Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר שיטות להכנת רקמות, כתמים וניתוח של פטריות שלמות, בלוטות טעם וחך המניבות בעקביות בלוטות טעם שלמות ושלמות (כולל סיבי העצבים המעוררים אותן) ושומרות על היחסים בין מבנים בתוך בלוטות הטעם לבין הפפילה שמסביב.

Abstract

בלוטות טעם הן אוספים של תאים ממחלים טעם המתמחים לזהות תת קבוצות של גירויים כימיים בחלל הפה. תאים אלה transducing לתקשר עם סיבי עצב הנושאים את המידע הזה למוח. מכיוון שתאים מעבירי טעם מתים ללא הרף ומוחלפים לאורך כל הבגרות, סביבת בלוטות הטעם מורכבת ודינמית, ודורשת ניתוחים מפורטים של סוגי התאים שלה, מיקומם וכל מערכת היחסים הפיזית ביניהם. ניתוחים מפורטים הוגבלו על ידי הטרוגניות וצפיפות רקמת לשון שהפחיתו באופן משמעותי את חמיכות הנוגדנים. מכשולים אלה דורשים פרוטוקולי חתך שגורמים לפיצול בלוטות הטעם על-פני מקטעים כך שהמדידות משוערות בלבד, וקשרי תאים הולכים לאיבוד. כדי להתגבר על אתגרים אלה, השיטות המתוארות בזאת כוללות איסוף, הדמיה וניתוח בלוטות טעם שלמות וארבורים סופניים בודדים משלושה אזורי טעם: פפילה פטרייתית, פפילות היקפיות והחך. איסוף בלוטות טעם שלמות מפחית הטיה ושונות טכנית וניתן להשתמש בו כדי לדווח על מספרים מוחלטים עבור תכונות כולל נפח בלוטות טעם, פנימיות בלוטות טעם כוללת, ספירת תאים transducing, ואת המורפולוגיה של arbors מסוף בודדים. כדי להדגים את היתרונות של שיטה זו, מאמר זה מספק השוואות של בלוטות טעם וכרכים פנימיים בין פטריות ולהקיף בלוטות טעם באמצעות סמן טעם כללי תווית לכל סיבי הטעם. זרימת עבודה לשימוש בתיוג גנטי של תאים דלילים של נוירוני טעם (עם תת-קבוצות מסומנות של תאים ממחלים טעם) מסופקת גם כן. זרימת עבודה זו מנתחת את המבנים של ארבורים בודדים של עצב הטעם, מספרי סוג התאים ואת היחסים הפיזיים בין תאים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. יחד, זרימות עבודה אלה מספקות גישה חדשנית להכנת רקמות וניתוח של בלוטות הטעם המלאות והמורפולוגיה המלאה של הארבורים הפנימיים שלהם.

Introduction

בלוטות הטעם הן אוספים של 50-100 תאי כינוי מיוחדים הקושרים תת-קבוצות של גירויים בעלי טעם כימי הנמצאים בחלל הפה. תאים טרנס-טרנסדוקציה טעם נחשבים בדרך כלל קיימים כמו סוגים1,2,3,4,5,6,7,8,9, בתחילה מבוסס על קריטריוני מיקרוסקופיה אלקטרונים שהיו מאוחר יותר בקורלציה עם סמנים מולקולריים. תאים מסוג II מבטאים פוספוליפאז C-beta 2 (PLCβ2)2 ואת קולטן חולף פוטנציאל cation ערוץ, חבר M subfamily 51 וכוללים תאים המתמרנים מתוק, מר, umami1,10. תאי סוג III מבטאים אנהידריז קרבוני 4 (Car4)11 וחלבון הקשור סינפטוזומלי 258 ומצביעים על תאים שמגיבים בעיקר לטעם חמוץ11. התאים המעבירים מליחות לא היו מתווים בבירור12,13,14, אך עשויים לכלול תאים מסוג I, סוג II וסוג III15,16,17,18,19. סביבת בלוטות הטעם מורכבת ודינמית, בהתחשב בכך שתאים ממחליפו טעם מתהפכות ברציפות לאורך כל הבגרות ומוחלפות באבות הבסיסיים3,20,21. תאים אלה מעבירי טעם מתחברים לסיבי עצב פסאודו-חד-קוטביים מהגרעיקים הגנניים והפטרוסאליים, המעבירים מידע טעם לגזע המוח. נוירונים אלה סווגו בעיקר על סמך סוג של מידע טעם שהם נושאים22,23 כי מידע על המורפולוגיה שלהם היה חמקמק עד לאחרונה24. תאים מסוג II מתקשרים עם סיבי עצב באמצעות חלבון אפנון הסידן הומאוסטזיס 1 ערוצי יונים25, ואילו תאים מסוג III מתקשרים באמצעות סינפסות קלאסיות8,26. אפיון נוסף של תאי בלוטות הטעם - כולל טרנסולציה של שושלות סוג התא, גורמים המשפיעים על הבידול שלהם, ואת המבנים של חיבור arbors הם כל תחומי החקירה הפעילה.

מחקרי בלוטות טעם הופרעו על ידי מספר אתגרים טכניים. הרקמות ההטרוגניות והצפופות המרכיבות את הלשון מפחיתות באופן משמעותי את חמידות הנוגדנים לאימונוהיסטוכימיה27,28,29. מכשולים אלה חייבו פרוטוקולי חלוקה המביאים לפיצול בלוטות הטעם על פני מקטעים, כך שהמדידות משוערות על סמך מקטעים מייצגים או מסתכמות על-פני מקטעים. בעבר, נעשה שימוש במקטעים דקים מייצגים כדי להעריך הן ערכי אמצעי אחסון והן את ספירת התאים של התמתן30. חתך סדרתי עבה יותר מאפשר הדמיה של כל מקטעי בלוטות הטעם וסיכום המדידות מכל סעיף31. חיתוך קטעים עבים כאלה ובחירת רק בלוטות טעם שלם הטיות דגימה לכיוון בלוטות טעם קטנות יותר32,33,34. הערכות פנימיות עצביות מבלוטות טעם חלקיות התבססו על ניתוחים של מספרי פיקסלים13,35, אם כימותו בכלל36,37,38. מדידות אלה מתעלמות לחלוטין מהמבנה ומספר הארבורים העצביים הבודדים, מכיוון שארבורים מפוצלים (ובדרך כלל מסומנים בצורה גרועה). לבסוף, למרות קילוף האפיתל מאפשר בלוטות טעם שלמות להיות מוכתם39,40, זה גם מסיר סיבי עצב בלוטות טעם ועלול לשבש את היחסים הרגילים בין תאים. לכן, חקירות של היחסים המבניים בתוך בלוטות הטעם הוגבלו בגלל הפרעה זו הנגרמת על ידי גישות מכתימות.

אוסף מבנה שלם מבטל את הצורך בסעיפים מייצגים ומאפשר קביעת מדידות בעלות ערך מוחלט של אמצעי אחסון, ספירת תאים ומורפולוגיות מבנה41. גישה זו גם מגבירה את הדיוק, מגבילה הטיה ומפחיתה את השונות הטכנית. אלמנט אחרון זה חשוב מכיוון שבלוטות הטעם מראות שונות ביולוגית ניכרת הן בתוך34,42 והן על פני אזורים43,44, וניתוחים שלם של בלוטות הטעם מאפשרים להשוות מספרי תאים מוחלטים בין תנאי שליטה וניסיוניים. יתר על כן, היכולת לאסוף בלוטות טעם שלמות מאפשרת ניתוח של היחסים הפיזיים בין תאים שונים transducing וסיבי העצב הקשורים שלהם. מכיוון שתאים מעבירי טעם עשויים לתקשר זה עם זה45 ולתקשר עם סיבי עצב46, יחסים אלה חשובים לתפקוד תקין. לפיכך, תנאי אובדן תפקוד לא יכול להיות עקב אובדן תאים, אלא שינויים ביחסי תאים. כאן יש שיטה לאיסוף בלוטות טעם שלמות כדי להשיג את היתרונות של מדידות מוחלטות עבור ניתוחי נפח זיקוק עבור בלוטות הטעם שלהם ואת innervations שלהם, ספירות תאי טעם וצורות, ועל להקל על ניתוחים של מערכות יחסים בין תאים transducing ומורפולוגיות עצב-arbor. שתי זרימות עבודה מוצגות גם במורד הזרם של שיטת הרכבה מלאה חדשנית זו להכנת רקמות: 1) לניתוח נפח בלוטות הטעם ו- innervation מוחלט ו -2) לתיוג גנטי של תאים דלילה של נוירוני טעם (עם תת-קבוצות של תאים ממחלימים בטעם המסומנים) וניתוחים הבאים של מורפולוגיה של ארבור עצב הטעם, מספר סוגי תאי הטעם וצורותיהם, ושימוש בתוכנת ניתוח תמונה כדי לנתח את היחסים הפיזיים בין תאים transducing ואלה בין transducing תאים וארבור העצבים שלהם. יחד, זרימות עבודה אלה מספקות גישה חדשנית להכנת רקמות ולניתחים של בלוטות טעם שלמות והמורפולוגיה המלאה של הארבורים הפנימיים שלהם.

Protocol

הערה: כל בעלי החיים טופלו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי מדיניות שירות הבריאות הציבורי של ארה"ב לגבי הטיפול האנושי והשימוש בחיות מעבדה ומדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. עכברי Phox2b-Cre (זן MMRRC 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) או עכברי TrkBCreER (Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg) גודלו עם עכברי כתב tdTomato (Ai14). אדוויליןקריר47 גודלו עם Phox2b-flpo48 ו- Ai65. עבור 5-אתניל-2′-deoxyuridine (EdU) זריקות, EdU היה מוכן ומנות מחושבות על פי Perea-Martinez ואח'49.

1. הכנת חומרים

  1. הכנת פתרונות
    1. יש להמיס 5.244 גרם נתרן פוספט מונובסי ו-23.004 גרם נתרן פוספט דיבסי במים מזוקקים כפולים (ddH2O) על צלחת ערבוב. התאימו את רמת החומציות ל-7.4, והבנו את הנפח הכולל כדי להשיג 1 ליטר של חיץ נתרן פוספט (PB).
    2. ממיסים paraformaldehyde ב ddH2O במכסה המנוע אדים על ידי חימום תוך ערבוב על צלחת ערבוב עד הפתרון מגיע 90 °C (70 °F). הוסף 4 M פתרון NaOH dropwise כדי לנקות את paraformaldehyde, ולסנן את הפתרון באמצעות בקבוקון Erlenmeyer ואקום מסנן קרמיקה עם נייר מסנן. הוסף נפח שווה של 0.2 M PB, ולהתאים את ה- pH ל 7.4 כדי לקבל 4% PFA ב 0.1 M PB.

2. הכנת רקמות

  1. איסוף רקמות
    1. להקריב עכברים באמצעות מנת יתר הרדמה עם פתרון עובד המכיל 10 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית ו 0.25 מ"ל של תמיסת מלאי המכיל 5 גרם של 2,2,2-tribromoethanol ו 5 מ"ל של אלכוהול טרט-עמיל. תפשל באופן רוחבי עם 4% PFA ב 0.1 M PB; להסיר את הלשונות ואת החיך.
    2. לבודד את בלוטות הטעם המקיפה באמצעות חתך קורונל המפריד בין הלשון האחורית, מאחורי ההצטלבות הבין-אמולרית; לחתוך את בלוטות הטעם עם סכין גילוח; ואז חוצים את הלשון הנעה בקו האמצע. לאחר תיקון לילה ב 4 °C (55 °F) עם 4% PFA ב 0.1 M PB.
    3. Cryoprotect על הרקמה ב 30% סוכרוז לילה ב 4 °C (50 °F).
      הערה: הרקמה יכולה להיות קפואה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) באמצעות 2-מתילבוטן מקורר בכיסת על קרח יבש ומאוחסן ב -80 °C (80 °F) אם ההליך צריך להיות מושהה כאן.
  2. בלוטות טעם פטרייתיות
    1. מצננים 2-מתילבוטן במכה על קרח יבש כהכנה לשלב 2.2.8.
    2. להפשיר ולשטוף את הלשון ב 0.1 M PB. מניחים חצי מהלשון האחורית המכילה את הפפילה הפטרייתית על מגלשת זכוכית מתחת למיקרוסקופ ניתוח.
    3. השתמש במלקחיים קהים ומספריים מפורק כדי להסיר את השריר. השתמש במלקחיים קהים כדי להחזיק את הרקמה פתוחה כמו האפיתל הלינגואל מעוקל, ולהבטיח אוריינטציה שטוחה על ידי שמירה על הלהבים של מספריים ביתחות גס במקביל לאפיתל.
    4. להשליך את האפיתל הגחוני לא קרטין של הלשון כפי שהוא אינו מכיל בלוטות טעם.
    5. השתמש במספריים אנליזה עדינים עבור ניתוח קרוב יותר לחלק התחתון של האפיתל קרטין.
      הערה: חשוב לנתח קרוב לאפיתל כך שהשריר הנותר יהיה בעובי אחיד, והמשטח חלק כדי להבטיח חדירת נוגדנים אחידה. התוצאה של עובי לא אחיד של השריר הנותר תהיה חתך לא אחיד על cryostat, עם חשיפה של האפיתל באזורים עם פחות שרירים ושכבה עבה יותר של שרירים עבור אזורים אחרים, אשר פוגע חדירת נוגדנים.
    6. השתמש במלקחיים קהים כדי להניח חתיכת אפיתל לתוך תבנית רקמה (צד השריר כלפי מטה), ולוודא שהוא שוכב שטוח. ברגע שהרקמה שטוחה, מוסיפים טיפה של OCT לרקמה.
      הערה: בהתחשב בכך קצה הלשון מעוקל, ייתכן שיהיה צורך לבצע חתך באפיתל שבו הוא מעוקל, כך הרקמה ניתן לעשות לשכב שטוח.
    7. מניחים את תבנית הרקמה על בסיס מתכת (מקורר בעבר בקרח יבש) מתחת להיקף הניתוח. המשך להקיש על הרקמה בקלילות עם המלקחיים עד OCT קפוא כדי להבטיח את הרקמה קופא שטוח ככל האפשר.
    8. לאחר OCT קפא, במהירות להוסיף OCT נוסף, ומניחים את התבנית בכף של 2-מתילבוטן (מקורר בקרח יבש) עד להקפאה.
    9. חתך קריוסטט
      הערה: הקריוסטט משמש להסרה עדינה של הרקמה התת עורית הנותרת, מה שעלול לעכב חדירת נוגדנים (איור 1).
      1. הר את תבניות OCT על cryostat, לחתוך 20 קטעים מיקרומטר. אסוף כל קטע, והצג אותו מתחת למיקרוסקופ האור כדי להעריך את קרבתו לבסיס האפיתל (איור 1E - H).
      2. לאחר שהרקמה מגולחת מהיד תחתון האפיתל, מפשירים את האפיתל ושוטפים אותו פעמיים ב-0.1 M PB על שייקר.
  3. למול בלוטות טעם
    1. בעזרת חתך קורונל עם סכין גילוח, מפרידים את הפפילה המקיפה מהלשון הנעים. השתמש בשני חתכים parasagittal עם אותו סכין גילוח כדי להסיר את הרקמה לרוחב לפפילה תחת טווח ניתוח. מניחים את הפפילה בתבנית רקמה באמצעות מלקחיים, כך שקצה רוחבי אחד של הפפילה המקיפה פונה לתחתית תבנית הרקמה.
      הערה: הרקמה יכולה להיות קפואה ב OCT באמצעות 2-מתילבוטן מקורר בכף על קרח יבש ומאוחסן ב -80 °C (80 °F) אם ההליך צריך להיות מושהה כאן.
    2. חותכים את הרקמה ל-90 מיקרומטר של קטעים צפים בהקפאה.
  4. בלוטות טעם על החיך
    1. חותכים את החיך הקשה עד לצומת החיך הרך והקשה(איור 2). השתמש במספריים כדי להפריד את החיך הרך מהרקמה הבסיסית, ולוודא שכל שברי העצם הנותרים נחתכים. הסר שריר נוסף ורקמת חיבור.
      הערה: לאחר שהוסר, כל הרקמה שנותרה תורכב מבלוטות ורקמת חיבור רופפת, אשר דבקים קלות בחלק התחתון של החיך.
    2. החזק את החיך עם מלקחיים קהים, ולהסיר את הבלוטות הנותרות ורקמת חיבור רופפת על ידי גירוד בעדינות אותם עם סכין גילוח.
      הערה: הרקמה יכולה להיות קפואה ב OCT באמצעות 2-מתילבוטן מקורר בכף על קרח יבש ומאוחסן ב -80 °C (80 °F) אם ההליך צריך להיות מושהה כאן.

3. כתמי אימונוהיסטוכימיה

  1. לשטוף את הרקמות עם 0.1 M PB, 3 x 15 דקות. מניחים את הרקמות בצינורות 1 מ"ל עם פתרון חסימה (סרום חמור 3%, 0.5% פעילי שטח לא יוניים (ראה טבלת החומרים),0.1 M PB) ב 4 °C (4 °C).
  2. הסר את פתרון החסימה, ודגר את הרקמה בנוגדן ראשוני (ארנב נגד PCLβ2) בתמיסת נוגדנים (0.1 M PB, 0.5% פעילי שטח לא יוניים) למשך 5 ימים ב 4 °C (4 °F).
  3. לשטוף עם 0.1 M PB, 4 x 15 דקות כל לשטוף, ודגורה נוגדן נגד ארנב 488 חמור משני (1:500) בתמיסת נוגדנים במשך 2 ימים ב 4 °C (5 °F).
  4. יש לשטוף עם 0.1 M PB, 4 x 15 דקות כל שטיפה, ולחסום עם סרום ארנב רגיל של 5% בתמיסת נוגדנים.
  5. לשטוף עם 0.1 M PB, 4 x 15 דקות. דגירה עם נוגדן חסימת חמורים נגד ארנבים (20 מיקרוגרם/מ"ל) בתמיסת נוגדנים למשך יומיים ב-4 מעלות צלזיוס.
  6. לשטוף עם 0.1 M PB, 4 x 15 דקות כל לשטוף, ולאחר מכן לדגור עם dsRed נוגדן ראשוני (ארנב) מצומד תווית פלואורסצנטי (על פי הוראות היצרן) בתמיסת נוגדנים במשך 5 ימים ב 4 °C (5 °F).
  7. לשטוף עם 0.1 M PB, 4 x 15 דקות כל לשטוף, ולאחר מכן לדגור עם נוגדן ראשוני (נגד Car4 עז (1:500)) בתמיסת נוגדנים במשך 5 ימים ב 4 °C (70 °F).
  8. לשטוף עם 0.1 M PB, 4 x 15 דקות כל לשטוף. דגירה עם נוגדן נגד עזים משני 647 (1:500) בתמיסת נוגדנים במשך יומיים ב 4 °C (70 °F).
  9. יש לשטוף עם 0.1 M PB, 4 x 15 דקות כל לשטוף, ולהרכיב (צד אפיתל למעלה) במדיה הרכבה מימית, ומניחים כיסוי מעל קטע הרקמה.
    הערה: אם משתמשים בנוגדנים ממינים שונים, כמו במקרה של קרטין-8 ו- dsRed בלבד, הוסיפו את כל הנוגדנים העיקריים לתמיסת הנוגדנים בשלב 3.2 ולכל הנוגדנים המשניים בשלב 3.3 לפני שתמשיכו לשלב 3.9.

4. הדמיה קונפוקלית ודה-אבולוטיבציה

  1. לכוד תמונות קונפוקליות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה של 60x (צמצם מספרי= 1.40), 4 אלפיות שניות/פיקסל, זום של 3, קלמן של 2 וגודל של 1024 x 1024. בחר גודל שלב של 0.47 מ"מ לאורך ציר z. ללכידת innervation לפפילה, השתמש בזום של 2.5 אם שדה הראייה עם זום של 3 צר מכדי ללכוד את כל הפנימיות לפפילה.
  2. כדי לפענח את ההגדרות, שים לב שהגדרות מסוימות ייובאו באופן אוטומטי עם התמונה; לכן, מלא את הפרטים הנותרים עבור מודליות, עדשה אובייקטיבית, צמצם מספרי, מדיום טבילה, מדיום מדגם, פלואורופורים שנתפסו בתמונה. לאחר מכן, בחר דה-זעזוע תלת-ממדי.

5. ניתוח תמונה

  1. בלוטות טעם ונפח פנימי
    1. יבא ערימות תמונה לא-וולוטריות לתוכנת ניתוח תמונה מבוססת פיקסלים (עיין בטבלת החומרים) כדי לקבוע את עוצמת בלוטות הטעם ואת עוצמת הקול של פנימיות מוחלטת בתוך בלוטות הטעם.
      1. בטל את הסימון של עוצמת הקול בתפריט האובייקט הראשי.
      2. בחרו 'הוסף משטחים חדשים' מתפריט 'אובייקט'. בחר דלג על יצירה אוטומטית, ערוך באופן ידניולאחר מכן בחר מיתר.
      3. לחץ על בחר וצפה בחץ המופיע כ- + כדי לעזור לעקוב אחר הגבול של בלוטות הטעם. הזז את כלי הפריסה וחלוקה לרמות של בלוטות הטעם בכל מקטע אופטי. לאחר השלמת קווי המתאר, לחץ על צור משטח.
      4. שים לב לעצם עוצמת הקול של בלוטות הטעם המופיע כעת בתפריט האובייקט הראשי. אתר את עוצמת הקול של בלוטות הטעם תחת כלים.
    2. נפח הפנימיות בתוך בלוטות הטעם
      1. בחרו בסמל העיפרון מתחת לעצם בלוטות הטעם, ולאחר מכן בחרו 'מסיכה הכל'.
      2. בתפריט הנפתח, בחר בערוץ הפלואורסצנטי המתאים לתווית סיבי העצב. סמן יצירת ערוץ כפול.
      3. סמן הגדר voxels מחוץ לפני השטח אל: והקלד 0 בתיבה.
      4. שים לב לערוץ החדש המופיע בחלון התאמת תצוגה, שהוא שכפול ללא שינוי של הערוץ הפלואורסצנטי שנבחר בתוך בלוטות הטעם.
      5. בתפריט הראשי של אובייקט, בחר צור משטח חדש. בטל את הסימון דלג על יצירה אוטומטית, ערוך באופן ידני.
      6. לחץ פעמיים על החץ הכחול כדי להמשיך לשלב הבא.
      7. לחץ על מחק, ולאחר מכן לחץ על החץ הכפול הירוק כדי להשלים את פני השטח, המייצג את הנפח של סיבי העצבים הקיימים בתוך בלוטות הטעם. כדי למצוא את הערך עבור אמצעי האחסון, בחרו 'כלים' מתחת לתפריט אובייקט סיבי עצב ובחרו 'עוצמת קול' מהתפריט הנפתח.
    3. נפח הפנימיות לפפילה
      1. צור נפח של בלוטות הטעם כמתואר בסעיף 5.1.
      2. בחרו בסמל העיפרון מתחת לעצם בלוטות הטעם, ובחרו 'מסיכה הכל'.
      3. בתפריט הנפתח, בחר בערוץ הפלואורסצנטי המתאים לתווית סיבי העצב. סמן יצירת ערוץ כפול.
      4. סמן הגדר voxels בתוך משטח ל: והקלד 0 בתיבה. לחץ על אישור.
      5. צור משטח על-ידי לחיצה על הוסף משטח חדש. בחר פלח שוק רק אזור עניין.
      6. לחץ על החץ הכחול, והגדיל את ערך Z כך שאזור העניין יתחיל בבסיס בלוטות הטעם.
      7. לחץ פעמיים על החץ הכחול כדי להמשיך לשלב הבא.
      8. לחץ על מחק, ולאחר מכן לחץ על החץ הכפול הירוק כדי להשלים את פני השטח, המייצג את נפח הפנימיות לפפילה. כדי למצוא את הערך עבור אמצעי האחסון, בחרו 'כלים' מתחת לתפריט אובייקט סיבי עצב ובחרו 'עוצמת קול' מהתפריט הנפתח.
    4. ניתוח אנשי קשר של ארבור מסוף
      1. הכנת תמונה
        1. עבור לתפריט עריכה ובחר חיתוך תלת-ממד. חותכים את התמונה מכל הצדדים, מסירים מקום מחוץ לבלוטות הטעם.
          הערה: חיתוך קרוב לבלוטות הטעם מבלי להסיר כל מבנה רלוונטי - כל תמונה עודפת תאריך את זמן העיבוד.
        2. בחר עריכה מהתפריט הראשי, לחץ על שנה סוג נתונים. בחר אל: 32 סיביות צפוף מהתפריט הנפתח.
        3. בחרו 'הוסף משטחים חדשים' מתפריט 'אובייקט'. לחץ על דלג על יצירה אוטומטית, ערוך באופן ידני, בחר מיתרולאחר מכן גרור את מיקום הפרוסה ימינה כדי למצוא את המספר הכולל של פרוסות אופטיות.
        4. צור voxels איזומטרי, ולוודא כי במקום voxels להיות מלבנים (0.0691 x 0.0691 x 0.474) כמו XxYxZ, בהתאמה, voxels הם 0.0691 x 0.0691 x 0.0691 על ידי חלוקת המלבנים לקוביות עם ערכים זהים לעוצמת פלואורסצנטיות כמו ווקסל המקורי, מלבני. בחר מאפייני תמונה. לאחר מכן, חלק את ערך ה- Z עבור גודל Voxel בערך X או Y (= 0.474/0.0691) והכפל ערך זה במספר הפרוסות (מקטעים אופטיים) שנמצאו בשלב הקודם.
        5. חזור לעריכה בתפריט הראשי ובחר דגימה מחדש של תלת-ממד.
        6. החלף את ערך Z (מספר פרוסות) בערך המחושב החדש.
      2. יצירת משטחים אוטומטיים המבוססים על פלואורסצנטיות
        1. לחץ על הוסף משטח חדש שוב כדי להוסיף משטח חדש, בטל את הבחירה במקטע מעניין בלבדולחץ על הבא.
        2. מהתפריט הנפתח ערוץ המקור, בחר את הערוץ עבור אחד מסוגי התאים המעבירים טעם. בטל את הבחירה ב'החלק' והמשך לשלב הבא.
        3. אל תשנה דבר במסך הבא המציג את טווח העוצמות הפלואורסצנטיות הקיימות בתמונה. לחץ על החץ הכחול בתחתית שוב כדי לעבור לשלב הבא.
        4. לחץ על מחקולאחר מכן לחץ על החץ הכפול הירוק כדי להשלים את פני השטח.
        5. עבור לתפריט אובייקט ביד שמאל של המסך שבו יופיע משטח התא שהושלם וייקרא משהו כללי כגון Surface 2. לחץ פעמיים על שם פני השטח כדי לתת לו שם בהתאם למה שהתווית מייצגת.
          הערה: במקרה זה, המשטח שנוצר מבוסס על התא עם התווית PLCß2.
        6. אם יש נקודות במקום משטח, מתחת לתפריט בפינה השמאלית התחתונה, לחץ על משטח במקום על נקודת המרכז. לאחר מכן, לחץ על אישור כאשר תתבקש.
        7. חזור על שלבים 5.3.2.1-5.3.2.5 עבור סמני התאים האחרים המעבירים טעם וסמן סיבי העצב.
        8. שמור (ייצוא) את ההתקדמות.
        9. לחץ על סוג תא משטח בתפריט הראשי. מתפריט של אובייקט זה, לחץ על כליםולאחר מכן לחץ על המרת מרחק.
        10. המתן להופעת תיבה מוקפצת בשם XTDistanceTransformation. בחר אובייקט חיצוני של משטח. שים לב לערוץ החדש שמופיע בתפריט 'התאמת תצוגה' הנקרא 'מרחק לשם משטח'.
        11. בחרו במשטח סיבי העצב מתפריט 'אובייקט'. לחץ על סמל העיפרון ולאחר מכן הסתיר הכל.
        12. מהתפריט הנפתח שמופיע, בחר את הערוץ החדש מרחק לשם פני השטח. שים לב לערוץ החדש שמופיע בחלון 'התאמת תצוגה' הנקרא 'מרחק מסיכה' לשם פני השטח.
        13. צור אובייקט חדש באמצעות תפריט האובייקט הראשי. בטל את הבחירה במקטע רק אזור מעניין ולחץ על החץ הכחול. בחר את הערוץ מרחק מסיכה לערוץ PLCß2 ובטל את הסימון חלק.
        14. במסך הבא, בדוק אם ישנם אזורים שבהם התאים ממחלים את הטעם נמצאים במרחק הקטן ביותר מסיבי העצב שניתן להבחין בהם על ידי תוכנה זו. כדי לעשות זאת, להגדיר מגבלה של 0.01-0.11 מיקרומטר כדי לבדוק כל פלואורסצנטיות תא קולטן זה קרוב סיבי העצבים.
        15. הקלד 0.01 בתיבה הירוקה בצד שמאל כדי להגדיר את הסף התחתון, הקש Tab. לאחר מכן לחץ על הכפתור האדום והקלד 0.11 כדי להגדיר את הסף העליון. הקש Tab ולאחר מכן לחץ על החץ הכחול בתחתית כדי לעבור לשלב הבא.
        16. לחץ על מחק ולאחר מכן על החץ הכפול הירוק לסיום.
        17. שנה שם משטח זה בתוך 0.01-0.11 של PLCß2 בתפריט אובייקט. בחר בתוך 0.01 - 0.11 של משטח PLCß2 בתפריט אובייקט.
        18. בחר את העיפרון ולאחר מכן לחץ על מסיכה הכל. בחר בערוץ האדום (סיבי העצב) מהתפריט הנפתח ולחץ על אישור. שים לב לערוץ החדש שמופיע בחלון התאמת תצוגה הנקרא CHS2 עם מסיכה.
        19. לחץ על שם הערוץ; שנה את שם הערוץ בתוך 0.01 - 0.11 של PLCß2.
          הערה: זהו ערוץ פלואורסצנטי המייצג שכפול של ערוץ הפלואורסצנטי האדום הנמצא בתוך פני השטח שנוצרו.
        20. לחץ על לבן באמצע בורר הצבעים. בחר צבע המנוגד לצווני המבנים.
        21. יצא (כלומר, שמור) את הקובץ בשלב זה.
        22. חזור על שלבים 5.4.2.9-5.4.2.21 עבור סמני תאים אחרים המעבירים טעם.
        23. יצא (כלומר, שמור) את הקובץ בשלב זה.
          הערה: כדי לנתח את הקרבה של סוג תא אחד המסומן לאחר, פשוט החלף את משטח סיבי העצב בשלב 5.4.2.11 (ואת השלבים הבאים) במושא העניין וברכיבים המקבילים הנוגעים לכל שלב עוקב.

6. שחזור ארבור נוירון וכימות מספר תא מוחלט

  1. מעקב וניתוח ארבור מסוף
    1. פתח את קובץ התמונה המנודה בתוכנת ניתוח תמונה מבוססת וקטור תלת-ממד (ראה טבלת החומרים),בחר מעקב, לחץ על נוירוןולאחר מכן לחץ על דנדריט.
    2. גלול לבסיס בלוטות הטעם בערימת התמונות. עקוב אחר כל סיב עד הסוף בעת גלילה בערימת התמונות.
    3. כאשר בקצה הענף, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הסוף ובחר סיום. בנקודות הסתעפויות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר צומת Bifurcating.
      הערה: זה מאפשר מעקב ענף אחד עד הסוף ולאחר מכן לחזור לנקודת bifurcating ו התחקות אחר הענף השני עם התוכנית להכיר כי מעקב זה הוא עדיין של אותו נוירון.
    4. שמור את קובץ הנתונים כקובץ . קובץ DAT, אשר לאחר מכן ניתן לפתוח לניתוח בתוכנת ניתוח תמונה מבוססת וקטור 3D.

7. כימות מספר תא

  1. לכמת את תאי בלוטות הטעם המסומנים בכל חבילת תוכנה לניתוח תמונה כל עוד ניתן למקם סמנים נפרדים עבור סוגי תאים המעוגנים למיקום z ברמה הגרעינית.

תוצאות

הכתמת האפיתל הלינגואלי בנוגדנים ל- dsRed ו- keratin-8 (סמן בלוטות טעם כללי) שכותרתו הן בלוטות טעם שלמות והן כל הטעם הפנימי ב- Phox2b-Cre:עכברי tdTomato50,51 (איור 3A). הדמיית בלוטות הטעם האלה מהנקבוביות לבסיסים שלהן נתנה את התמונות המישוריות x-y ברזולוציה הגבוהה ב...

Discussion

התפתחות גישה לאיסוף והכתמה עקבית של בלוטות טעם שלמות משלושה אזורי טעם חלל הפה (פטריות, ברית מילה והחך) מספקת שיפורים משמעותיים לניתוח תאים ממחליפו טעם, מעקב אחר תאים משולבים חדשים, פנימיות ויחסים בין מבנים אלה. בנוסף, זה מקל על לוקליזציה של סמן נוירון משני פוטנציאלי הן בתוך או מחוץ לאוכלוסי...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים ל-Kavisca Kuruparanantha על תרומתה להכתמת רקמות והדמיה של בלוטות טעם מקיפות, ג'ניפר שו על הכתמתה והדמיה של פנימיות לפפילה, לקרן קייט לטיפול בבעלי חיים וגנוטיפינג, וללקון מא על הכתמת הרקמה שלה בבלוטות הטעם הרך.. פרויקט זה נתמך על ידי R21 DC014857 ו- R01 DC007176 ל- R.F.K ו- F31 DC017660 ל- L.O.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-TribromoethanolACROS OrganicsAC421430100
2-MethylbutaneACROS126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-007-00315.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgGJackson Immuno Research712-605-150(1:500)
AutoQuant X3 software Media Cybernetics
Blunt End ForcepsFine Science Tools FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation KitMolecular ProbesC10637Follow kit instructions 
CoverglassMarienfeld107242
Cytokeratin-8Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826) Troma1 supernatant(1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse)RobozRS-5619
Dissection Scissors (fine)MoriaMC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21206(1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555ThermoFisher ScientificA31572(1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgGJackson Immuno Research805-477-008(1:500)
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
Glass slidesFisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides)12-550-15
Goat anti-Car4R&D Systems AF2414(1:500)
Imaris Bitplane pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + ExplorerMBF Biosciences3D vector based image analysis software
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research017-000-121
Normal Rabbit Serum Equitech-Bio, IncSR30
Olympus FV1000(multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
ParaformaldehydeEMDPX0055-34% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRedLiving Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)632496(1:500)
Rabbit anti-PLCβ2 Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-206(1:500)
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Sodium Phosphate MonobasicFisher ScientificBP330-500
tert-Amyl alcoholAldrich Chemical Company8.06193
Tissue MoldsElectron Microscopy Sciences70180
Tissue-Tek® O.C.T. CompoundSakura4583
Triton X-100BIO-RAD#161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling KitThermoFisher ScientificZ25305Follow kit instructions 

References

  1. Clapp, T. R., Medler, K. F., Damak, S., Margolskee, R. F., Kinnamon, S. C. Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium channels and SNAP-25. BMC Biology. 4 (1), 7 (2006).
  2. Clapp, T. R., Yang, R., Stoick, C. L., Kinnamon, S. C., Kinnamon, J. C. Morphologic characterization of rat taste receptor cells that express components of the phospholipase C signaling pathway. The Journal of Comparative Neurology. 468 (3), 311-321 (2004).
  3. Delay, R. J., Roper, S. D., Kinnamon, J. C. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: II. Cell types and cell lineage. The Journal of Comparative Neurology. 253 (2), 242-252 (1986).
  4. Finger, T. E. Cell types and lineages in taste buds. Chemical Senses. 30, 54-55 (2005).
  5. Kataoka, S., et al. The candidate sour taste receptor, PKD2L1, is expressed by type III taste cells in the mouse. Chemical Senses. 33 (3), 243-254 (2008).
  6. Murray, R. Fine structure of gustatory cells in rabbit taste buds. Journal of Ultrastructure Research. 27 (5-6), 444 (1969).
  7. Murray, R. G., Murray, A. Fine structure of taste buds of rabbit foliate papillae. Journal of Ultrastructure Research. 19 (3), 327-353 (1967).
  8. Yang, R., Crowley, H. H., Rock, M. E., Kinnamon, J. C. Taste cells with synapses in rat circumvallate papillae display SNAP-25-like immunoreactivity. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 205-215 (2000).
  9. Yee, C. L., Yang, R., Böttger, B., Finger, T. E., Kinnamon, J. C. "Type III" cells of rat taste buds: Immunohistochemical and ultrastructural studies of neuron-specific enolase, protein gene product 9.5, and serotonin. Journal of Comparative Neurology. 440 (1), 97-108 (2001).
  10. Zhang, Y., et al. Coding of sweet, bitter, and umami tastes. Cell. 112 (3), 293-301 (2003).
  11. Chandrashekar, J., et al. The taste of carbonation. Science. 326 (5951), 443-445 (2009).
  12. Oka, Y., Butnaru, M., Von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  13. Stratford, J. M., Larson, E. D., Yang, R., Salcedo, E., Finger, T. E. 5-HT3A-driven green fluorescent protein delineates gustatory fibers innervating sour-responsive taste cells: A labeled line for sour taste. Journal of Comparative Neurology. 525 (10), 2358-2375 (2017).
  14. Baumer-Harrison, C., et al. Optogenetic stimulation of type I GAD65(+) cells in taste buds activates gustatory neurons and drives appetitive licking behavior in sodium-depleted mice. The Journal of Neuroscience. 40 (41), 7795-7810 (2020).
  15. Nomura, K., Nakanishi, M., Ishidate, F., Iwata, K., Taruno, A. All-electrical Ca(2+)-independent signal transduction mediates attractive sodium taste in taste buds. Neuron. 106 (5), 816-829 (2020).
  16. Ohmoto, M., Jyotaki, M., Foskett, J. K., Matsumoto, I. Sodium-taste cells require Skn-1a for generation and share molecular features with sweet, umami, and bitter taste cells. eneuro. 7 (6), (2020).
  17. Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
  18. Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  19. Lewandowski, B. C., Sukumaran, S. K., Margolskee, R. F., Bachmanov, A. A. Amiloride-insensitive salt taste is mediated by two populations of type III taste cells with distinct transduction mechanisms. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1942-1953 (2016).
  20. Beidler, L. M., Smallman, R. L. Renewal of cells within taste buds. The Journal of Cell Biology. 27 (2), 263-272 (1965).
  21. Hamamichi, R., Asano-Miyoshi, M., Emori, Y. Taste bud contains both short-lived and long-lived cell populations. Neuroscience. 141 (4), 2129-2138 (2006).
  22. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  23. Spector, A. C., Travers, S. P. The representation of taste quality in the mammalian nervous system. Behavoiral and Cognitive Neuroscience Reviews. 4 (3), 143-191 (2005).
  24. Huang, T., Ohman, L. C., Clements, A. V., Whiddon, Z. D., Krimm, R. F. Variable branching characteristics of peripheral taste neurons indicates differential convergence. bioRxiv. , (2020).
  25. Taruno, A., et al. CALHM1 ion channel mediates purinergic neurotransmission of sweet, bitter and umami tastes. Nature. 495 (7440), 223-226 (2013).
  26. Kinnamon, J. C., Taylor, B. J., Delay, R. J., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds. I. Taste cells and their associated synapses. The Journal of comparative neurology. 235 (1), 48-60 (1985).
  27. Dando, R., et al. A permeability barrier surrounds taste buds in lingual epithelia. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308 (1), 21-32 (2015).
  28. Mistretta, C. M. Permeability of tongue epithelium and its relation to taste. American Journal of Physiology. 220 (5), 1162-1167 (1971).
  29. Michlig, S., Damak, S., Le Coutre, J. Claudin-based permeability barriers in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 502 (6), 1003-1011 (2007).
  30. Kinnamon, S. C., Finger, T. E. Recent advances in taste transduction and signaling. F1000Research. 8, 2117 (2019).
  31. Meng, L., Huang, T., Sun, C., Hill, D. L., Krimm, R. BDNF is required for taste axon regeneration following unilateral chorda tympani nerve section. Experimental Neurology. 293, 27-42 (2017).
  32. Meng, L., Ohman-Gault, L., Ma, L., Krimm, R. F. Taste bud-derived BDNF is required to maintain normal amounts of innervation to adult taste buds. eneuro. 2 (6), (2015).
  33. Tang, T., Rios-Pilier, J., Krimm, R. Taste bud-derived BDNF maintains innervation of a subset of TrkB-expressing gustatory nerve fibers. Molecular and Cellular Neuroscience. 82, 195-203 (2017).
  34. Zhang, G. H., Zhang, H. Y., Deng, S. P., Qin, Y. M. Regional differences in taste bud distribution and -gustducin expression patterns in the mouse fungiform papilla. Chemical Senses. 33 (4), 357-362 (2008).
  35. Huang, T., Ma, L., Krimm, R. F. Postnatal reduction of BDNF regulates the developmental remodeling of taste bud innervation. Developmental Biology. 405 (2), 225-236 (2015).
  36. Nosrat, I. V., Margolskee, R. F., Nosrat, C. A. Targeted taste cell-specific overexpression of brain-derived neurotrophic factor in adult taste buds elevates phosphorylated TrkB protein levels in taste cells, increases taste bud size, and promotes gustatory innervation. Journal of Biological Chemistry. 287 (20), 16791-16800 (2012).
  37. Liebl, D. J., Mbiene, J. -. P., Parada, L. F. NT4/5 mutant mice have deficiency in gustatory papillae and taste bud formation. Developmental Biology. 213 (2), 378-389 (1999).
  38. Kumari, A., Yokota, Y., Li, L., Bradley, R. M., Mistretta, C. M. Species generalization and differences in Hedgehog pathway regulation of fungiform and circumvallate papilla taste function and somatosensation demonstrated with sonidegib. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  39. Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
  40. Meisel, C. T., Pagella, P., Porcheri, C., Mitsiadis, T. A. Three-dimensional imaging and gene expression analysis upon enzymatic isolation of the tongue epithelium. Frontiers in Physiology. 11, 825 (2020).
  41. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  42. Guagliardo, N. A., Hill, D. L. Fungiform taste bud degeneration in C57BL/6J mice following chorda-lingual nerve transection. The Journal of Comparative Neurology. 504 (2), 206-216 (2007).
  43. Ohtubo, Y., Yoshii, K. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in fungiform and soft palate taste buds of mice. Brain Research. 1367, 13-21 (2011).
  44. Ogata, T., Ohtubo, Y. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in the circumvallate and foliate taste buds of mice. Chemical Senses. 45 (4), 261-273 (2020).
  45. Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
  46. Finger, T. E. ATP signaling is crucial for communication from taste buds to gustatory nerves. Science. 310 (5753), 1495-1499 (2005).
  47. Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-CreERT2 recombinase mouse. Molecular Pain. 7 (1), 100 (2011).
  48. Hirsch, M. -. R., D'Autréaux, F., Dymecki, S. M., Brunet, J. -. F., Goridis, C. APhox2b::FLPotransgenic mouse line suitable for intersectional genetics. genesis. 51 (7), 506-514 (2013).
  49. Perea-Martinez, I., Nagai, T., Chaudhari, N. Functional cell types in taste buds have distinct longevities. PLoS ONE. 8 (1), 53399 (2013).
  50. Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. Journal of Comparative Neurology. 525 (18), 3935-3950 (2017).
  51. Dvoryanchikov, G., et al. Transcriptomes and neurotransmitter profiles of classes of gustatory and somatosensory neurons in the geniculate ganglion. Nature Communications. 8 (1), (2017).
  52. Whitehead, M. C., Ganchrow, J. R., Ganchrow, D., Yao, B. Organization of geniculate and trigeminal ganglion cells innervating single fungiform taste papillae: a study with tetramethylrhodamine dextran amine labeling. Neuroscience. 93 (3), 931-941 (1999).
  53. Suemune, S., et al. Trigeminal nerve endings of lingual mucosa and musculature of the rat. Brain Research. 586 (1), 162-165 (1992).
  54. Rutlin, M., et al. The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs. Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).
  55. Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
  56. Feng, P., Huang, L., Wang, H. Taste bud homeostasis in health, disease, and aging. Chemical Senses. 39 (1), 3-16 (2014).
  57. Cooper, K. W., et al. COVID-19 and the chemical senses: supporting players take center stage. Neuron. 107 (2), 219-233 (2020).
  58. Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142 (21), 3620-3629 (2015).
  59. Roper, S. D. Taste buds as peripheral chemosensory processors. Seminars in Cell & Developmental Biology. 24 (1), 71-79 (2013).
  60. Ma, H., Yang, R., Thomas, S. M., Kinnamon, J. C. BMC. Neuroscience. 8 (1), 5 (2007).
  61. Kinnamon, J. C., Sherman, T. A., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: III. Patterns of synaptic connectivity. The Journal of Comparative Neurology. 270 (1), 1-10 (1988).
  62. Romanov, R. A., et al. Chemical synapses without synaptic vesicles: Purinergic neurotransmission through a CALHM1 channel-mitochondrial signaling complex. Science Signaling. 11 (529), 1815 (2018).
  63. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Superresolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68 (5), 843-856 (2010).
  64. Vandenbeuch, A., Clapp, T. R., Kinnamon, S. C. Amiloride-sensitive channels in type I fungiform taste cells in mouse. BMC Neuroscience. 9 (1), 1 (2008).
  65. Bartel, D. L., Sullivan, S. L., Lavoie, &. #. 2. 0. 1. ;. G., Sévigny, J., Finger, T. E. Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2 is the ecto-ATPase of type I cells in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 497 (1), 1-12 (2006).
  66. Wilson, C. E., Vandenbeuch, A., Kinnamon, S. C. Physiological and behavioral responses to optogenetic stimulation of PKD2L1+ type III taste cells. eneuro. 6 (2), (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168afferent

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved