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摘要

真菌机会性病原体可引起危及生命的轻微感染,但在研究毒力时,非致命表型经常被忽视。因此,我们开发了一种线虫模型,该模型监测宿主的生存和繁殖方面,以研究真菌的毒力。

摘要

虽然病原体对人类可能是致命的,但其中许多病原体会导致一系列具有非致命表型的感染类型。白色念珠菌是一种人类机会性真菌病原体,是医院感染的第四大最常见原因,导致 ~40% 的死亡率。然而,其他白色念珠菌感染不太严重,很少致命,包括外阴阴道念珠菌病,影响 ~75% 的女性,以及口咽念珠菌病,主要影响婴儿、艾滋病患者和癌症患者。虽然小鼠模型最常用于研究白色念珠菌的发病机制,但这些模型主要评估宿主存活率,并且成本高、耗时且复制有限。因此,已经开发了几种微型模型系统,包括 Drosophila melanogaster、Danio rerioGalleria mellonellaCaenorhabditis elegans,来研究白色念珠菌。这些微型模型非常适合筛选白色念珠菌的突变文库或不同的遗传背景。在这里,我们描述了两种使用秀丽隐杆线虫研究白色念珠菌感染的方法。第一种是繁殖力测定,用于测量宿主的繁殖并监测个体宿主的存活。第二种是谱系扩展测定,用于测量白色念珠菌感染如何影响多代宿主种群的增长。总之,这些检测提供了一种简单、经济高效的方法来快速评估白色念珠菌的毒力。

引言

白色念珠菌 是一种人类的机会性真菌病原体,生活在不同的生态位,包括口腔、胃肠道和泌尿生殖道1。虽然白色念珠菌通常是共鸣的,但会引起粘膜和血流感染,后者可能是致命的。白色念珠菌感染的严重程度取决于宿主免疫功能,免疫功能低下的个体比健康个体更容易受到感染1。除了宿主相关因素外,白色念珠菌还具有多种毒力特性,包括菌丝、生物膜形成和分泌型天冬氨酰蛋白酶 (SAP) 的产生,其功能是促进白色念珠菌粘附和侵袭宿主上皮细胞2,以及念珠菌溶血素,一种溶细胞肽毒素 3,4。总之,这表明白色念珠菌毒力是病原体与其宿主环境相互作用产生的复杂表型。因此,与体外方法相比,最好使用作为宿主环境的模式生物来研究毒力。

已经开发了几种宿主模型,包括脊椎动物和无脊椎动物生物,用于研究白色念珠菌感染。小鼠模型被认为是金标准,因其适应性和先天免疫系统以及监测全身和特定器官疾病进展的能力而经常使用5。然而,这种宿主模型存在重大局限性,包括维护成本、后代数量少以及与小样本量相关的功效和重现性降低5。因此,已经开发了其他更简单的模式生物,如斑马鱼 (Danio rerio)、果蝇 (Drosophila melanogaster)、蜡蛾 (Galleria mellonella) 和线虫 (Caenorhabditis elegans)。与小鼠模型相比,这些非哺乳动物模式生物体型更小,需要较少的实验室维护,并且更大的样品量具有更大的功效和可重复性。这些模型中的每一种都有特定的优点和缺点,在选择感染模型时需要考虑这些优点和缺点。G. mellonella 提供与人类最相似的生理环境,因为它可以在 37 °C 下生长并具有各种吞噬细胞7。此外,该模型允许直接注射特异性接种物7。然而,没有完全测序的基因组,也没有创造突变菌株的既定方法。与 G. mellonella 类似,D. rerio 模型允许直接注射特异性接种物 5,7它还具有适应性和先天免疫系统5 (eninstalled immune system),这是这种非哺乳动物模型所独有的,但需要水生繁殖池来维护。黑腹果蝇秀丽隐杆线虫具有相似的优缺点,其中包括易于作和产生突变菌株7 但没有适应性免疫或细胞因子7 的完全测序基因组。在所有这些非哺乳动物模型中,秀丽隐杆线虫具有最快的生命周期,自我受精以产生大量遗传相同的后代,并且最适合大规模筛选 6,7,8秀丽隐杆线虫在抗真菌药物的高通量筛选 9,10、表征毒力因子7 和鉴定白色念珠菌特异性宿主防御网络11 方面非常强大。秀丽隐杆线虫的先天免疫系统具有多种成分,这些成分与人类高度保守12。宿主先天防御包括抗菌肽13 (AMP) 和活性氧 14,15,16 的产生。

白色念珠菌感染的严重程度主要通过宿主存活率来衡量,但不能捕捉非致命性毒力表型。宿主适应性的一个经常被忽视的方面是繁殖,但一些研究表明,白色念珠菌通过降低精子活力来影响繁殖17,18,这表明这可能是需要研究的宿主适应性的一个重要方面。因此,白色念珠菌感染对宿主繁殖力的影响是研究非致命毒力表型的有用方法。我们已经开发了两种使用秀丽隐杆线虫的感染测定法,以研究健康宿主的存活和繁殖表型19,20。在这里,我们描述了繁殖力和谱系扩展测定。繁殖力测量单个宿主的后代产生和存活率,谱系扩展评估宿主三代感染的后果。我们展示了如何利用这些检测来筛选白色念珠菌缺失突变体,以捕获致死和非致死毒力表型的显著和细微差异。

研究方案

1. 实验的准备步骤

  1. 制备 白色念珠菌大肠杆菌 培养物
    注:本研究中使用的菌株列于 表 1 中。
    1. 白色念珠菌大肠杆菌 菌株作为甘油储备液维持在 -80 °C。
    2. 使用无菌牙签,将所需的 白色念珠菌 菌株划线到固体酵母蛋白胨葡萄糖 (YPD)(1% 酵母提取物、2% 细菌胨、2% 葡萄糖、1.5% 琼脂、0.004% 腺嘌呤、0.008% 尿苷)上,并在 30 °C 下生长过夜。
      注意:如果 白色念珠菌 菌株具有营养缺陷型,请在培养基中补充必要的氨基酸。
    3. 使用无菌环或牙签,将单个 白色念珠菌 菌落接种到 2 mL 液体 YPD 中。在 30 °C 下振荡孵育 24 小时。
    4. 使用无菌牙签,将 大肠杆菌 (OP50) 划线到 Luria 肉汤(LB;10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L NaCl、15 g/L 琼脂)琼脂平板上。在 30 °C 下孵育过夜。
    5. 将单个 OP50 菌落接种到 50 mL LB 中。在 30 °C 下振荡孵育过夜。
  2. 线虫生长培养基制备
    1. 在 2 L 培养瓶中,将 29 g 线虫生长培养基粉末(NGM;17.5 g/L 琼脂、3.0 g/L 氯化钠、2.5 g/L 蛋白胨、0.005 g/L 胆固醇)加入 1 L 水中,并与搅拌棒混合。
    2. 抑制 大肠杆菌 过度生长,并允许白色 念珠菌 增殖,在高压灭菌后用 0.2 g/L 硫酸链霉素补充 NGM。
      注:如果使用 NGM 维持线虫,则不需要链霉素。
  3. 维持线虫种群
    1. 使用金属涂抹器将 300 μL 过夜 大肠杆菌 培养物涂抹在准备好的 NGM 琼脂平板上。这种技术称为种子设定。
    2. 让板在室温 (RT) 下干燥。在 30 °C 下培养板过夜。
    3. 通过每 3-4 天将线虫种群分块到新接种的大 肠杆菌 NGM 板上来维持线虫种群。储存在 20 °C。 分块是一种用于将随机线虫种群快速转移到新播种板中的技术,从而使种群增殖。为此,请使用无菌刮刀从 NGM 琼脂平板上切出一个小方块(1 x 1 英寸)。小心地将方块转移到新种子的 NGM 板上,线虫的一侧朝下放在新的琼脂8 上。
      注意:维持在 20 °C 的 秀丽隐杆线虫 将在 ~48 小时后产生后代,这在同步线虫种群时很有用。维持在 25 °C 的 秀丽隐杆线虫 会发育和繁殖得更快,而维持在 15 °C 的种群生长会更慢。
  4. 线虫种群同步
    1. 从维持在 NGM/OP50 上的现有线虫种群开始。
    2. 将 ~3 mL 的 M9 缓冲液移液到含有线虫的 NGM 板上。将线虫卵从盘子上洗掉,然后用移液管的尖端轻轻地将卵从琼脂上刮下来(它们往往会粘住)。使用 P1000 移液器,将含有虫卵和蠕虫的液体转移到 15 mL 锥形管中。要评估盘子上仍有的鸡蛋数量,请使用解剖显微镜观察琼脂。
    3. 将锥形细胞以 279 x g 和 RT 离心 2 分钟。
    4. 去除上清液,注意不要干扰线虫沉淀。
    5. 加入 3 mL 25% 漂白剂溶液(处理时为“小心”)。
    6. 将试管倒置 2 分钟。使用解剖显微镜检查线虫是否死亡 - 它们将是笔直的且不运动的。
      注意:这只会杀死现有的线虫。鸡蛋的完整性不会受到影响。
    7. 以 279 x g 和 RT 离心 2 分钟。
    8. 去除上清液,将沉淀重悬于 3 mL M9 中。
    9. 以 279 x g 和 RT 离心 2 分钟。
    10. 去除上清液,将沉淀重悬于 300 μL M9 中。
    11. 使用解剖显微镜,将 5 μL 鸡蛋移液到小培养皿上,检查鸡蛋的浓度。理想的浓度应在 20-100 个鸡蛋之间。如果培养物太稀,则通过离心并去除多余的液体来浓缩溶液。如果培养物浓度过高,则添加更多 M9,直至达到所需浓度。
  5. 准备用于线虫感染(接种)的白色 念珠菌 大肠杆菌 培养物。
    1. 准备空白溶液。在比色皿中,混合 900 μL ddH2O 和 100 μL 液体 YPD。
    2. 将比色皿插入分光光度计。使用向上箭头将波长设置为 600 纳米。单击“0 ABS 100% T”按钮设置空白溶液。
    3. 在新的比色皿中,混合 900 μL ddH2O 和 100 μL 过夜酵母培养物。从分光光度计中取出空白溶液,加入含有酵母溶液的比色皿。记录屏幕上显示的光密度(不要按任何按钮)。将读数乘以 10(测得的酵母溶液为 1/10 稀释)。
    4. 在 1.5 mL 微量离心管中用 ddH2O 将培养物标准化至 3.0 OD600/mL。1 OD600 约为 3 x 10-7 CFU/mL21
      注意:如果 OD600 读数为 6.7,则 3 OD/6.7 OD= 0.447 mL,则向微量离心管中加入 447 μL 白色念珠菌 培养物。以最大速度 (16, 873 x g) 离心 30 秒。去除上清液并重悬于 1 mL ddH2O 中。
    5. 将过夜 的大肠杆菌 培养物转移到 50 mL 锥形管中。
    6. 在 RT 下以 279 x g 离心培养物 2 分钟。
    7. 吸出大部分上清液,留下 ~1 mL。
    8. 将沉淀重悬于剩余的上清液中,并转移至预先称重的 1.5 mL 微量离心管中。
    9. 以最大速度旋转微量离心管 30 秒。
    10. 使用 p1000 移液器,除去上清液并称量最终沉淀。
    11. 在 ddH2O 中将大肠杆菌稀释至 200 mg/mL。
    12. 使用预混液计算(表 2)并适当扩展。

2. 繁殖力测定

注:中的代表性数据如 补充表 1 所示,原理图如图 1A 所示。

  1. 获得或制备以下内容:35 mm x 10 mm 培养皿,补充有 0.2 g/L 硫酸链霉素的 NGM,大肠杆菌 OP50 培养物,LB,白色念珠菌培养物,YPD,Wire Pick,M9 缓冲液(3.0 g/L KH2PO 4,6.0 g/L Na2HPO4,0.5 g/L NaCl,1.0 g/L NH4Cl), 15 mL 锥形管。
    实验前 2 天
  2. 白色念珠菌 菌株接种在 2 mL YPD 中,将大 肠杆菌 (OP50) 接种在 50 mL LB 中,并在 30 °C 下生长过夜。
  3. 用补充有 0.2 g/L 硫酸链霉素的 NGM 制备 35 mm x 10 mm 培养皿。准备的板数应持续整个实验。建议的重复次数为每次处理 10 次。对于 10 个重复,将使用 70 个板。1 L NGM 将制作 ~250 个板。
    实验前 1 天
  4. 根据上述接种方案,将补充有链霉素的35毫米x 10毫米 NGM 琼脂板接种至第0天、第2天和第3天(表2)。将适量的预混液移液到板的中心。传播培养物是不必要的,因为单个微生物生长点就足以供宿主摄食,并允许我们轻松识别种子之外的宿主。将板在 RT 孵育过夜。
    注:对于每个实验处理,第 0 天预混液每个重复含有 50 μL 的“种子”。第 2 -7 天包括每个实验处理每个重复 10 μL 的“种子”。没有第 1 天的板,因为线虫在同步到第 4 天的板后 0 小时将达到 L4 阶段。一旦它们达到 L4,单个线虫将被转移到第 2 天板中。
对于 1 个仿行大肠杆菌 (OP50) 控制条件C. albicanS & E. coli (OP50) 治疗条件
OP50H2OOP50C. albicans 白色念珠菌H2O
第 0 天6.25 美克43.75 美 分50 公厘6.25 美克1.25 毫米42.5 公升50 公厘
第 2-7 天1.25 毫米8.75 美 分10 美升1.25 毫米.25 微米8.5 美升10 美升

表 2:感染线虫以进行繁殖力测定所需的杆菌白色念珠菌培养物的预混液体积

实验日 (Day 0)

  1. 同步线虫并将 ~50 个鸡蛋接种到对照板(仅 OP50)和处理板(白色念珠菌 + OP50)的第 0 天重复上。在 20 °C 孵育 48 小时。
    第 2 天
  2. 通过从第 0 天板中挑选8 个线虫到每个重复的第 2 天接种板,转移单个 L4 线虫。L4 宿主可以通过其身体背侧中间的一个小口袋来识别22。转移从相同类型的接种板孵化和成熟的线虫(即,来自 D0 对照板的 L4 线虫必须转移到第 2 天对照板)。
  3. 接种 2 mL YPD 中所需的 白色念珠菌 培养物,在 50 mL LB 中接种大 杆菌(OP50 菌株)。
    第 3 天
  4. 将线虫从第 2 天培养板转移到第 3 天接种板,跟踪每个重复(即,第 2 天的重复 A 必须移动到第 3 天的重复 A 板)。
  5. 将第 2 天(仅包含鸡蛋)和第 3 天(包含单个成虫)板在 20 °C 下孵育 24 小时。
  6. 接种 35 mm x 10 mm NGM,补充链霉素板第 4 天和第 5 天,每板使用 10 μL 预混液(表 2),并在室温下孵育板 24 小时。
    第 4 天
  7. 将线虫从第 3 天接种板转移到第 4 天接种板。
  8. 将第 3 天和第 4 天的板在 20 °C 下孵育 24 小时。
  9. 使用解剖镜,计算每个第 2 天平板的活后代。注意任何死亡或不再在板上(删失)的重复。一旦记录了后代的数量,就丢弃第 2 天的板。
    注意:删失是指消失在盘子上的线虫。当线虫从板中爬出时,就会发生这种情况。虽然在 24 小时窗口期间不太常见,但死线虫的尸体分解到琼脂中也导致审查。删失数据不包括在最终的后代和生存数据分析中。
  10. 在 2 mL YPD 中接种 白色念珠菌 菌株的新培养物,在 50 mL LB 中接种大 杆菌 (OP50)。
    第 5 天
  11. 将线虫从第 4 天培养板转移到第 5 天接种板。
  12. 将第 4 天和第 5 天的板在 20 °C 下孵育 24 小时。
  13. 计算每个第 3 天板的活后代。注意任何死亡或不再在板上(删失)的重复。记录后代数量后,丢弃第 3 天的板。
  14. 将补充链霉素板的 35 mm x 10 mm NGM 接种第 6 天和第 7 天,每板使用 10 μL 预混液(表 2),并在室温下孵育板 24 小时。
    第 6 天
  15. 将线虫从第 5 天板转移到第 6 天种子板。
  16. 将第 5 天和第 6 天的板在 20 °C 下孵育 24 小时。
  17. 计算每个第 4 天板的活后代。注意任何死亡或不再在板上(删失)的重复。一旦记录了后代的数量,就丢弃第 4 天的板。
    第 7 天
  18. 将线虫从第 6 天板转移到第 7 天接种板。
  19. 将第 6 天和第 7 天的板在 20 °C 下孵育 24 小时。
  20. 计算每个第 5 天板的活后代。注意任何死亡或不再在板上(删失)的重复。一旦记录了后代的数量,就丢弃第 5 天的板。
    第 8 天
  21. 计算每个第 6 天板的活后代。注意任何死亡或不再在板上(删失)的重复。一旦记录了后代的数量,就丢弃第 6 天的板。
    第 9 天
  22. 计算每个第 7 天板的活后代。不要计算最大的线虫(亲本)。注意任何死亡或不再在板上(删失)的重复。一旦记录了后代的数量,就丢弃第 7 天的板。
    注意:该测定也可用于评估生存率。记录每个线虫的死亡时间。在实验结束时,可以比较每种处理在 7 天实验中存活的线虫百分比。线虫有时会从食物/病原体来源爬走,并试图爬上培养皿板的载玻片。在继续之前检查板的所有区域。死线虫通常会留下尸体。审查任何无法找到的线虫,并且不要将该线虫视为死亡。不要在后代和生存的最终分析中包括删失数据。
  23. 根据数据集的正态性,使用单因素方差分析或 Kruskal-Wallis 分析育雏大小和晚期繁殖的数据,以及使用 GraphPad Prism 软件进行事后 Tukey/Dunn 多重测试以确定处理组之间的显着差异。使用 Wilcoxon log-rank 检验检测生存曲线之间的差异。

3. 谱系扩增检测

注意:中的代表性数据如 补充表 2 所示,原理图如图 2A 所示。

  1. 获得或制备以下物品:100 mm x 15 mm 培养皿,含有补充有 0.2 g/L 硫酸链霉素的 NGM 琼脂、 大肠 杆菌 OP50 培养物、LB、白色念珠菌 培养物、YPD、M9 缓冲液、Wire Pick、15 mL 锥形管。
    第 -2 天
  2. 白色念珠菌 菌株接种在 2 mL YPD 中,将大 肠杆菌 (OP50) 接种在 50 mL LB 中,并在 30 °C 下生长过夜。
    第 -1 天
  3. 接种 100 mm x 15 mm NGM 琼脂平板,每板补充有链霉素和 300 μL 预混液(表 3)。使用无菌金属涂抹剂将预混液涂抹在板上。将板在 30 °C 下孵育过夜。 建议每次处理重复 6 次。因此,每次处理准备 7 个板(一个板用于同步线虫,每个成年线虫 6 个板)。
大肠杆菌 (OP50) 控制条件C. albicansE. coli (OP50)。治疗条件
对于 1 个仿行OP50H2OOP50C. albicans 白色念珠菌H2O
1.25 毫米8.75 美 分10 美升37.5 公厘7.5 公升255 华尔300 公厘

表 3:用于谱系扩增测定感染线虫所需的杆菌白色念珠菌培养物的预混液体积

线虫种群增长:第 0 天

  1. 同步线虫,将每个对照(仅 OP50)和处理(白色念珠菌 + OP50)的 10-25 个卵放在一个板上,并在 20 °C 下孵育 48 小时。
    第 2 天:
  2. 将单个 L4 蠕虫从每个对照和处理第 0 天板转移到相同处理的种子板中。L4 宿主可以通过其身体背侧中间的一个小口袋来识别22
  3. 在 20 °C 下孵育 5 天(同步后共 1 周)。
    第 7 天:
  4. 使用 p1000 移液器,使用 5 mL M9 缓冲液洗涤每个板中的整个线虫群,然后转移到 15 mL 锥形管中。
  5. 在 4 °C 下储存 1 小时,以使线虫沉淀以便于计数。
  6. 用 M9 缓冲液将每个锥形细胞稀释至最终体积为 10 mL。
  7. 对于每个生物学重复,计数 20 μL 等分试样中的线虫数量。重复此作以获得每个生物重复的 6 个技术重复。回溯计算以确定总人口规模。如果样品太稀(即每个样品少于 10 个线虫),请将群体浓缩在较小体积的 M9 缓冲液中。
    注意:离心活线虫不会伤害线虫。
    计算示例:
    70 台主机 = X(主机总数)
    20 μL(等分试样) 10,000 μL(总体积)
  8. 根据数据集的正态性,使用单向方差分析或 Kruskal-Wallis 分析谱系扩展数据,并使用 GraphPad Prism 软件进行事后 Tukey/Dunn 多重测试以确定治疗组之间的显着差异。

结果

在这里,我们提出了两种测定方法,使用秀丽隐杆线虫作为感染模型来测量白色念珠菌毒力作为非致死性表型第一项检测方法,即繁殖力,监测白色念珠菌感染如何影响单个宿主的后代生产和生存。第二种检测方法,谱系扩展,测量白色念珠菌感染如何影响多代人口增长。

白色念珠?...

讨论

在这里,我们提出了两种测量真菌毒力的简单测定法。两种检测都利用 秀丽隐杆线 虫作为宿主系统,包括监测致死和非致死宿主表型。例如,繁殖力测定研究个体感染宿主的繁殖成功率,同时也测量个体存活率。每日监测不仅提供总育雏大小,还提供繁殖时间和死亡时间。谱系扩增测定是作为繁殖力测定的简化版本开发的,由于需要较少的宿主转移和每日计数,?...

披露声明

作者没有需要披露的竞争利益。

致谢

我们感谢 Dorian Feistel、Rema Elmostafa 和 McKenna Penley 在开发我们的检测和数据收集方面提供的帮助。这项研究得到了 NSF DEB-1943415 (MAH) 的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL eppendorf microtubes 3810XMillipore SigmaZ606340
100 mm x 15 mm petri platesSigma-AldrichP5856-500EA
15 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-959-70C
50 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-432-22
AdenineMillipore SigmaA8626
Agar (granulated, bacterilogical grade)Apex BioResearch Produces20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)Genesee Scientific59-1M32P
Ammonium ChlorideMillipore Sigma254134
Bacterial Cell SpreaderSP Scienceware21TP50
BactoPeptoneFisher BioReagantsBP1420-500
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)FIsherBrand14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)Nikon Instrument Inc.
E. coliCaenorhabditis Genetics CenterOP50
GlucoseMillipore Sigma50-99-7
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)Falcon353001
Metal SpatulaSP Scienceware8TL24
Nematode Growth Media (NGM)Dot ScientificDSN81800-500
Potassium Phosphate monobasicSigmaP0662-500G
Sodium ChlorideFisher ScientificBP358-1
Sodium PhosphateFisher ScientificBP332-500
Streptomycin SulfateThermo-Fisher Scientific11860038
TryptoneMillipore Sigma91079-40-2
UridineMillipore SigmaU3750
Wildtype C. elegansCaenorhabditis Genetics CenterN2
Yeast ExtractMillipore Sigma8013-01-2

参考文献

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