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요약

이 논문은 전체 및 그대로 미각 (내면의 신경 섬유 포함)을 일관되게 산출하고 미각과 주변 유두 내의 구조 사이의 관계를 유지하는 전체 곰팡이, 둘레 및 미각 미각의 조직 준비, 염색 및 분석을위한 방법을 설명합니다.

초록

미각은 구강 내 화학 자극의 하위 집합을 검출하기 위해 특화된 미각 변환 세포의 모음입니다. 이 유도 세포는 두뇌에 이 정보를 전송하는 신경 섬유와 통신합니다. 맛을 유발하는 세포가 지속적으로 죽고 성년 내내 대체되기 때문에 미각 환경은 복잡하고 역동적이므로 세포 유형, 위치 및 신체 관계에 대한 상세한 분석이 필요합니다. 상세한 분석은 항체 투과성을 현저하게 감소시킨 혀 조직 이질성 및 밀도에 의해 제한되었습니다. 이러한 장애물은 측정이 근사화되고 세포 관계가 손실되도록 섹션 간에 미각을 분할하는 프로토콜을 필요로 합니다. 이러한 과제를 극복하기 위해, 본원에 설명된 방법은 곰팡이 유두, 둘레 유두 및 입맛의 세 가지 맛 부위에서 전체 미각 및 개별 말단 아버를 수집, 이미징 및 분석하는 것을 포함합니다. 전체 미각을 수집하는 것은 편견과 기술적 가변성을 감소시키며 미각 부피, 총 미각 내부, 트랜스듀싱 셀 수 및 개별 터미널 아버의 형태와 같은 기능에 대한 절대 숫자를 보고하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 장점을 입증하기 위해, 이 논문은 일반적인 미각 마커와 모든 미각 섬유에 대한 라벨을 사용하여 곰팡이 형태와 둘레 미각 사이의 미각과 내면의 볼륨의 비교를 제공합니다. 미각 뉴런의 희소세포 유전 라벨링(미각 유도 세포의 표지된 하위 세트)의 사용을 위한 워크플로우도 제공됩니다. 이 워크플로는 개별 미각 신경 식목, 세포 유형 번호 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 세포 간의 물리적 관계를 분석합니다. 이러한 워크플로우는 전체 미뢰와 내면의 식목의 완전한 형태에 대한 조직 준비 및 분석을 위한 새로운 접근법을 제공합니다.

서문

미각은 구강에 존재하는 화학 맛 자극의 하위 집합을 결합하는 50-100 전문 상피 세포의 모음입니다. 미각 유도 세포는 일반적으로 유형1,2,3,4,5,6,7,8,9로존재하도록 생각되며, 처음에는 나중에 분자 마커와 상관관계가 있었던 전자 현미경 기준에 기초하여. 타입 II 세포는 인지질제 C-베타 2 (PLCβ2)2 및 과도 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 M 부재 51을 발현하고 달콤하고 쓴 맛, 및 감칠맛1,10을트랜스듀싱하는 세포를 포함한다. 타입 III 세포는 탄산 안수분해 4 (Car4)11 및 시냅토소말 관련 단백질(258)을 발현하고 주로신맛(11)에반응하는 세포를 나타냅니다. 짠맛을 유발하는세포는12,13,14로명확하게 묘사되지 않았지만 잠재적으로 타입 I, 유형 II 및 타입 III 세포15,16,17,18,19를포함할 수 있다. 미각 환경은 맛을 유발하는 세포가 지속적으로 성인기에 걸쳐 인계되고 기저 선조3,20,21로대체된다는 점을 감안할 때 복잡하고 역동적입니다. 이러한 맛 을 유발하는 세포는 뇌간으로 맛 정보를 전달하는 유전자 절인 및 석유 신경교에서 의사 단극성 신경 섬유에 연결합니다. 이러한 뉴런은 주로22,23을 운반하는 맛 정보의 종류에 따라 분류되었습니다. 타입 II 세포는 칼슘 항상성 변조기 단백질 1 이온 채널25를통해 신경 섬유와 통신하는 반면, 타입 III 세포는 고전적인 시냅스를 통해통신8,26. 미각 세포의 추가 특성화-세포 형 혈통 을 변환 포함 하 여, 그들의 분화에 영향을 미치는 요인, 그리고 연결 식목의 구조는 모두 적극적인 조사의 영역.

미각 연구는 몇 가지 기술적 인 도전에 의해 방해되었습니다. 혀를 구성하는 이종및 조밀한 조직은 면역조직화학(27,28,29)에대한 항체 투과성을 현저히 감소시다. 이러한 장애물은 측정이 대표 섹션에 따라 근사되거나 섹션 전체에 걸쳐 합산되도록 섹션 에 걸쳐 미각을 분할하는 결과 단면 프로토콜이 필요합니다. 이전에는 대표적인 얇은 섹션이 볼륨 값과 트랜스듀싱 셀 수30을모두 근사화하는 데 사용되었습니다. 두꺼운 직렬 단면은 모든 미각 섹션의 이미징과 각 섹션31에서측정의 합산을 허용합니다. 이러한 두꺼운 섹션을 절단하고 전체 미각 바이어스 바이어스 샘플링 작은 미각을 향해 샘플링32,33,34. 단면 미각에서 신경 내선 추정은 픽셀 번호13,35,모든36,37,38에서정량화하는 경우의 분석을 기반으로합니다. 이러한 측정은 개별 신경 식목의 구조와 수를 완전히 무시합니다. 마지막으로, 상피를 벗겨내더라도 전체 미각이39,40으로얼룩지게 되고, 미각 신경 섬유를 제거하고 세포 간의 정상적인 관계를 방해할 수 있습니다. 따라서 미각 내의 구조적 관계에 대한 조사는 염색 접근법으로 인한 이러한 중단으로 인해 제한되었습니다.

전체 구조 컬렉션은 대표 섹션에 대한 필요성을 제거하고 볼륨, 셀 카운트 및 구조 형태(41)의절대 값 측정을 할 수 있습니다. 또한 이 방법은 정확도를 높이고 바이어스를 제한하며 기술적 변동성을 줄입니다. 이 마지막 요소는 미각이34,42및 지역43,44 내의 상당한 생물학적 가변성을 나타내기 때문에 중요하며 전체 미각 분석은 절대 세포 수를 제어 및 실험 조건 사이에서 비교할 수 있도록 합니다. 더욱이, 그대로 미각을 수집하는 능력은 다른 트랜스듀싱 세포와 그들의 관련 신경 섬유 사이의 물리적 관계의 분석을 허용한다. 미각 유도 세포는 서로 통신할 수 있기 때문에(45) 신경 섬유와 통신 할 수 있습니다(46)이러한 관계는 정상적인 기능에 중요하다. 따라서 기능 상실 조건은 세포의 손실 때문이 아니라 세포 관계의 변화로 인한 것일 수 있습니다. 여기에 제공 된 전체 미각을 수집하여 미각과 내면, 미각 세포 수 및 모양 모두에 대한 볼륨 분석을 정제하고 세포 관계 및 신경 아버 형태학의 분석을 촉진하기위한 절대 측정의 이점을 얻을 수 있습니다. 두 가지 워크플로우는 또한 조직 준비를위한이 새로운 전체 마운트 방법의 다운스트림을 제시한다 : 1) 미각 부피 및 총 내부 를 분석하기위한 2) 미각 뉴런의 희소 세포 유전 라벨링 (맛 변환 세포의 하위 세트) 및 맛 신경 아버 형태의 후속 분석, 맛 세포 유형과 그 모양 사이의 물리적 분석 사이의 이미지 분석 및 변환 사이의 이미지 분석 세포와 그들의 신경 수목. 이러한 워크플로우는 조직 준비와 전체 미뢰 분석 및 내면의 식목의 완전한 형태에 대한 새로운 접근 방식을 제공합니다.

프로토콜

참고: 모든 동물은 미국 공중 보건 서비스 정책이 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 대한 지침과 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 보살핌을 받았습니다. Phox2b-Cre 마우스(MMRRC 균주 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) 또는 TrkBCreER 마우스(Ntrk2 tm3.1(cre/ERT2)Ddg)는tdTomato 리포터 마우스(Ai14)로 사육하였다. 애드빌린CreER47은 Phox2b-flpo48과 Ai65로 사육되었습니다. 5-에티닐-2′-deoxyuridine (EdU) 주사에 대 한, EdU 준비 하 고 페레아-마르티네즈외49에따라 계산 된 복용량.

1. 재료 의 준비

  1. 솔루션 준비
    1. 교반판에 5.244g의 단원나트륨 인산염과 23.004g의 디베이직 나트륨 인산염을 이중 증류수(ddH2O)에 녹입니다. pH를 7.4로 조정하고, 총 부피를 가져와 0.2M 나트륨 인산염 버퍼(PB)의 1L을 얻습니다.
    2. 용액이 90 °C에 도달 할 때까지 교반 접시에 교반하는 동안 가열하여 연기 후드에 ddH2O에 para포름 알데히드를 녹입니다. 4M NaOH 용액을 드롭와이즈로 추가하여 파라포름알데히드를 지우고 필터 용지가 있는 진공 Erlenmeyer 플라스크 및 세라믹 필터를 사용하여 용액을 필터링합니다. 동일한 볼륨0.2M PB를 추가하고 pH를 7.4로 조정하여 0.1 M PB에서 4%의 PFA를 얻습니다.

2. 조직 준비

  1. 티슈 컬렉션
    1. 멸균 식염수 10mL및 0.25 mL의 비축용액을 함유한 작업 용액으로 마취 과다 복용을 사용하여 마우스를 희생하여 2,2,2-트리브로모에탄올5g과 테르트-암닐 알코올 5mL를 함유한 스톡 용액을 함유하고 있다. 0.1 M PB에서 4 % PFA와 트랜스 카디와 함께 perfuse; 혀와 입맛을 제거합니다.
    2. 관상 동맥 을 사용하여 주위 미각을 분리 하 여 후방 혀를 분리, intermolar 저명한 뒤에; 면도날로 미각을 잘라냅니다. 그런 다음 중간선에서 전방 혀를 양분합니다. 0.1 M PB에서 4 % PFA로 4 °C에서 하룻밤 후 수정하십시오.
    3. Cryo는 4 °C에서 하룻밤 사이에 30 % 자당으로 조직을 보호합니다.
      참고: 조직은 건조 얼음에 비커에서 냉각및 절차가 일시 중지해야 하는 경우 -80 °C에 저장 - 2-메틸 부탄을 사용하여 최적의 절단 온도 (OCT) 화합물에서 동결 될 수있다.
  2. 곰팡이 모양의 미각
    1. 2.2.8 단계를 준비하기 위해 드라이 아이스비커로 2-메틸부탄을 식힙니다.
    2. 0.1 M PB에서 혀를 녹이고 헹구는 다. 해부 현미경 아래 유리 슬라이드에 곰팡이 유두를 포함하는 전방 혀의 절반을 놓습니다.
    3. 무딘 끝의 집게와 해부 가위를 사용하여 근육을 제거하십시오. 무딘 단면 포셉을 사용하여 언어 상피가 구부러질 때 조직을 열고 거친 해부 가위의 블레이드를 상피와 평행하게 유지하여 평평한 방향을 보장합니다.
    4. 입맛이 들어 있지 않은 혀의 복부 비각질화 상피를 버리십시오.
    5. 각질화된 상피의 밑면에 더 가깝게 해부할 미세해부 가위를 사용하십시오.
      참고: 남은 근육이 균일한 두께이고 표면이 균일한 항체 침투를 보장하기 위해 매끄럽도록 상피에 가깝게 해부하는 것이 중요합니다. 남은 근육의 비 균일 한 두께의 결과는 저근육과 다른 영역에 대한 근육의 두꺼운 층이있는 영역에서 상피의 노출과 함께, 냉동에 고르지 않은 단면이 될 것입니다, 이는 항체 침투를 방해.
    6. 무딘 끝의 집게를 사용하여 상피 조각을 조직 금형 (근육 측면 아래)에 놓고 평평하게 놓습니다. 조직이 평평해지면 조직에 OCT 한 방울을 추가하십시오.
      참고: 혀의 끝이 구부러져 있다는 점을 감안할 때, 조직이 평평하게 놓도록 만들 수 있도록 곡선이 있는 상피에서 절단해야 할 수도 있습니다.
    7. 조직 금형을 해부 범위 아래에 금속 염기(이전에 드라이 아이스로 냉각)에 놓습니다. OCT가 동결될 때까지 집게로 조직을 가볍게 두드리며 조직이 가능한 한 평평하게 얼어 붙는지 확인합니다.
    8. OCT가 얼어 붙으면 10월을 추가로 추가하고 금형을 냉동될 때까지 2-메틸부탄(드라이 아이스로 냉각)의 비커에 넣습니다.
    9. 극저온 단면
      참고: 저온기질은 항체 침투를 억제할 수 있는 남은 피하 조직의 미세 제거를 위해 사용된다(도1).
      1. 100억 개의 금형을 냉동고에 장착하고 20 μm 구간을 잘라냅니다. 각 섹션을 수집하고, 상피의 기저에 근접을 평가하기 위해 광 현미경으로 볼 수 있습니다(도 1E - H).
      2. 조직이 상피의 밑면에서 면도 한 후, 상피를 해동하고 셰이커에 0.1 M PB에서 두 번 헹구.
  3. 외경 미각
    1. 면도날로 코로날 컷을 사용하여 주위 유두를 앞쪽 혀에서 분리합니다. 동일한 면도날로 두 개의 기생 절단을 사용하여 해부 범위 하에서 유두에 대한 조직 측면을 제거하십시오. 유두의 측면 가장자리가 조직 금형의 바닥을 향하도록 집게를 사용하여 조직 금형에 유두를 놓습니다.
      참고: 조직은 건조 얼음에 비커에 냉각 및 절차가 여기에 일시 중지해야하는 경우 -80 °C에 저장 2 메틸 부탄을 사용하여 10 월에 냉동 될 수있다.
    2. 극저온에 90 μm 부동 섹션으로 조직을 잘라.
  4. 입맛에 미각
    1. 부드러운 입맛의 접합에 하드 입맛을 앞쪽으로 잘라(도 2). 가위를 사용하여 부드러운 입맛을 기본 조직과 분리하여 남은 뼈 조각이 잘려나도록 하십시오. 추가 근육과 결합 조직을 제거합니다.
      참고: 일단 제거되면, 남아있는 모든 조직은 땀샘과 느슨한 결합 조직으로 구성되며, 이는 입맛의 밑면에 가볍게 부착됩니다.
    2. 미각을 무딘 끝의 집게로 잡고 면도날로 부드럽게 긁어 남은 땀샘과 느슨한 결합 조직을 제거합니다.
      참고: 조직은 건조 얼음에 비커에 냉각 및 절차가 여기에 일시 중지해야하는 경우 -80 °C에 저장 2 메틸 부탄을 사용하여 10 월에 냉동 될 수있다.

3. 면역 투약 화학 염색

  1. 0.1 M PB, 3 x 15 분으로 티슈를 씻으시면 됩니다. 블로킹 용액(당나귀 혈청 3%, 비이온 계면활성제 참조)및 0.1M PB를 4°C에 1mL 튜브에 배치합니다.
  2. 차단 용액을 제거하고, 4°C에서 5일간 항체 용액(0.1M PB, 0.5% 비이온 계면활성제)에서 1차 항체(토끼 항-PCLβ2)에서 조직을 배양한다.
  3. 0.1 M PB로 세척하고, 4 x 15 분 각 세척으로 세척하고, 4 °C에서 2 일 동안 항체 용액에서 이차 당나귀 안티 래빗 488 항체 (1:500)로 배양하십시오.
  4. 0.1 M PB로 세척하고, 각 세척시 4 x 15분으로 세척하고, 항체 용액에 5% 일반 토끼 세럼으로 차단합니다.
  5. 0.1 M PB, 4 x 15 분으로 씻으시면 하십시오. 당나귀 항토끼 차단 항체(20 μg/mL)를 항체 용액에서 4°C에서 2일 동안 배양한다.
  6. 0.1 M PB로 세척한 다음, 4x 15분 세척한 다음, 4°C에서 5일 동안 항체 용액에서 형광 라벨(제조업체의 지시에 따라)에 공주된 1차 항체 dsRed(토끼)로 배양한다.
  7. 0.1 M PB로 세척한 후 4°C에서 5일간 항체 용액에서 1차 항체(염소 안티카4(1:500)로 배양한다.
  8. 0.1 M PB, 4 x 15 분 각 세척으로 세척하십시오. 4°C에서 2일간 항체 용액에 이차 당나귀 항염소 647 항체(1:500)를 배양한다.
  9. 0.1 M PB로 세척하고, 각 세척시 4 x 15분으로 세척하고, 수성 마운팅 미디어에 마운트(상피 사이드 업)로 세척하고, 티슈 섹션 위에 커버슬립을 놓습니다.
    참고: 다른 종으로부터의 항체를 사용하는 경우, 각질-8 및 dsRed만의 경우와 같이, 3.2 단계및 모든 이차 항체3.9 단계로 진행하기 전에 항체 용액에 모든 1차 항체를 추가한다.

4. 공초점 이미징 및 감소

  1. 60배 목표(수치 조리개= 1.40), 4ms/픽셀, 3의 줌, 칼만 2, 크기 1024 x 1024의 구초점 현미경을 사용하여 공초점 이미지를 캡처합니다. z축을 따라 0.47mm의 스텝 크기를 선택합니다. 유두에 대한 내면을 캡처하려면 줌을 사용하여 3의 줌이 있는 시야가 너무 좁으면 유두에 대한 모든 내면을 캡처합니다.
  2. 이미지를 deconvolute하려면 일부 설정이 이미지와 함께 자동으로 가져올 수 있습니다. 따라서 이미지에 캡처된 양식, 목표 렌즈, 수치 조리개, 침수 매체, 샘플 매체 및 형광에 대한 나머지 세부 정보를 입력합니다. 그런 다음 3D Deconvolution을 선택합니다.

5. 이미지 분석

  1. 미각과 이너밴션 볼륨
    1. 조각상 스택을 픽셀 기반 이미지 분석 소프트웨어(재료 표참조)로 가져오기하여 미각 의 양과 총 내적 내분의 볼륨을 결정합니다.
      1. 주 개체 메뉴에서 볼륨을 선택 취소합니다.
      2. 개체 메뉴에서 새 서피스 추가를 선택합니다. 자동 생성 건너뛰기, 수동으로 편집한다음 윤곽을선택합니다.
      3. 선택 및 미각의 경계를 추적하는 데 도움이 +로 나타나는 화살표를 관찰클릭합니다. 슬라이서를 이동하고 각 광학 섹션에서 미각을 간략하게 설명합니다. 윤곽선이 완료되면 서피스 만들기를클릭합니다.
      4. 이제 주 오브젝트 메뉴에 나타나는 미각 볼륨 오브젝트를 관찰합니다. 도구에서 미각의 볼륨을 찾습니다.
    2. 미각 내의 내면의 볼륨
      1. 미각 오브젝트 에서 연필 아이콘을 선택한 다음 마스크 모두를 선택합니다.
      2. 드롭다운 메뉴에서 신경 섬유 라벨에 해당하는 형광 채널을 선택합니다. 중복 채널 만들기를확인합니다.
      3. 바깥쪽 의 복셀 을 확인합니다:, 상자에 0을 입력합니다.
      4. 미각 내에서 선택한 형광 채널의 변경되지 않은 복제인 디스플레이 조정 창에 나타나는 새 채널을 관찰합니다.
      5. 주 개체 메뉴에서 새 서피스 만들기를 선택합니다. 자동 생성 건너뛰기, 수동으로 편집의선택 취소.
      6. 파란색 화살표를 두 번 클릭하여 다음 단계로 진행합니다.
      7. 삭제를클릭한 다음 녹색 이중 화살표를 클릭하여 미각 내에 존재하는 신경 섬유의 양을 나타내는 표면을 완성합니다. 볼륨값을 찾으려면 신경 섬유 오브젝트 메뉴 아래에 도구를 선택하고 드롭다운 메뉴에서 볼륨을 선택합니다.
    3. 유두에 대한 내면의 부피
      1. 섹션 5.1에 설명된 바와 같이 미각의 볼륨을 만듭니다.
      2. 미각 오브젝트 아래에 있는 연필 아이콘을 선택한 다음 마스크 모두를 선택합니다.
      3. 드롭다운 메뉴에서 신경 섬유 라벨에 해당하는 형광 채널을 선택합니다. 중복 채널 만들기를확인합니다.
      4. 표면 내부의 복셀 설정을 확인하고 상자에 0을 입력합니다. 확인을 클릭합니다.
      5. 새 서피스 추가를클릭하여 서피스를 생성합니다. 관심 영역만 세그먼트를 선택합니다.
      6. 파란색 화살표를클릭하고 관심 영역이 미각의 기지에서 시작되도록 Z 값을 증가시면 됩니다.
      7. 파란색 화살표를 두 번 클릭하여 다음 단계로 진행합니다.
      8. 삭제를클릭한 다음 녹색 이중 화살표를 클릭하여 유두에 대한 내부 영역의 볼륨을 나타내는 표면을 완료합니다. 볼륨값을 찾으려면 신경 섬유 오브젝트 메뉴 아래에 도구를 선택하고 드롭다운 메뉴에서 볼륨을 선택합니다.
    4. 터미널 아버 접촉 분석
      1. 이미지 준비
        1. 편집 메뉴로 이동하여 자르기 3D를 선택합니다. 모든 면에서 이미지를 자르고 미각 외부의 공간을 제거합니다.
          참고: 관련 구조를 제거하지 않고 미각에 가깝게 자르면 과도한 이미지가 처리 시간을 연장합니다.
        2. 메인 메뉴에서 편집을 선택하고 데이터 유형 변경을 클릭합니다. 선택: 드롭다운 메뉴에서 32비트 플로트.
        3. 개체 메뉴에서 새 서피스 추가를 선택합니다. 자동 생성 건너뛰기를 클릭하고 수동으로 편집한다음 윤곽을선택한 다음 슬라이스 위치를 오른쪽으로 드래그하여 총 광학 슬라이스 수를 찾습니다.
        4. 등등 측정 복셀생성, 그리고 복셀대신 직사각형 (0.0691 x 0.0691 x 0.474) XxYxZ로, 각각, 복셀은 0.0691 x 0.0691 x 0.0691 원래 의 흐름 강도에 대한 동일한 값큐브로 사각형을 분할하여 있는지 확인합니다. 이미지 속성선택 . 그런 다음 복셀 크기에 대한 Z 값을 X 또는 Y 값(= 0.474/0.0691)으로 나누고 해당 값을 이전 단계에서 찾아볼 수 있는 슬라이스 수(광학 단면)로 곱합니다.
        5. 주 메뉴에서 편집으로 돌아가 서 3D 리샘플링을선택합니다.
        6. Z 값(슬라이스 수)을 새로 계산된 값으로 바꿉니다.
      2. 형광에 기초한 자동 표면 만들기
        1. 새 표면 추가를 다시 클릭하여 새 표면을 추가하고, 관심 있는 영역만 세그먼트를선택 해제하고, 다음을 클릭합니다.
        2. 소스 채널 드롭다운 메뉴에서 맛을 변환하는 셀 유형 중 하나에 대한 채널을 선택합니다. 매끄러운 선택을 취소하고 다음 단계로 계속합니다.
        3. 이미지에 존재하는 형광 강도의 범위를 보여주는 다음 화면에서 아무것도 변경하지 마십시오. 아래쪽의 파란색 화살표를 클릭하여 다음 단계로 이동합니다.
        4. 삭제를클릭한 다음 녹색 이중 화살표를 클릭하여 표면을 완성합니다.
        5. 완성된 셀 표면이 나타나고 Surface 2와같은 일반 이라고 표시되는 화면왼쪽의 오브젝트 메뉴로 이동합니다. 서피스 이름을 두 번 클릭하여 레이블이 나타내는 내용에 따라 이름을 지정합니다.
          참고: 이 경우 생성된 표면은 PLCß2 표지셀을 기반으로 합니다.
        6. 왼쪽 아래 모서리의 메뉴 아래에 서피스 대신 점이 있는 경우 중심 점 대신 Surface를 클릭합니다. 그런 다음 메시지가 표시되면 확인을 클릭합니다.
        7. 다른 미각 유도 세포 마커 및 신경 섬유 마커에 대한 5.3.2.1-5.3.2.5 단계를 반복한다.
        8. 진행 상황을 저장(내보내기)합니다.
        9. 주 메뉴에서 셀 유형 Surface를 클릭합니다. 해당 개체의 메뉴에서 도구를클릭한 다음 거리 변환을 클릭합니다.
        10. XTDistanceTransformation라는 팝업 상자가 나타날 때까지 기다립니다. 표면 객체 외부를 선택합니다. 표시 조정 메뉴에 나타나는 새 채널에 대해 표시 이름까지의 거리를 기록합니다.
        11. 오브젝트 메뉴에서 신경 섬유 표면을 선택합니다. 연필 아이콘을 클릭한 다음 모든 것을 마스크합니다.
        12. 나타나는 드롭다운 메뉴에서 새 채널 거리에서 표면 이름까지의 거리를 선택합니다. 마스크된거리에서 표면 이름까지라는 표시 조정 창에 나타나는 새 채널을 기록합니다.
        13. 주 개체 메뉴를 사용하여 새 개체를 만듭니다. 선택 취소 된 관심 영역만 세그먼트와 파란색 화살표를클릭합니다. 마스크된 거리에서 PLCß2 채널까지의 거리를 선택하고 매끄러운 선택을 취소합니다.
        14. 다음 화면에서 맛 을 유발하는 세포가이 소프트웨어에서 식별 할 수있는 신경 섬유에서 가장 작은 거리 내에있는 영역이 있는지 확인하십시오. 이렇게 하려면 0.01-0.11 μm의 한계를 설정하여 신경 섬유에 가까운 수용체 세포 형광을 확인하십시오.
        15. 왼쪽의 녹색 상자에 0.01을 입력하여 아래 임계값을 설정하고 탭을누릅니다. 그런 다음 빨간색 버튼을 클릭하고 0.11을 입력하여 위 쪽 임계값을 설정합니다. 탭을 누른 다음 하단의 파란색 화살표를 클릭하여 다음 단계로 이동합니다.
        16. 삭제를 클릭한 다음 녹색 이중 화살표를 클릭하여 완료합니다.
        17. 개체 메뉴에서 PLC2의 0.01-0.11 내에서 이 표면의 이름을 바꿉니다. 개체 메뉴에서 PLCß2 표면의 0.01 - 0.11 내에서 선택합니다.
        18. 연필을 선택한 다음 마스크 모두를 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 빨간색(신경 섬유) 채널을 선택하고 확인을 클릭합니다.
        19. 채널의 이름을 클릭합니다. PLCs2의 0.01 - 0.11 내에서 채널이름을 변경합니다.
          참고: 생성된 표면 내에 있는 적색 형광 채널의 복제본을 나타내는 형광 채널입니다.
        20. 색상 선택기 가운데흰색을 클릭합니다. 구조의 색상과 대조되는 색상을 선택합니다.
        21. 이 단계에서 파일을 내보내기(예: 저장)합니다.
        22. 다른 미각 유도 세포 마커에 대한 5.4.2.9-5.4.2.21 단계를 반복한다.
        23. 이 단계에서 파일을 내보내기(예: 저장)합니다.
          참고: 레이블이 부착된 세포 유형의 근접성을 다른 세포 유형에 분석하려면 5.4.2.11 단계(및 다음 단계)에서 신경 섬유 표면을 관심 있는 대상 및 각 후속 단계와 관련된 동등한 구성 요소로 교체하기만 하면 됩니다.

6. 뉴런 식목 재건 및 절대 세포 수 정량화

  1. 터미널 아버 추적 및 분석
    1. 3D 벡터 기반 이미지 분석 소프트웨어(재료 표참조)에서 데콘볼루트 이미지 파일을 열고 추적을선택하고 뉴런을클릭한 다음 Dendrite를 클릭합니다.
    2. 이미지 스택의 미각 베이스로 스크롤합니다. 이미지 스택을 스크롤하는 동안 각 섬유를 끝까지 추적합니다.
    3. 분기 끝에 있을 때 끝을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 엔딩을 선택합니다. 분기 점에서 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 분기 노드를 선택합니다.
      참고: 이렇게 하면 한 분기를 끝까지 추적한 다음 분기 지점으로 돌아가서 이 추적이 여전히 동일한 뉴런임을 인식하는 프로그램으로 다른 분기를 추적할 수 있습니다.
    4. 데이터 파일을 로 저장합니다. 그런 다음 3D 벡터 기반 이미지 분석 소프트웨어에서 분석을 위해 열 수 있는 DAT 파일입니다.

7. 셀 번호 정량화

  1. z-위치에 고정된 세포 유형을 변환하기 위한 뚜렷한 마커가 핵 레벨에 배치될 수 있는 한 임의의 이미지 분석 소프트웨어 패키지에 라벨이 부착된 미각 세포를 정량화한다.

결과

dsRed 및 각질-8(일반 미각 마커)에 대한 항체를 가진 언어 상피의 염색은 전체 미각과 Phox2b-Cre:tdTomato 마우스50,51 (그림 3A)의모든 미각 내부를 모두 표시하였다. 모공에서 기지까지 이러한 미각을 이미징하면 가장 높은 해상도의 X-y 평면이미지(그림 3A,B)가나타났습니다. 픽셀 기반 이미징 프로그램?...

토론

3개의 구강 맛 영역(곰팡이형태, 둘레 및 입맛)에서 전체 미각을 지속적으로 수집하고 얼룩지게 하는 접근법의 개발은 미각 변환 세포를 분석하고, 새로 통합된 세포를 추적하고, 이 구조물 사이의 관계를 추적하기 위한 상당한 개선을 제공한다. 또한, 표지된집단(50)의내부 또는 외부의 잠재적이 보조 뉴런 마커의 국소화를 용이하게 한다. 이것은 또한 몇몇 맛 신경세포를 표시할...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

우리는 조직 염색에 그녀의 기여와 외경 미각의 이미징에 대한 Kavisca Kuruparanantha에 감사드립니다, 유두에 내부의 염색및 이미징제니퍼 쉬, 동물 관리 및 genotyping케이티 혼, 부드러운 입맛 의 그녀의 조직 염색에 대한 리쿤 마. 이 프로젝트는 R21 DC014857 및 R01 DC007176에서 R.F.K 및 F31 DC017660에서 L.O까지 지원되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-TribromoethanolACROS OrganicsAC421430100
2-MethylbutaneACROS126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-007-00315.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgGJackson Immuno Research712-605-150(1:500)
AutoQuant X3 software Media Cybernetics
Blunt End ForcepsFine Science Tools FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation KitMolecular ProbesC10637Follow kit instructions 
CoverglassMarienfeld107242
Cytokeratin-8Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826) Troma1 supernatant(1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse)RobozRS-5619
Dissection Scissors (fine)MoriaMC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21206(1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555ThermoFisher ScientificA31572(1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgGJackson Immuno Research805-477-008(1:500)
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
Glass slidesFisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides)12-550-15
Goat anti-Car4R&D Systems AF2414(1:500)
Imaris Bitplane pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + ExplorerMBF Biosciences3D vector based image analysis software
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research017-000-121
Normal Rabbit Serum Equitech-Bio, IncSR30
Olympus FV1000(multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
ParaformaldehydeEMDPX0055-34% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRedLiving Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)632496(1:500)
Rabbit anti-PLCβ2 Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-206(1:500)
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Sodium Phosphate MonobasicFisher ScientificBP330-500
tert-Amyl alcoholAldrich Chemical Company8.06193
Tissue MoldsElectron Microscopy Sciences70180
Tissue-Tek® O.C.T. CompoundSakura4583
Triton X-100BIO-RAD#161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling KitThermoFisher ScientificZ25305Follow kit instructions 

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