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Method Article
真菌机会性病原体可引起危及生命的轻微感染,但在研究毒力时,非致命表型经常被忽视。因此,我们开发了一种线虫模型,该模型监测宿主的生存和繁殖方面,以研究真菌的毒力。
虽然病原体对人类可能是致命的,但其中许多病原体会导致一系列具有非致命表型的感染类型。白色念珠菌是一种人类机会性真菌病原体,是医院感染的第四大最常见原因,导致 ~40% 的死亡率。然而,其他白色念珠菌感染不太严重,很少致命,包括外阴阴道念珠菌病,影响 ~75% 的女性,以及口咽念珠菌病,主要影响婴儿、艾滋病患者和癌症患者。虽然小鼠模型最常用于研究白色念珠菌的发病机制,但这些模型主要评估宿主存活率,并且成本高、耗时且复制有限。因此,已经开发了几种微型模型系统,包括 Drosophila melanogaster、Danio rerio、Galleria mellonella 和 Caenorhabditis elegans,来研究白色念珠菌。这些微型模型非常适合筛选白色念珠菌的突变文库或不同的遗传背景。在这里,我们描述了两种使用秀丽隐杆线虫研究白色念珠菌感染的方法。第一种是繁殖力测定,用于测量宿主的繁殖并监测个体宿主的存活。第二种是谱系扩展测定,用于测量白色念珠菌感染如何影响多代宿主种群的增长。总之,这些检测提供了一种简单、经济高效的方法来快速评估白色念珠菌的毒力。
白色念珠菌 是一种人类的机会性真菌病原体,生活在不同的生态位,包括口腔、胃肠道和泌尿生殖道1。虽然白色念珠菌通常是共鸣的,但会引起粘膜和血流感染,后者可能是致命的。白色念珠菌感染的严重程度取决于宿主免疫功能,免疫功能低下的个体比健康个体更容易受到感染1。除了宿主相关因素外,白色念珠菌还具有多种毒力特性,包括菌丝、生物膜形成和分泌型天冬氨酰蛋白酶 (SAP) 的产生,其功能是促进白色念珠菌粘附和侵袭宿主上皮细胞2,以及念珠菌溶血素,一种溶细胞肽毒素 3,4。总之,这表明白色念珠菌毒力是病原体与其宿主环境相互作用产生的复杂表型。因此,与体外方法相比,最好使用作为宿主环境的模式生物来研究毒力。
已经开发了几种宿主模型,包括脊椎动物和无脊椎动物生物,用于研究白色念珠菌感染。小鼠模型被认为是金标准,因其适应性和先天免疫系统以及监测全身和特定器官疾病进展的能力而经常使用5。然而,这种宿主模型存在重大局限性,包括维护成本、后代数量少以及与小样本量相关的功效和重现性降低5。因此,已经开发了其他更简单的模式生物,如斑马鱼 (Danio rerio)、果蝇 (Drosophila melanogaster)、蜡蛾 (Galleria mellonella) 和线虫 (Caenorhabditis elegans)。与小鼠模型相比,这些非哺乳动物模式生物体型更小,需要较少的实验室维护,并且更大的样品量具有更大的功效和可重复性。这些模型中的每一种都有特定的优点和缺点,在选择感染模型时需要考虑这些优点和缺点。G. mellonella 提供与人类最相似的生理环境,因为它可以在 37 °C 下生长并具有各种吞噬细胞7。此外,该模型允许直接注射特异性接种物7。然而,没有完全测序的基因组,也没有创造突变菌株的既定方法。与 G. mellonella 类似,D. rerio 模型允许直接注射特异性接种物 5,7。它还具有适应性和先天免疫系统5 (eninstalled immune system),这是这种非哺乳动物模型所独有的,但需要水生繁殖池来维护。黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫具有相似的优缺点,其中包括易于作和产生突变菌株7 但没有适应性免疫或细胞因子7 的完全测序基因组。在所有这些非哺乳动物模型中,秀丽隐杆线虫具有最快的生命周期,自我受精以产生大量遗传相同的后代,并且最适合大规模筛选 6,7,8。秀丽隐杆线虫在抗真菌药物的高通量筛选 9,10、表征毒力因子7 和鉴定白色念珠菌特异性宿主防御网络11 方面非常强大。秀丽隐杆线虫的先天免疫系统具有多种成分,这些成分与人类高度保守12。宿主先天防御包括抗菌肽13 (AMP) 和活性氧 14,15,16 的产生。
白色念珠菌感染的严重程度主要通过宿主存活率来衡量,但不能捕捉非致命性毒力表型。宿主适应性的一个经常被忽视的方面是繁殖,但一些研究表明,白色念珠菌通过降低精子活力来影响繁殖17,18,这表明这可能是需要研究的宿主适应性的一个重要方面。因此,白色念珠菌感染对宿主繁殖力的影响是研究非致命毒力表型的有用方法。我们已经开发了两种使用秀丽隐杆线虫的感染测定法,以研究健康宿主的存活和繁殖表型19,20。在这里,我们描述了繁殖力和谱系扩展测定。繁殖力测量单个宿主的后代产生和存活率,谱系扩展评估宿主三代感染的后果。我们展示了如何利用这些检测来筛选白色念珠菌缺失突变体,以捕获致死和非致死毒力表型的显著和细微差异。
1. 实验的准备步骤
2. 繁殖力测定
注:中的代表性数据如 补充表 1 所示,原理图如图 1A 所示。
对于 1 个仿行 | 大肠杆菌 (OP50) 控制条件 | C. albicanS & E. coli (OP50) 治疗条件 | |||||
OP50 | H2O | 总 | OP50 | C. albicans 白色念珠菌 | H2O | 总 | |
第 0 天 | 6.25 美克 | 43.75 美 分 | 50 公厘 | 6.25 美克 | 1.25 毫米 | 42.5 公升 | 50 公厘 |
第 2-7 天 | 1.25 毫米 | 8.75 美 分 | 10 美升 | 1.25 毫米 | .25 微米 | 8.5 美升 | 10 美升 |
表 2:感染线虫以进行繁殖力测定所需的大肠杆菌和白色念珠菌培养物的预混液体积。
实验日 (Day 0)
3. 谱系扩增检测
注意:中的代表性数据如 补充表 2 所示,原理图如图 2A 所示。
大肠杆菌 (OP50) 控制条件 | C. albicans和E. coli (OP50)。治疗条件 | ||||||
对于 1 个仿行 | OP50 | H2O | 总 | OP50 | C. albicans 白色念珠菌 | H2O | 总 |
1.25 毫米 | 8.75 美 分 | 10 美升 | 37.5 公厘 | 7.5 公升 | 255 华尔 | 300 公厘 |
表 3:用于谱系扩增测定感染线虫所需的大肠杆菌和白色念珠菌培养物的预混液体积。
线虫种群增长:第 0 天
在这里,我们提出了两种测定方法,使用秀丽隐杆线虫作为感染模型来测量白色念珠菌毒力作为非致死性表型。 第一项检测方法,即繁殖力,监测白色念珠菌感染如何影响单个宿主的后代生产和生存。第二种检测方法,谱系扩展,测量白色念珠菌感染如何影响多代人口增长。
在 白色念珠?...
在这里,我们提出了两种测量真菌毒力的简单测定法。两种检测都利用 秀丽隐杆线 虫作为宿主系统,包括监测致死和非致死宿主表型。例如,繁殖力测定研究个体感染宿主的繁殖成功率,同时也测量个体存活率。每日监测不仅提供总育雏大小,还提供繁殖时间和死亡时间。谱系扩增测定是作为繁殖力测定的简化版本开发的,由于需要较少的宿主转移和每日计数,?...
作者没有需要披露的竞争利益。
我们感谢 Dorian Feistel、Rema Elmostafa 和 McKenna Penley 在开发我们的检测和数据收集方面提供的帮助。这项研究得到了 NSF DEB-1943415 (MAH) 的支持。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL eppendorf microtubes 3810X | Millipore Sigma | Z606340 | |
100 mm x 15 mm petri plates | Sigma-Aldrich | P5856-500EA | |
15 mL Falcon Conicals | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
50 mL Falcon Conicals | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Adenine | Millipore Sigma | A8626 | |
Agar (granulated, bacterilogical grade) | Apex BioResearch Produces | 20-248 | |
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) | Genesee Scientific | 59-1M32P | |
Ammonium Chloride | Millipore Sigma | 254134 | |
Bacterial Cell Spreader | SP Scienceware | 21TP50 | |
BactoPeptone | Fisher BioReagants | BP1420-500 | |
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) | FIsherBrand | 14-961-33 | |
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) | Nikon Instrument Inc. | ||
E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
Glucose | Millipore Sigma | 50-99-7 | |
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) | Falcon | 353001 | |
Metal Spatula | SP Scienceware | 8TL24 | |
Nematode Growth Media (NGM) | Dot Scientific | DSN81800-500 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma | P0662-500G | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Sodium Phosphate | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Streptomycin Sulfate | Thermo-Fisher Scientific | 11860038 | |
Tryptone | Millipore Sigma | 91079-40-2 | |
Uridine | Millipore Sigma | U3750 | |
Wildtype C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | |
Yeast Extract | Millipore Sigma | 8013-01-2 |
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