungsanpassung" mit dem Namen "Maskierter Abstand zur Fläche"angezeigt wird.
        13. Erstellen Sie ein neues Objekt über das Hauptmenü Objekt. Deaktivieren Sie Nur einen Interessenbereich segmentieren und klicken Sie auf den blauen Pfeil. Wählen Sie den Kanal Masked Distance to PLCß2 aus und deaktivieren Sie Smooth.
        14. Überprüfen Sie auf dem nächsten Bildschirm, ob es Regionen gibt, in denen sich die geschmackstransduzierenden Zellen in der kleinsten Entfernung von den von dieser Software erkennbaren Nervenfasern befinden. Setzen Sie dazu eine Grenze von 0,01-0,11 μm, um die Fluoreszenz von Rezeptorzellen in dieser Nähe der Nervenfasern zu überprüfen.
        15. Geben Sie 0,01 in das grüne Feld auf der linken Seite ein, um den unteren Schwellenwert festzulegen, und drücken Sie die Tabulatortaste. Klicken Sie dann auf die rote Schaltfläche und geben Sie 0.11 ein, um den oberen Schwellenwert festzulegen. Drücken Sie die Tabulatortaste und klicken Sie dann auf den blauen Pfeil unten, um mit dem nächsten Schritt fortzufahren.
        16. Klicken Sie auf Löschen und dann auf den grünen Doppelpfeil, um den Vorgang abzuschließen.
        17. Benennen Sie diese Oberfläche innerhalb von 0,01-0,11 von PLCß2 im Menü Objekt um. Wählen Sie im Menü Objekt die Option Innerhalb von 0,01 - 0,11 der PLCß2-Oberfläche.
        18. Wählen Sie den Stift aus und klicken Sie dann auf Alle maskieren. Wählen Sie den roten Kanal (Nervenfaser) aus dem Dropdown-Menü aus und klicken Sie auf OK. Notieren Sie sich den neuen Kanal, der im Fenster "Darstellungsanpassung" mit dem Namen Maskiertes CHS2angezeigt wird.
        19. Klicken Sie auf den Namen des Kanals; Benennen Sie den Kanal innerhalb von 0,01 - 0,11 von PLCß2 um.
          HINWEIS: Dies ist ein Fluoreszenzkanal, der ein Duplikat des roten Fluoreszenzkanals darstellt, der innerhalb der erzeugten Oberfläche vorhanden ist.
        20. Klicken Sie auf Weiß in der Mitte der Farbauswahl. Wählen Sie eine Farbe aus, die im Kontrast zu den Farben der Strukturen steht.
        21. Exportieren (d.h. speichern) Sie die Datei in dieser Phase.
        22. Wiederholen Sie die Schritte 5.4.2.9-5.4.2.21 für andere geschmackstransduzierende Zellmarker.
        23. Exportieren (d.h. speichern) Sie die Datei in dieser Phase.
          HINWEIS: Um die Nähe eines markierten Zelltyps zu einem anderen zu analysieren, ersetzen Sie einfach die Nervenfaseroberfläche in Schritt 5.4.2.11 (und den folgenden Schritten) durch das Objekt von Interesse und die entsprechenden Komponenten, die sich auf die folgenden Schritte beziehen.

6. Neuronenlaubrekonstruktion und absolute Zellzahlquantifizierung

  1. Terminal Arbor Tracing und Analyse
    1. Öffnen Sie die entpackte Bilddatei in einer 3D-vektorbasierten Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle),wählen Sie Trace, klicken Sie auf Neuronund dann auf Dendrite.
    2. Scrollen Sie zur Basis der Geschmacksknospe im Bildstapel. Verfolgen Sie jede Faser bis zum Ende, während Sie durch den Bildstapel scrollen.
    3. Wenn Sie sich am Zweigende befinden, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Ende und wählen Sie Ende. Klicken Sie an Verzweigungspunkten mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Bifurcating Nodeaus.
      HINWEIS: Dies ermöglicht es, einen Zweig bis zum Ende zu verfolgen und dann zum Verzweigungspunkt zurückzukehren und den anderen Zweig zu verfolgen, wobei das Programm erkennt, dass diese Abverfolgung immer noch vom selben Neuron ist.
    4. Speichern Sie die Datendatei als . DAT-Datei, die dann zur Analyse in der 3D-vektorbasierten Bildanalysesoftware geöffnet werden kann.

7. Quantifizierung der Zellzahl

  1. Quantifizieren Sie die markierten Geschmacksknospenzellen in jedem Bildanalyse-Softwarepaket, solange unterschiedliche Marker für die Transduktion von Zelltypen, die an der Z-Position verankert sind, auf der Kernebene platziert werden können.

Ergebnisse

Die Färbung des Lingualepithels mit Antikörpern gegen dsRed und Keratin-8 (ein allgemeiner Geschmacksknospenmarker) markierte sowohl ganze Geschmacksknospen als auch alle Geschmacksknospeninnervationen bei Phox2b-Cre:tdTomato-Mäusen50,51 (Abbildung 3A). Die Abbildung dieser Geschmacksknospen von ihren Poren bis zu ihren Basen ergab die höchstauflösenden x-y-Ebenenbilder (Abbildung 3A, B

Diskussion

Die Entwicklung eines Ansatzes zur konsequenten Erfassung und Färbung ganzer Geschmacksknospen aus drei Geschmacksregionen der Mundhöhle (Fungiform, Zirkumvallat und Gaumen) bietet signifikante Verbesserungen für die Analyse geschmackstransduzierender Zellen, die Verfolgung neu eingebauter Zellen, innervation und Beziehungen zwischen diesen Strukturen. Darüber hinaus erleichtert es die Lokalisierung eines potenziellen sekundären Neuronenmarkers sowohl innerhalb als auch außerhalb einer markierten Population

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Wir danken Kavisca Kuruparanantha für ihre Beiträge zur Gewebefärbung und Bildgebung von zirkumvallaten Geschmacksknospen, Jennifer Xu für die Färbung und Bildgebung der Innervation der Papille, Kaytee Horn für die Tierpflege und Genotypisierung und Liqun Ma für ihre Gewebefärbung der Weichgaumen-Geschmacksknospen. Dieses Projekt wurde unterstützt von R21 DC014857 und R01 DC007176 zu R.F.K und F31 DC017660 zu L.O.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-TribromoethanolACROS OrganicsAC421430100
2-MethylbutaneACROS126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-007-00315.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgGJackson Immuno Research712-605-150(1:500)
AutoQuant X3 software Media Cybernetics
Blunt End ForcepsFine Science Tools FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation KitMolecular ProbesC10637Follow kit instructions 
CoverglassMarienfeld107242
Cytokeratin-8Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826) Troma1 supernatant(1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse)RobozRS-5619
Dissection Scissors (fine)MoriaMC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21206(1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555ThermoFisher ScientificA31572(1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgGJackson Immuno Research805-477-008(1:500)
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
Glass slidesFisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides)12-550-15
Goat anti-Car4R&D Systems AF2414(1:500)
Imaris Bitplane pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + ExplorerMBF Biosciences3D vector based image analysis software
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research017-000-121
Normal Rabbit Serum Equitech-Bio, IncSR30
Olympus FV1000(multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
ParaformaldehydeEMDPX0055-34% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRedLiving Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)632496(1:500)
Rabbit anti-PLCβ2 Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-206(1:500)
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Sodium Phosphate MonobasicFisher ScientificBP330-500
tert-Amyl alcoholAldrich Chemical Company8.06193
Tissue MoldsElectron Microscopy Sciences70180
Tissue-Tek® O.C.T. CompoundSakura4583
Triton X-100BIO-RAD#161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling KitThermoFisher ScientificZ25305Follow kit instructions 

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