JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе описываются методы подготовки тканей, окрашивания и анализа целых грибовидных, циркумваллятных и небных вкусовых рецепторов, которые последовательно дают целые и неповрежденные вкусовые рецепторы (включая нервные волокна, которые их иннервируют) и поддерживают отношения между структурами в вкусовых рецепторах и окружающим сосочком.

Аннотация

Вкусовые рецепторы представляют собой наборы вкусовых трансдуцирующих клеток, специализированных для обнаружения подмножеств химических стимулов в ротовой полости. Эти трансдуцирующие клетки общаются с нервными волокнами, которые несут эту информацию в мозг. Поскольку вкусовые клетки непрерывно умирают и заменяются на протяжении всей взрослой жизни, среда вкусовых рецепторов является сложной и динамичной, требуя детального анализа ее типов клеток, их местоположения и любых физических отношений между ними. Подробные анализы были ограничены гетерогенностью и плотностью тканей языка, которые значительно снизили проницаемость антител. Эти препятствия требуют протоколов секционирования, которые приводят к расщеплению вкусовых рецепторов по секциям, так что измерения только аппроксимируются, а клеточные отношения теряются. Чтобы преодолеть эти проблемы, способы, описанные в настоящем описании, включают сбор, визуализацию и анализ целых вкусовых рецепторов и отдельных терминальных беседок из трех вкусовых областей: грибовидных сосочков, циркумваллятных сосочков и неба. Сбор целых вкусовых рецепторов уменьшает смещение и техническую изменчивость и может быть использован для представления абсолютных чисел по таким признакам, как объем вкусовых рецепторов, общая иннервация вкусовых рецепторов, количество трансдукирующих клеток и морфология отдельных терминальных беседок. Чтобы продемонстрировать преимущества этого метода, в данной работе приведены сравнения объемов вкусовых рецепторов и иннервации между грибовидными и циркумваллятными вкусовыми рецепторами с использованием общего маркера вкусовых рецепторов и этикетки для всех вкусовых волокон. Также предусмотрен рабочий процесс для использования разреженно-клеточной генетической маркировки вкусовых нейронов (с мечеными подмножествами вкусопередающих клеток). Этот рабочий процесс анализирует структуры отдельных вкусовых нервных беседок, номера типов клеток и физические отношения между клетками с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Вместе эти рабочие процессы обеспечивают новый подход к подготовке тканей и анализу как целых вкусовых рецепторов, так и полной морфологии их иннервирующих беседок.

Введение

Вкусовые рецепторы представляют собой совокупность 50-100 специализированных эпителиальных клеток, которые связывают подмножества химических вкусовых стимулов, присутствующих в ротовой полости. Обычно считается, что вкусопередающие клетки существуют как типы1,2,3,4,5,6,7,8,9,первоначально основанные на критериях электронной микроскопии, которые позже были коррелированы с молекулярными маркерами. Клетки типа II экспрессируют фосфолипазу C-бета 2 (PLCβ2)2 и транзиторный рецепторный потенциал катионного канала, подсемейства M член 51 и включают клетки, которые трансдуцируют сладкий, горький и умами1,10. Клетки iii типа экспрессируют карбоангидразу 4 (Car4)11 и синаптосомально-ассоциированный белок 258 и обозначают клетки, которые в первую очередь реагируют на кислый вкус11. Клетки, которые передают соленость, не были так четко очерчены12,13,14,но потенциально могут включать клетки типа I, типа II и типа III15,16,17,18,19. Среда вкусовых рецепторов сложна и динамична, учитывая, что вкусопередающие клетки непрерывно переворачиваются на протяжении всего взрослого возраста и заменяются базальными прародителями3,20,21. Эти вкусообразующие клетки соединяются с псевдоуниполярными нервными волокнами из геникулятных и петросальных ганглиев, которые передают вкусовую информацию стволу мозга. Эти нейроны в основном были классифицированы на основе типа информации о вкусе, которую онинесут 22,23, потому что информация об их морфологии была неуловимой донедавнего времени 24. Клетки типа II сообщаются с нервными волокнами через модулятор гомеостаза кальция 1 ионных каналов25,тогда как клетки типа III общаются через классические синапсы8,26. Дальнейшая характеристика клеток вкусовых почек, включая трансдуцирующие линии клеточного типа, факторы, влияющие на их дифференцировку, и структуры соединительных беседок являются областями активного исследования.

Исследования вкусовых рецепторов были затруднены несколькими техническими проблемами. Гетерогенные и плотные ткани, составляющие язык, значительно снижают проницаемость антител для иммуногистохимии27,28,29. Эти препятствия потребовали протоколов секционирования, которые приводят к расщеплению вкусовых рецепторов по секциям, так что измерения либо аппроксимируются на основе репрезентативных секций, либо суммируются по секциям. Ранее репрезентативные тонкие сечения использовались для аппроксимации как объемных значений, так и количества преобразовательных клеток30. Более толстое последовательное сечение позволяет получать изображения всех участков вкусовых рецепторов и суммировать измерения из каждой секции31. Вырезание таких толстых участков и отбор только целых вкусовых рецепторов склоняет выборку в сторону более мелких вкусовых рецепторов32,33,34. Оценки иннервации нервов из секционированных вкусовых рецепторов были основаны на анализе чисел пикселей13,35,если количественно оценить их на всех36,37,38. Эти измерения полностью игнорируют структуру и количество отдельных нервных беседок, потому что беседки расщепляются (и обычно плохо маркируются). Наконец, хотя удаление эпителия позволяет окрашивать целые вкусовые рецепторы39,40,оно также удаляет нервные волокна вкусовых рецепторов и может нарушить нормальные отношения между клетками. Поэтому исследования структурных отношений во вкусовых рецепторах были ограничены из-за этого нарушения, вызванного подходами окрашивания.

Сбор всей структуры устраняет необходимость в репрезентативных секциях и позволяет определять абсолютные значения измерений объемов, количества клеток и морфологий структуры41. Этот подход также повышает точность, ограничивает смещение и уменьшает техническую изменчивость. Этот последний элемент важен, потому что вкусовые рецепторы показывают значительную биологическую изменчивость как в пределах34,42, так и в регионах43,44,а анализы вкусовых рецепторов позволяют сравнивать абсолютные числа клеток между контрольными и экспериментальными условиями. Кроме того, способность собирать неповрежденные вкусовые рецепторы позволяет анализировать физические отношения между различными трансдуцирующими клетками и связанными с ними нервными волокнами. Поскольку вкусопередающие клетки могут общаться друг с другом45 и взаимодействовать с нервными волокнами46,эти отношения важны для нормальной функции. Таким образом, условия потери функции могут быть вызваны не потерей клеток, а изменениями в клеточных отношениях. Здесь представлен метод сбора целых вкусовых рецепторов для достижения преимуществ абсолютных измерений для уточнения объемных анализов как для вкусовых рецепторов, так и для их иннервации, количества и формы вкусовых клеток, а также для облегчения анализа отношений между трансдуцирующими клетками и морфологии нервно-беседки. Два рабочих процесса также представлены после этого нового метода приготовления тканей: 1) для анализа объема вкусовых рецепторов и общей иннервации и 2) для разреженно-клеточной генетической маркировки вкусовых нейронов (с помеченными подмножествами клеток, преобразующих вкус) и последующего анализа морфологии вкусово-нервных деревьев, количества типов вкусовых клеток и их форм, а также использование программного обеспечения для анализа изображений для анализа физических отношений между трансдуцирующими клетками и между трансдукцией. клетки и их нервные беседки. Вместе эти рабочие процессы обеспечивают новый подход к подготовке тканей и анализу целых вкусовых рецепторов и полной морфологии их иннервирующих беседок.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Уход за всеми животными осуществлялся в соответствии с руководящими принципами, установленными Политикой Службы общественного здравоохранения США по гуманному уходу и использованию лабораторных животных и Руководством NIH по уходу за лабораторными животными и их использованию. Мыши Phox2b-Cre (штамм MMRRC 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) или мыши TrkBCreER (Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg)были выведены с мышами-репортерами tdTomato (Ai14). AdvillinCreER47 были выведены с Phox2b-flpo48 и Ai65. Для инъекций 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) готовили EdU и рассчитывали дозы в соответствии с Perea-Martinez et al.49.

1. Подготовка материалов

  1. Приготовление растворов
    1. Растворите 5,244 г моноосновного фосфата натрия и 23,004 г двухосновного фосфата натрия в двухдистиллированной воде (ddH2O) на перемешиваемой пластине. Отрегулируйте рН до 7,4 и доведите общий объем до получения 1 л 0,2 М фосфатно-натриевого буфера (ПБ).
    2. Параформальдегид растворяют в ddH2Oв вытяжном шкафу путем нагревания при перемешивании на перемешиваемой пластине до достижения раствором 90°С. Добавьте 4 M Раствор NaOH по каплям, чтобы очистить параформальдегид, и процедите раствор с помощью вакуумной колбы Эрленмейера и керамического фильтра с фильтровальной бумагой. Добавьте равный объем 0,2 М ПБ и отрегулируйте рН до 7,4, чтобы получить 4% ПФА в 0,1 М ПБ.

2. Подготовка тканей

  1. Коллекция тканей
    1. Жертвоприношение мышей с использованием передозировки анестетика рабочим раствором, содержащим 10 мл стерильного физиологического раствора и 0,25 мл запасного раствора, содержащего 5 г 2,2,2-трибромэтанола и 5 мл трет-амилового спирта. Перфьюзиально с 4% ПФА в 0,1 М ПБ; удалить языки и небо.
    2. Изолируют циркумваллятивные вкусовые рецепторы с помощью коронального разреза, разделяющего задний язык, позади межмолярного возвышения; срезать вкусовые рецепторы бритвенным лезвием; а затем разделить передний язык пополам по средней линии. Постфиксируют ночью при 4 °C с 4% PFA в 0,1 М ПБ.
    3. Криозащита тканей в 30% сахарозы в течение ночи при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань может быть заморожена в соединении с оптимальной температурой резания (OCT) с использованием 2-метилбутана, охлажденного в стакане на сухом льду и хранящегося при -80 °C, если процедура должна быть приостановлена здесь.
  2. Грибовидные вкусовые рецепторы
    1. Охладить 2-метилбутан в стакане на сухом льду при подготовке к этапу 2.2.8.
    2. Разморозить и промыть язык в 0,1 М ПБ. Поместите одну половину переднего языка, содержащую грибкообразные сосочки, на стеклянный предметный предметный предмет под рассекающим микроскопом.
    3. Используйте тупые щипцы и ножницы для рассечения, чтобы удалить мышцу. Используйте тупые щипцы, чтобы держать ткань открытой, когда язычный эпителий изогнут, и обеспечьте плоскую ориентацию, удерживая лезвия грубых ножниц для рассечения параллельно эпителию.
    4. Отбросьте вентральный неорогатый эпителий языка, так как он не содержит вкусовых рецепторов.
    5. Используйте тонкие ножницы для рассечения для более близкого рассечения к нижней стороне ороговевшего эпителия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно рассечь близко к эпителию, чтобы оставшаяся мышца имела равномерную толщину, а поверхность была гладкой, чтобы обеспечить равномерное проникновение антител. Следствием неравномерной толщины оставшейся мышцы будет неравномерное сечение на криостате, с воздействием эпителия в области с меньшим количеством мышц и более толстым слоем мышц для других областей, что препятствует проникновению антител.
    6. Используйте тупые щипцы, чтобы положить кусок эпителия в тканевую форму (мышечную сторону вниз) и убедиться, что он лежит ровно. Как только ткань станет плоской, добавьте каплю ОКТ в ткань.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что кончик языка изогнут, может потребоваться сделать разрез в эпителии, где он изогнут, чтобы ткань могла лежать плоско.
    7. Поместите тканевую форму на металлическую основу (предварительно охлажденную в сухом льду) под рассекающий прицел. Продолжайте слегка постукивать по ткани щипцами, пока ОКТ не замерзнет, чтобы ткань замерзла как можно более плоской.
    8. Как только OCT замерзнет, быстро добавьте дополнительный OCT и поместите форму в стакан из 2-метилбутана (охлажденного в сухом льду) до замерзания.
    9. Секционирование криостата
      ПРИМЕЧАНИЕ: Криостат используется для тонкого удаления оставшейся подкожной клетчатки, которая может ингибировать проникновение антител(рисунок 1).
      1. Установите формы OCT на криостат и вырежьте секции размером 20 мкм. Соберите каждый участок и просмотрите его под световым микроскопом, чтобы оценить его близость к основанию эпителия(рисунок 1E - H).
      2. После того, как ткань сбрить с нижней стороны эпителия, разморозьте эпителий и промыть его дважды по 0,1 М ПБ на шейкере.
  3. Циркумваллатные вкусовые рецепторы
    1. Используя корональный разрез бритвенным лезвием, отделите циркумваллятный сосочек от переднего языка. Используйте два парасагиттальных разреза одним и тем же лезвием бритвы, чтобы удалить ткань, боковую к сосочку под рассекающим прицелом. Поместите сосочек в тканевую форму с помощью щипцов так, чтобы один боковой край циркумваллатного сосочки был обращен к нижней части тканевой формы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань может быть заморожена в ОКТ с использованием 2-метилбутана, охлажденного в стакане на сухом льду и сохраненного при -80 °C, если процедура должна быть приостановлена здесь.
    2. Разрежьте ткань на 90 мкм плавающие участки на криостате.
  4. Вкусовые рецепторы на вкус
    1. Срежьте твердое небо спереди к соединению мягкого и твердого неба(рисунок 2). Используйте ножницы, чтобы отделить мягкое небо от подлежащей ткани, убедившись, что все оставшиеся фрагменты кости отрезаны. Удалить дополнительные мышцы и соединительную ткань.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После удаления вся оставшаяся ткань будет состоять из желез и рыхлой соединительной ткани, которые слегка прилипают к нижней стороне неба.
    2. Удерживайте небо тупыми щипцами и удалите оставшиеся железы и рыхлую соединительную ткань, аккуратно соскоблив их лезвием бритвы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань может быть заморожена в ОКТ с использованием 2-метилбутана, охлажденного в стакане на сухом льду и сохраненного при -80 °C, если процедура должна быть приостановлена здесь.

3. Иммуногистохимическое окрашивание

  1. Промыть салфетки с 0,1 М ПБ, 3 х 15 мин. Поместите ткани в пробирки по 1 мл с блокирующим раствором (3% ослиная сыворотка, 0,5% неионное поверхностно-активное вещество (см. Таблицу материалов),0,1 М ПБ) при 4 °C на ночь.
  2. Удаляют блокирующий раствор и инкубируют ткань в первичном антителе (кроличий анти-PCLβ2) в растворе антител (0,1 М ПБ, 0,5% неионное поверхностно-активное вещество) в течение 5 дней при 4 °C.
  3. Промыть с 0,1 М ПБ, 4 х 15 мин каждая промывка, и инкубировать во вторичном антителе против осла против кролика 488 (1:500) в растворе антител в течение 2 дней при 4 °C.
  4. Промыть по 0,1 М ПБ, 4 х 15 мин каждая стирка, и блокировать 5% нормальной кроличьей сывороткой в растворе антител.
  5. Стирка с 0,1 М ПБ, 4 x 15 мин. Инкубировать с анти-кроликом блокирующим антителом (20 мкг/мл) в растворе антител в течение 2 дней при 4 °C.
  6. Промыть с 0,1 М ПБ, 4 х 15 мин каждая промывка, а затем инкубировать с первичным антителом dsRed (кроликом), конъюгированным с флуоресцентной этикеткой (согласно инструкциям производителя) в растворе антител в течение 5 дней при 4 °C.
  7. Промывайте с 0,1 М ПБ, 4 х 15 мин каждая промывка, а затем инкубируйте с первичным антителом (козий анти-Car4 (1:500)) в растворе антител в течение 5 дней при 4 °C.
  8. Стирайте 0,1 М ПБ, 4 x 15 мин каждая стирка. Инкубировать с вторичным ослиным антителом против козы 647 (1:500) в растворе антител в течение 2 дней при 4 °C.
  9. Вымойте 0,1 М ПБ, 4 x 15 мин каждая стирка, установите (эпителиальную сторону вверх) в водных монтажных средах и поместите крышку поверх участка ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании антител из разных видов, как в случае только с кератином-8 и dsRed, добавьте все первичные антитела к раствору антител на этапе 3.2 и все вторичные антитела на этапе 3.3, прежде чем переходить к шагу 3.9.

4. Конфокальная визуализация и деконволюция

  1. Делайте конфокальные изображения с помощью конфокального микроскопа с объективом 60x (числовая диафрагма = 1,40), 4 мс/ пиксель, зумом 3, Калманом 2 и размером 1024 x 1024. Выберите шаг размером 0,47 мм по оси Z. Для захвата иннервации в сосочек используйте зум 2,5, если поле зрения с зумом 3 слишком узкое, чтобы захватить всю иннервацию в сосочек.
  2. Чтобы деконволюциировать изображения, обратите внимание, что некоторые настройки будут автоматически импортироваться вместе с изображением; поэтому заполните оставшиеся детали для модальности, объектива, числовой диафрагмы, иммерсионной среды, образца среды и флуорофоров, захваченных на изображении. Затем выберите 3D Deconvolution.

5. Анализ изображений

  1. Вкусовая рецептор и объем иннервации
    1. Импортируйте деконволютированные стеки изображений в программное обеспечение для анализа изображений на основе пикселей (см. Таблицу материалов)для определения объема вкусовых рецепторов и объема общей иннервации во вкусовой рецепторе.
      1. Снимите флажок Громкость в главном меню Объекта.
      2. Выберите Добавить новые поверхности в меню Объект. Выберите Пропустить автоматическое создание, изменить вручную,а затем выберите Контур.
      3. Нажмите «Выбрать» и наблюдайте за стрелкой, появляющейся как +, чтобы проследить границу вкусового рецептора. Переместите слайсер и наметьте вкусовой рецептор в каждой оптической секции. Как только контуры будут завершены, нажмите «Создать поверхность».
      4. Наблюдайте за объектом объема вкусового рецептора, который теперь появляется в главном меню «Объект». Найдите объем вкусового рецептора в разделе Инструменты.
    2. Объем иннервации внутри вкусового рецептора
      1. Щелкните значок карандаша под объектом вкусового рецептора, затем выберите «Замаскировать все».
      2. В раскрывающемся меню выберите флуоресцентный канал, соответствующий метке нервного волокна. Установите флажок Создать дубликат канала.
      3. Установите флажок Устанавливать вокселы на внешней поверхности на:, и введите 0 в поле.
      4. Наблюдайте за новым каналом, появляющимся в окне «Настройка дисплея», который является неизмененным дубликатом флуоресцентного канала, выбранного во вкусовой рецепторе.
      5. В главном меню «Объект» выберите «Создать новую поверхность». Снимите флажок Пропустить автоматическое создание, редактировать вручную.
      6. Дважды нажмите на синюю стрелку, чтобы перейти к следующему шагу.
      7. Нажмите «Удалить»,затем нажмите на зеленую двойную стрелку, чтобы завершить поверхность, которая представляет собой объем нервных волокон, присутствующих во вкусовой рецепторе. Чтобы найти значение громкости, выберите Инструменты в меню «Объект нервного волокна» и выберите «Громкость» в раскрывающемся меню.
    3. Объем иннервации к сосочку
      1. Создайте объем вкусового рецептора, как описано в разделе 5.1.
      2. Выберите значок карандаша под объектом вкусового рецептора, затем выберите «Маскировать все».
      3. В раскрывающемся меню выберите флуоресцентный канал, соответствующий метке нервного волокна. Установите флажок Создать дубликат канала.
      4. Установите флажок Установить вокселы внутри поверхности на: и введите 0 в поле. Нажмите кнопку ОК.
      5. Создайте поверхность, щелкнув Добавить новую поверхность. Выберите Сегментировать только интересующую область.
      6. Нажмите на синюю стрелкуи увеличьте Z-значение так, чтобы интересующая область начиналась у основания вкусового рецептора.
      7. Дважды нажмите на синюю стрелку, чтобы перейти к следующему шагу.
      8. Нажмите «Удалить»,затем нажмите на зеленую двойную стрелку, чтобы завершить поверхность, которая представляет собой объем иннервации к сосочку. Чтобы найти значение громкости, выберите Инструменты в меню «Объект нервного волокна» и выберите «Громкость» в раскрывающемся меню.
    4. Анализ контактов терминальной беседки
      1. Подготовка изображения
        1. Перейдите в меню Правка и выберите Обрезать 3D. Обрежьте изображение со всех сторон, удалив пространство за пределами вкусового рецептора.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Обрезка как можно ближе к вкусовому рецептору без удаления какой-либо соответствующей структуры - любое избыточное изображение удлинит время обработки.
        2. Выберите Изменить в главном меню, нажмите Изменить тип данных. Выберите Кому: 32-битная плавающая точка в раскрывающемся меню.
        3. Выберите Добавить новые поверхности в меню Объект. Нажмите «Пропустить автоматическое создание», отредактируйте вручную,выберите «Контур»,а затем перетащите положение фрагмента вправо, чтобы найти общее количество оптических фрагментов.
        4. Сгенерируйте изометрические вокселы и убедитесь, что вместо того, чтобы вокселы были прямоугольниками (0,0691 x 0,0691 x 0,474) как XxYxZ, соответственно, вокселы составляли 0,0691 x 0,0691 x 0,0691, разделив прямоугольники на кубы с идентичными значениями интенсивности флуоресценции, что и исходный прямоугольный воксель. Выберите Свойства изображения. Затем разделите значение Z для Voxel Size на значение X или Y (= 0,474/0,0691) и умножьте это значение на количество срезов (оптических секций), найденных на предыдущем шаге.
        5. Вернитесь в Раздел Правка в главном меню и выберите Ресамплинг 3D.
        6. Замените значение Z (количество фрагментов) вновь вычисляемым значением.
      2. Создание автоматических поверхностей на основе флуоресценции
        1. Нажмите «Добавить новую поверхность» еще раз, чтобы добавить новую поверхность, снимите флажок «Сегментировать только интересующую область»и нажмите «Далее».
        2. В раскрывающемся меню Исходный канал выберите канал для одного из типов ячеек, преобразующих вкус. Снимите флажок Smooth и перейдите к следующему шагу.
        3. Не изменяйте на следующем экране ничего, что показывает диапазон интенсивности флуоресценции, присутствующей на изображении. Нажмите на синюю стрелку внизу еще раз, чтобы перейти к следующему шагу.
        4. Нажмите «Удалить»,затем нажмите на зеленую двойную стрелку, чтобы завершить поверхность.
        5. Перейдите в меню «Объект» в левой части экрана, где появится завершенная поверхность ячейки и будет называться чем-то универсальным, таким как Surface 2. Дважды щелкните имя поверхности, чтобы назвать ее в соответствии с тем, что представляет собой метка.
          ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае генерируемая поверхность основана на ячейке, меченной PLCß2.
        6. Если вместо поверхности есть точки, под меню в левом нижнем углу щелкните Поверхность вместо Центральной точки. Затем при появлении запроса нажмите кнопку ОК.
        7. Повторите шаги 5.3.2.1-5.3.2.5 для других маркеров клеток, преобразующих вкус, и маркера нервных волокон.
        8. Сохраните (экспортируйте) ход выполнения.
        9. Нажмите на ячейку типа Surface в главном меню. В меню этого объекта нажмите «Инструменты»,затем нажмите «Преобразование расстояния».
        10. Дождитесь появления всплывающего окна под названием XTDistanceTransformation. Выберите Внешний объект поверхности. Запишите новый канал, который появляется в меню «Коррекция дисплея» с именем «Расстояние до поверхности».
        11. Выберите поверхность нервного волокна в меню «Объект». Нажмите на значок карандаша, а затем Маскировать все.
        12. В появившемся раскрывающемся меню выберите новое имя расстояние канала до поверхности. Запишите новый канал, который появится в окне «Коррекция дисплея» с именем «Маскированное расстояние до поверхности».
        13. Создайте новый объект с помощью главного меню Объект. Снимите флажок Сегментировать только интересующую область и нажмите на синюю стрелку. Выберите Маскированное расстояние до канала PLCß2 и снимите флажок Smooth.
        14. На следующем экране проверьте, есть ли какие-либо области, где клетки, передающие вкус, находятся на самом маленьком расстоянии от нервных волокон, различимых этим программным обеспечением. Для этого установите предел в 0,01-0,11 мкм, чтобы проверить наличие флуоресценции любой рецепторной клетки, близкой к нервным волокнам.
        15. Введите 0,01 в зеленом поле слева, чтобы установить нижнее пороговое значение, нажмите клавишу TAB. Затем нажмите на красную кнопку и введите 0,11, чтобы установить верхний порог. Нажмите tab, а затем щелкните синюю стрелку внизу, чтобы перейти к следующему шагу.
        16. Нажмите «Удалить», а затем зеленую двойную стрелку, чтобы закончить.
        17. Переименуйте эту поверхность в пределах 0,01-0,11 от PLCß2 в меню «Объект». Выберите В пределах 0,01 - 0,11 поверхности PLCß2 в меню «Объект».
        18. Выберите карандаш, затем нажмите «Маска всех». Выберите красный канал (нервное волокно) в раскрывающемся меню и нажмите кнопку «ОК». Запишите новый канал, который появится в окне «Коррекция дисплея» под названием «Маскированный CHS2».
        19. Нажмите на название канала; переименовать канал В пределах 0.01 - 0.11 от PLCß2.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Это флуоресцентный канал, который представляет собой дубликат красного флуоресцентного канала, присутствующего в создаваемой поверхности.
        20. Нажмите на белый в середине селектора цвета. Выберите цвет, контрастирующий с цветами структур.
        21. Экспортируйте (т.е. сохраните) файл на этом этапе.
        22. Повторите шаги 5.4.2.9-5.4.2.21 для других маркеров клеток, преобразующих вкус.
        23. Экспортируйте (т.е. сохраните) файл на этом этапе.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проанализировать близость одного меченого типа клеток к другому, просто замените поверхность нервного волокна на шаге 5.4.2.11 (и следующих шагах) объектом интереса и эквивалентными компонентами, которые относятся к каждой последующей стадии.

6. Реконструкция нейронной беседки и количественная оценка абсолютного числа клеток

  1. Трассировка и анализ беседки терминала
    1. Откройте файл деконволютированного изображения в программном обеспечении для анализа 3D-векторных изображений (см. Таблицу материалов),выберите «Трассировка»,нажмите «Нейрон»,а затем нажмите «Дендрит».
    2. Прокрутите до основания вкусового рецептора в стеке изображений. Проследите каждое волокно до конца во время прокрутки стека изображений.
    3. Находясь на конце ветви, щелкните правой кнопкой мыши на конце и выберите Окончание. В точках ветвления щелкните правой кнопкой мыши и выберите Разделяющий узел.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет отслеживать одну ветвь до конца, а затем возвращаться к точке раздвоения и отслеживать другую ветвь с помощью программы, распознающей, что эта трассировка все еще принадлежит тому же нейрону.
    4. Сохраните файл данных в формате . файл DAT, который затем можно открыть для анализа в программном обеспечении для векторного анализа 3D-изображений.

7. Количественная оценка номера ячейки

  1. Количественно оцените меченые ячейки вкусовых рецепторов в любом программном пакете для анализа изображений, если отдельные маркеры для преобразования типов клеток, закрепленных в z-положении, могут быть размещены на ядерном уровне.

Результаты

Окрашивание лингвального эпителия антителами к dsRed и кератину-8 (общий маркер вкусовых рецепторов) помечено как целыми вкусовыми рецепторами, так и всей иннервацией вкусовых рецепторов у мышей Phox2b-Cre:tdTomato50,51 (рисунок 3A). Визуализация этих в...

Обсуждение

Разработка подхода к последовательному сбору и окрашиванию целых вкусовых рецепторов из трех вкусовых областей полости рта (грибовидная, циркумвалляция и небо) обеспечивает значительные улучшения для анализа вкусовых клеток, отслеживания вновь включенных клеток, иннервации и отноше...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Кависку Курупаранантху за ее вклад в окрашивание тканей и визуализацию циркумваллатных вкусовых рецепторов, Дженнифер Сюй за окрашивание и визуализацию иннервации в сосочек, Кайти Хорн за уход за животными и генотипирование и Ликун Ма за окрашивание тканей вкусовых рецепторов мягкого неба. Этот проект был поддержан R21 DC014857 и R01 DC007176 для R.F.K и F31 DC017660 для L.O.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-TribromoethanolACROS OrganicsAC421430100
2-MethylbutaneACROS126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-007-00315.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgGJackson Immuno Research712-605-150(1:500)
AutoQuant X3 software Media Cybernetics
Blunt End ForcepsFine Science Tools FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation KitMolecular ProbesC10637Follow kit instructions 
CoverglassMarienfeld107242
Cytokeratin-8Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826) Troma1 supernatant(1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse)RobozRS-5619
Dissection Scissors (fine)MoriaMC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21206(1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555ThermoFisher ScientificA31572(1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgGJackson Immuno Research805-477-008(1:500)
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
Glass slidesFisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides)12-550-15
Goat anti-Car4R&D Systems AF2414(1:500)
Imaris Bitplane pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + ExplorerMBF Biosciences3D vector based image analysis software
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research017-000-121
Normal Rabbit Serum Equitech-Bio, IncSR30
Olympus FV1000(multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
ParaformaldehydeEMDPX0055-34% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRedLiving Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)632496(1:500)
Rabbit anti-PLCβ2 Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-206(1:500)
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Sodium Phosphate MonobasicFisher ScientificBP330-500
tert-Amyl alcoholAldrich Chemical Company8.06193
Tissue MoldsElectron Microscopy Sciences70180
Tissue-Tek® O.C.T. CompoundSakura4583
Triton X-100BIO-RAD#161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling KitThermoFisher ScientificZ25305Follow kit instructions 

Ссылки

  1. Clapp, T. R., Medler, K. F., Damak, S., Margolskee, R. F., Kinnamon, S. C. Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium channels and SNAP-25. BMC Biology. 4 (1), 7 (2006).
  2. Clapp, T. R., Yang, R., Stoick, C. L., Kinnamon, S. C., Kinnamon, J. C. Morphologic characterization of rat taste receptor cells that express components of the phospholipase C signaling pathway. The Journal of Comparative Neurology. 468 (3), 311-321 (2004).
  3. Delay, R. J., Roper, S. D., Kinnamon, J. C. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: II. Cell types and cell lineage. The Journal of Comparative Neurology. 253 (2), 242-252 (1986).
  4. Finger, T. E. Cell types and lineages in taste buds. Chemical Senses. 30, 54-55 (2005).
  5. Kataoka, S., et al. The candidate sour taste receptor, PKD2L1, is expressed by type III taste cells in the mouse. Chemical Senses. 33 (3), 243-254 (2008).
  6. Murray, R. Fine structure of gustatory cells in rabbit taste buds. Journal of Ultrastructure Research. 27 (5-6), 444 (1969).
  7. Murray, R. G., Murray, A. Fine structure of taste buds of rabbit foliate papillae. Journal of Ultrastructure Research. 19 (3), 327-353 (1967).
  8. Yang, R., Crowley, H. H., Rock, M. E., Kinnamon, J. C. Taste cells with synapses in rat circumvallate papillae display SNAP-25-like immunoreactivity. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 205-215 (2000).
  9. Yee, C. L., Yang, R., Böttger, B., Finger, T. E., Kinnamon, J. C. "Type III" cells of rat taste buds: Immunohistochemical and ultrastructural studies of neuron-specific enolase, protein gene product 9.5, and serotonin. Journal of Comparative Neurology. 440 (1), 97-108 (2001).
  10. Zhang, Y., et al. Coding of sweet, bitter, and umami tastes. Cell. 112 (3), 293-301 (2003).
  11. Chandrashekar, J., et al. The taste of carbonation. Science. 326 (5951), 443-445 (2009).
  12. Oka, Y., Butnaru, M., Von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  13. Stratford, J. M., Larson, E. D., Yang, R., Salcedo, E., Finger, T. E. 5-HT3A-driven green fluorescent protein delineates gustatory fibers innervating sour-responsive taste cells: A labeled line for sour taste. Journal of Comparative Neurology. 525 (10), 2358-2375 (2017).
  14. Baumer-Harrison, C., et al. Optogenetic stimulation of type I GAD65(+) cells in taste buds activates gustatory neurons and drives appetitive licking behavior in sodium-depleted mice. The Journal of Neuroscience. 40 (41), 7795-7810 (2020).
  15. Nomura, K., Nakanishi, M., Ishidate, F., Iwata, K., Taruno, A. All-electrical Ca(2+)-independent signal transduction mediates attractive sodium taste in taste buds. Neuron. 106 (5), 816-829 (2020).
  16. Ohmoto, M., Jyotaki, M., Foskett, J. K., Matsumoto, I. Sodium-taste cells require Skn-1a for generation and share molecular features with sweet, umami, and bitter taste cells. eneuro. 7 (6), (2020).
  17. Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
  18. Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  19. Lewandowski, B. C., Sukumaran, S. K., Margolskee, R. F., Bachmanov, A. A. Amiloride-insensitive salt taste is mediated by two populations of type III taste cells with distinct transduction mechanisms. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1942-1953 (2016).
  20. Beidler, L. M., Smallman, R. L. Renewal of cells within taste buds. The Journal of Cell Biology. 27 (2), 263-272 (1965).
  21. Hamamichi, R., Asano-Miyoshi, M., Emori, Y. Taste bud contains both short-lived and long-lived cell populations. Neuroscience. 141 (4), 2129-2138 (2006).
  22. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  23. Spector, A. C., Travers, S. P. The representation of taste quality in the mammalian nervous system. Behavoiral and Cognitive Neuroscience Reviews. 4 (3), 143-191 (2005).
  24. Huang, T., Ohman, L. C., Clements, A. V., Whiddon, Z. D., Krimm, R. F. Variable branching characteristics of peripheral taste neurons indicates differential convergence. bioRxiv. , (2020).
  25. Taruno, A., et al. CALHM1 ion channel mediates purinergic neurotransmission of sweet, bitter and umami tastes. Nature. 495 (7440), 223-226 (2013).
  26. Kinnamon, J. C., Taylor, B. J., Delay, R. J., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds. I. Taste cells and their associated synapses. The Journal of comparative neurology. 235 (1), 48-60 (1985).
  27. Dando, R., et al. A permeability barrier surrounds taste buds in lingual epithelia. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308 (1), 21-32 (2015).
  28. Mistretta, C. M. Permeability of tongue epithelium and its relation to taste. American Journal of Physiology. 220 (5), 1162-1167 (1971).
  29. Michlig, S., Damak, S., Le Coutre, J. Claudin-based permeability barriers in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 502 (6), 1003-1011 (2007).
  30. Kinnamon, S. C., Finger, T. E. Recent advances in taste transduction and signaling. F1000Research. 8, 2117 (2019).
  31. Meng, L., Huang, T., Sun, C., Hill, D. L., Krimm, R. BDNF is required for taste axon regeneration following unilateral chorda tympani nerve section. Experimental Neurology. 293, 27-42 (2017).
  32. Meng, L., Ohman-Gault, L., Ma, L., Krimm, R. F. Taste bud-derived BDNF is required to maintain normal amounts of innervation to adult taste buds. eneuro. 2 (6), (2015).
  33. Tang, T., Rios-Pilier, J., Krimm, R. Taste bud-derived BDNF maintains innervation of a subset of TrkB-expressing gustatory nerve fibers. Molecular and Cellular Neuroscience. 82, 195-203 (2017).
  34. Zhang, G. H., Zhang, H. Y., Deng, S. P., Qin, Y. M. Regional differences in taste bud distribution and -gustducin expression patterns in the mouse fungiform papilla. Chemical Senses. 33 (4), 357-362 (2008).
  35. Huang, T., Ma, L., Krimm, R. F. Postnatal reduction of BDNF regulates the developmental remodeling of taste bud innervation. Developmental Biology. 405 (2), 225-236 (2015).
  36. Nosrat, I. V., Margolskee, R. F., Nosrat, C. A. Targeted taste cell-specific overexpression of brain-derived neurotrophic factor in adult taste buds elevates phosphorylated TrkB protein levels in taste cells, increases taste bud size, and promotes gustatory innervation. Journal of Biological Chemistry. 287 (20), 16791-16800 (2012).
  37. Liebl, D. J., Mbiene, J. -. P., Parada, L. F. NT4/5 mutant mice have deficiency in gustatory papillae and taste bud formation. Developmental Biology. 213 (2), 378-389 (1999).
  38. Kumari, A., Yokota, Y., Li, L., Bradley, R. M., Mistretta, C. M. Species generalization and differences in Hedgehog pathway regulation of fungiform and circumvallate papilla taste function and somatosensation demonstrated with sonidegib. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  39. Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
  40. Meisel, C. T., Pagella, P., Porcheri, C., Mitsiadis, T. A. Three-dimensional imaging and gene expression analysis upon enzymatic isolation of the tongue epithelium. Frontiers in Physiology. 11, 825 (2020).
  41. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  42. Guagliardo, N. A., Hill, D. L. Fungiform taste bud degeneration in C57BL/6J mice following chorda-lingual nerve transection. The Journal of Comparative Neurology. 504 (2), 206-216 (2007).
  43. Ohtubo, Y., Yoshii, K. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in fungiform and soft palate taste buds of mice. Brain Research. 1367, 13-21 (2011).
  44. Ogata, T., Ohtubo, Y. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in the circumvallate and foliate taste buds of mice. Chemical Senses. 45 (4), 261-273 (2020).
  45. Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
  46. Finger, T. E. ATP signaling is crucial for communication from taste buds to gustatory nerves. Science. 310 (5753), 1495-1499 (2005).
  47. Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-CreERT2 recombinase mouse. Molecular Pain. 7 (1), 100 (2011).
  48. Hirsch, M. -. R., D'Autréaux, F., Dymecki, S. M., Brunet, J. -. F., Goridis, C. APhox2b::FLPotransgenic mouse line suitable for intersectional genetics. genesis. 51 (7), 506-514 (2013).
  49. Perea-Martinez, I., Nagai, T., Chaudhari, N. Functional cell types in taste buds have distinct longevities. PLoS ONE. 8 (1), 53399 (2013).
  50. Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. Journal of Comparative Neurology. 525 (18), 3935-3950 (2017).
  51. Dvoryanchikov, G., et al. Transcriptomes and neurotransmitter profiles of classes of gustatory and somatosensory neurons in the geniculate ganglion. Nature Communications. 8 (1), (2017).
  52. Whitehead, M. C., Ganchrow, J. R., Ganchrow, D., Yao, B. Organization of geniculate and trigeminal ganglion cells innervating single fungiform taste papillae: a study with tetramethylrhodamine dextran amine labeling. Neuroscience. 93 (3), 931-941 (1999).
  53. Suemune, S., et al. Trigeminal nerve endings of lingual mucosa and musculature of the rat. Brain Research. 586 (1), 162-165 (1992).
  54. Rutlin, M., et al. The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs. Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).
  55. Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
  56. Feng, P., Huang, L., Wang, H. Taste bud homeostasis in health, disease, and aging. Chemical Senses. 39 (1), 3-16 (2014).
  57. Cooper, K. W., et al. COVID-19 and the chemical senses: supporting players take center stage. Neuron. 107 (2), 219-233 (2020).
  58. Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142 (21), 3620-3629 (2015).
  59. Roper, S. D. Taste buds as peripheral chemosensory processors. Seminars in Cell & Developmental Biology. 24 (1), 71-79 (2013).
  60. Ma, H., Yang, R., Thomas, S. M., Kinnamon, J. C. BMC. Neuroscience. 8 (1), 5 (2007).
  61. Kinnamon, J. C., Sherman, T. A., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: III. Patterns of synaptic connectivity. The Journal of Comparative Neurology. 270 (1), 1-10 (1988).
  62. Romanov, R. A., et al. Chemical synapses without synaptic vesicles: Purinergic neurotransmission through a CALHM1 channel-mitochondrial signaling complex. Science Signaling. 11 (529), 1815 (2018).
  63. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Superresolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68 (5), 843-856 (2010).
  64. Vandenbeuch, A., Clapp, T. R., Kinnamon, S. C. Amiloride-sensitive channels in type I fungiform taste cells in mouse. BMC Neuroscience. 9 (1), 1 (2008).
  65. Bartel, D. L., Sullivan, S. L., Lavoie, &. #. 2. 0. 1. ;. G., Sévigny, J., Finger, T. E. Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2 is the ecto-ATPase of type I cells in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 497 (1), 1-12 (2006).
  66. Wilson, C. E., Vandenbeuch, A., Kinnamon, S. C. Physiological and behavioral responses to optogenetic stimulation of PKD2L1+ type III taste cells. eneuro. 6 (2), (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

168

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены