JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mantar fırsatçı patojenleri, yaşamı tehdit eden ve küçük enfeksiyonlara neden olabilir, ancak virülans incelenirken ölümcül olmayan fenotipler sıklıkla göz ardı edilir. Bu nedenle, mantar virülansını araştırmak için konakçının hem sağkalım hem de üreme yönlerini izleyen bir nematod modeli geliştirdik.

Özet

Patojenler insanlar için ölümcül olabilirken, birçoğu ölümcül olmayan fenotiplere sahip bir dizi enfeksiyon türüne neden olur. İnsanlarda fırsatçı bir mantar patojeni olan Candida albicans, ~%40 mortalite ile sonuçlanan hastane enfeksiyonlarının dördüncü en yaygın nedenidir. Bununla birlikte, diğer C. albicans enfeksiyonları daha az şiddetli ve nadiren ölümcüldür ve kadınların ~% 75'ini etkileyen vulvovajinal kandidiyazis ve ayrıca ağırlıklı olarak bebekleri, AIDS hastalarını ve kanser hastalarını etkileyen orofaringeal kandidiyazis içerir. Fare modelleri en sık C. albicans patogenezini incelemek için kullanılırken, bu modeller ağırlıklı olarak konak sağkalımını değerlendirir ve maliyetli, zaman alıcı ve replikasyonu sınırlıdır. Bu nedenle, C. albicans'ı incelemek için Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella ve Caenorhabditis elegans dahil olmak üzere çeşitli mini model sistemler geliştirilmiştir. Bu mini modeller, mutant kütüphaneleri veya C. albicans'ın çeşitli genetik geçmişlerini taramak için çok uygundur. Burada, C. elegans kullanarak C. albicans enfeksiyonunu incelemek için iki yaklaşım tanımlanmıştır. Birincisi, konak üremesini ölçen ve bireysel konakçıların hayatta kalmasını izleyen bir doğurganlık testidir. İkincisi, C. albicans enfeksiyonunun birden fazla nesil boyunca konakçı popülasyon artışını nasıl etkilediğini ölçen bir soy genişleme testidir. Birlikte, bu testler C. albicans virülansını hızlı bir şekilde değerlendirmek için basit ve uygun maliyetli bir yol sağlar.

Giriş

Candida albicans, ağız boşluğu, gastrointestinal ve ürogenital yollar dahil olmak üzere farklı nişlerde yaşayan insanların fırsatçı bir mantar patojenidir1. Tipik olarak kommensal olsa da, C. albicans hem mukozal hem de kan dolaşımı enfeksiyonlarına neden olur, ikincisi ölümcül olabilir. C. albicans enfeksiyonunun şiddeti, konak bağışıklık fonksiyonuna bağlıdır ve bağışıklığı baskılanmış bireyler sağlıklı bireylere göre enfeksiyona daha duyarlıdır1. Konakçı ile ilgili faktörlere ek olarak, C. albicans, hif, biyofilm oluşumu ve C. albicans'ın konak epitel hücrelerine2 yapışmasını ve istilasını teşvik etmek için işlev gören salgı aspartil proteinazların (SAP'ler) üretimini ve bir sitolitik peptit toksini olan kandidalizin 3,4. Birlikte, bu, C. albicans virülansının, patojen ve konakçı ortamı arasındaki etkileşimden kaynaklanan karmaşık bir fenotip olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, virülansın araştırılması en iyi, in vitro yaklaşımların aksine, konakçı ortamlar olarak hizmet veren model organizmalar kullanılarak incelenir.

Hem omurgalı hem de omurgasız organizmalar dahil olmak üzere çeşitli konak modelleri, C. albicans enfeksiyonunu incelemek için geliştirilmiştir. Altın standart olarak kabul edilen murin modeli, genellikle adaptif ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi ve hem sistemik hem de belirli organlarda hastalığın ilerlemesini izleme yeteneği için kullanılır5. Bununla birlikte, bu konak modelinde bakım maliyetleri, az sayıda yavru ve küçük numune boyutlarıyla ilişkili düşük güç ve tekrarlanabilirlik dahil olmak üzere önemli sınırlamalar vardır5. Bu nedenle, zebra balığı (Danio rerio), meyve sineği (Drosophila melanogaster), balmumu güvesi (Galleria mellonella) ve nematod (Caenorhabditis elegans) gibi daha basit model organizmalar geliştirilmiştir. Bu memeli olmayan model organizmalar daha küçüktür, daha az laboratuvar bakımı gerektirir ve daha büyük numune boyutları, fare modellerine kıyasla daha fazla güç ve tekrarlanabilirlik sağlar. Bu modellerin her birinin, bir enfeksiyon modeli seçerken göz önünde bulundurulması gereken belirli avantajları ve dezavantajları vardır. G. mellonella, 37 °C'de yetiştirilebildiği ve çeşitli fagositik hücrelere sahip olduğu için insanlara fizyolojik olarak en benzer ortamı sunar7. Ayrıca, bu model belirli bir inokulumun7 doğrudan enjeksiyonuna izin verir. Bununla birlikte, tam olarak dizilenmiş bir genom yoktur ve mutant suşlar oluşturmak için yerleşik bir yöntem yoktur. G. mellonella'ya benzer şekilde, D. rerio modeli belirli bir inokulumun doğrudan enjeksiyonuna izin verir 5,7. Aynı zamanda, bu memeli olmayan modele özgü olan hem adaptif hem de doğuştan gelen bağışıklık sistemine5 sahiptir, ancak bakımı için su yetiştirme tankları gerektirir. D. melanogaster ve C. elegans, manipüle edilmesi ve mutant suşlar7 üretmesi kolay ancak adaptif bağışıklığa veya sitokinlere sahip olmayan tam dizilenmiş genomları içeren benzer avantaj ve dezavantajlarasahiptir 7. Tüm bu memeli olmayan modellerden, C. elegans en hızlı yaşam döngüsüne sahiptir, çok sayıda genetik olarak özdeş yavru üretmek için kendi kendini döller ve büyük ölçekli ekranlara en uygun olanıdır 6,7,8. C. elegans, antifungal ilaçların9,10 yüksek verimli taraması, virülans faktörlerini7 karakterize etmek ve C. albicans'a özgü konak savunma ağlarını11 tanımlamak için son derece güçlü olmuştur. C. elegans'taki doğuştan gelen bağışıklık sistemi, insanlarla yüksek oranda korunan birden fazla bileşene sahiptir12. Konak doğuştan gelen savunmalar, antimikrobiyal peptitlerin13 (AMP'ler) ve reaktif oksijen türlerinin 14,15,16 üretimini içerir.

C. albicans enfeksiyonunun şiddeti ağırlıklı olarak konak sağkalımı ile ölçülür, ancak ölümcül olmayan virülans fenotiplerini yakalayamaz. Konak zindeliğinin sıklıkla gözden kaçan bir yönü üremedir, ancak birkaç çalışma C. albicans'ın sperm canlılığını azaltarak üremeyi etkilediğinigöstermektedir 17,18, bu da bunun konak uygunluğunun incelenmesi gereken önemli bir yönü olabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, C. albicans enfeksiyonunun konak doğurganlığı üzerindeki etkisi, ölümcül olmayan virülans fenotiplerini incelemek için yararlı bir yoldur. Sağlıklı konakçılarda hem sağkalım hem de üreme fenotiplerini araştırmak için C. elegans kullanarak iki enfeksiyon testi geliştirdik19,20. Burada hem doğurganlık hem de soy genişleme testlerini açıklıyoruz. Doğurganlık, hem üretilen dölleri hem de tek konakçıların hayatta kalmasını ölçer ve soy genişlemesi, üç konakçı nesil boyunca enfeksiyonun sonuçlarını değerlendirir. Bu tahlillerin, ölümcül ve ölümcül olmayan virülans fenotiplerindeki hem dramatik hem de ince farklılıkları yakalamak için C. albicans delesyon mutantlarını taramak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Deneyler için hazırlık aşamaları

  1. C. albicans ve Escherichia coli kültürlerinin hazırlanması
    NOT: Bu çalışmada kullanılan suşlar Tablo 1'de listelenmiştir.
    1. C. albicans ve E. coli suşlarını -80 ° C'de gliserol stokları olarak koruyun.
    2. Steril bir kürdan kullanarak, istenen C. albicans süzgüsünü katı maya pepton dekstroz (YPD) (%1 maya ekstresi, %2 baktopeton, %2 glikoz, %1.5 agar, %0.004 adenin, %0.008 üridin) üzerine süzün ve gece boyunca 30 °C'de büyütün.
      NOT: C. albicans suşu oksotrofik ise, ortamı gerekli amino asitlerle destekleyin.
    3. Steril bir halka veya kürdan kullanarak, tek bir C. albicans kolonisini 2 mL sıvı YPD'ye aşılayın. 30 °C'de 24 saat çalkalayarak inkübe edin.
    4. Steril bir kürdan kullanarak, E. coli'yi (OP50) Luria Suyu (LB; 10 g / L tripton, 5 g / L maya özütü, 10 g / L NaCl, 15 g / L agar) agar plakalarına sürün. Gece boyunca 30 °C'de inkübe edin.
    5. Tek bir OP50 kolonisini 50 mL LB içine aşılayın. Gece boyunca çalkalayarak 30 ° C'de inkübe edin.
  2. Nematod büyüme ortamı hazırlama
    1. 2 L'lik bir şişede, 1 L suya 29 g nematod büyüme ortamı tozu (NGM; 17.5 g / L agar, 3.0 g / L Sodyum Klorür, 2.5 g / L Pepton, .005 g / L kolesterol) ekleyin ve bir karıştırma çubuğu ile karıştırın.
    2. E. coli'nin aşırı büyümesini engellemek ve C. albicans proliferasyonuna izin vermek için, otoklavlamadan sonra NGM'yi 0.2 g / L streptomisin sülfat ile takviye edin.
      NOT: Nematod bakımı için NGM kullanılıyorsa, streptomisin gerekli değildir.
  3. Nematod popülasyonlarının korunması
    1. Gece boyunca 300 μL E. coli kültürünü metal bir yayıcı kullanarak hazırlanan NGM agar plakalarına yayın. Bu tekniğe tohumlama adı geçecektir.
    2. Plakaların oda sıcaklığında (RT) kurumasını bekleyin. Plakaları gece boyunca 30 °C'de büyütün.
    3. Her 3-4 günde bir E. coli ile yeni tohumlanmış bir NGM plakasına parçalayarak nematod popülasyonunu koruyun. 20 °C'de saklayın. Parçalama, rastgele bir nematod popülasyonunu yeni tohumlanmış bir plakaya hızlı bir şekilde aktarmak için kullanılan bir tekniktir, bu da popülasyonların çoğalmasına izin verir. Bunu yapmak için, NGM agar plakasından küçük bir kare (1 x 1 inç) kesmek için steril bir spatula kullanın. Kareyi, nematodların tarafı yeni agar8'e bakacak şekilde yeni bir tohumlanmış NGM plakasına dikkatlice aktarın.
      NOT: 20 ° C'de tutulan C. elegans , ~ 48 saat sonra yavrular üretecektir, bu da bir nematod popülasyonunu senkronize ederken dikkate alınması yararlıdır. 25 ° C'de tutulan C. elegans daha hızlı gelişecek ve çoğalacak ve 15 ° C'de tutulan popülasyonlar daha yavaş büyüyecektir.
  4. Nematod popülasyon senkronizasyonu
    1. NGM/OP50'de tutulan mevcut bir nematod popülasyonu ile başlayın.
    2. Nematodlar içeren NGM plakasına ~ 3 mL M9 tamponu pipetleyin. Nematodlu yumurtaları plakadan yıkayın ve agardaki yumurtaları sıyırmak için pipetin ucunu nazikçe kullanın (yapışma eğilimindedirler). Bir P1000 pipeti kullanarak, hem yumurta hem de solucan içeren sıvıyı 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hala tabakta bulunan yumurta sayısını değerlendirmek için, agar'a bakmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın.
    3. 279 x g ve RT'de 2 dakika konik santrifüjleyin.
    4. Nematod peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı çıkarın.
    5. 3 mL% 25 çamaşır suyu çözeltisi ekleyin (kullanım sırasında "DİKKAT").
    6. Tüpü 2 dakika ters çevirin. Diseksiyon mikroskobunu kullanarak nematodların öldüğünü kontrol edin - düz ve hareketsiz olacaklardır.
      NOT: Bu sadece mevcut nematodları öldürür. Yumurtaların bütünlüğü etkilenmeyecektir.
    7. 279 x g ve RT'de 2 dakika santrifüjleyin.
    8. Süpernatanı çıkarın ve peleti 3 mL M9'da yeniden süspanse edin.
    9. 279 x g ve RT'de 2 dakika santrifüjleyin.
    10. Süpernatanı çıkarın ve peleti 300 μL M9'da yeniden süspanse edin.
    11. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, 5 μL yumurtayı küçük bir Petri plakasına pipetleyerek yumurta konsantrasyonunu kontrol edin. İdeal konsantrasyon 20-100 yumurta arasında olmalıdır. Kültür çok seyreltik ise, çözeltiyi santrifüjleme ve fazla sıvının uzaklaştırılmasıyla konsantre edin. Kültür çok konsantre ise, istenen konsantrasyona ulaşılana kadar daha fazla M9 ekleyin.
  5. Nematod enfeksiyonu için C. albicans ve E. coli kültürlerini hazırlayın (tohumlama).
    1. Boş bir çözüm hazırlayın. Bir küvette 900 μL ddH2O ve 100 μL sıvı YPD'yi birleştirin.
    2. Küveti spektrofotometreye yerleştirin. Yukarı oku kullanarak dalga boyunu 600 nanometreye ayarlayın. Boş çözeltiyi ayarlamak için "0 ABS %100 T" düğmesine tıklayın.
    3. Yeni bir küvette, 900 μL ddH2O ve 100 μL gece boyunca maya kültürünü birleştirin. Boş çözeltiyi spektrofotometreden çıkarın ve maya çözeltisini içeren küveti ekleyin. Ekranda gösterilen optik yoğunluğu kaydedin (herhangi bir düğmeye basmayın). Okumayı 10 ile çarpın (ölçülen maya çözeltisi 10'da 1 seyreltme idi).
    4. 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde ddH2O ile kültürü 3.0 OD600 / mL'ye normalleştirin. 1 OD600 yaklaşık 3 x 10'dur.-7 CFU/mL21.
      NOT: OD600 okuması 6.7, 3 OD / 6.7 OD = 0.447 mL ise, mikrosantrifüj tüpüne 447 μL C. albicans kültürü ekleyin. 30 saniye boyunca maksimum hızda (16.873 x g) santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 1 mL ddH2O'da yeniden süspanse edin.
    5. Gece boyunca E. coli kültürünü 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
    6. Kültürü RT'de 2 dakika boyunca 279 x g'da santrifüjleyin.
    7. Süpernatantın çoğunluğunu aspire edin ve ~ 1 mL bırakın.
    8. Kalan süpernatanttaki peleti yeniden süspanse edin ve önceden tartılmış 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    9. Mikrosantrifüj tüpünü 30 saniye boyunca maksimum hızda döndürün.
    10. Bir p1000 pipeti kullanarak süpernatanı çıkarın ve son peleti tartın.
    11. E. coli'yi ddH2O'da 200 mg / mL'ye seyreltin.
    12. Ana karışım hesaplamalarını (Tablo 2) kullanın ve uygun şekilde ölçeklendirin.

2. Doğurganlık testi

NOT: Ek Tablo 1'de gösterilen temsili veriler ve Şekil 1A'da gösterilen şema.

  1. Aşağıdakileri edinin veya hazırlayın: 35 mm x 10 mm Petri plakaları, 0,2 g/L streptomisin sülfat ile desteklenmiş NGM, E. coli OP50 kültürü, LB, C. albicans kültürü, YPD, Tel Çekme, M9 tamponu (3,0 g/L KH2PO4, 6,0 g/L Na2HPO4, 0,5 g/L NaCl, 1,0 g/L NH4Cl), 15 mL konik tüpler.
    Deneyden iki gün önce
  2. C. albicans suşlarını 2 mL YPD ve E. coli'yi (OP50) 50 mL LB içinde aşılayın ve gece boyunca 30 ° C'de büyütün.
  3. 0,2 g/L streptomisin sülfat ile desteklenmiş NGM ile 35 mm x 10 mm Petri plakaları hazırlayın. Hazırlanan plaka sayısı tüm deney boyunca sürmelidir. Önerilen kopya sayısı tedavi başına 10'dur. 10 kopya için 70 plaka kullanılacaktır. 1 L NGM ~ 250 plaka yapacaktır.
    Deneyden Bir Gün Önce
  4. 35 mm x 10 mm NGM agar plakaları, yukarıda açıklanan tohumlama protokolüne göre 0, 2. ve 3. gün için streptomisin takviyesi ile mastermix konsantrasyonu ile tohumlayın (Tablo 2). Uygun miktarda mastermix'i plakanın ortasına pipetleyin. Kültürün yayılması gerekli değildir, çünkü konukçu beslenmesi için tek bir mikrobiyal büyüme noktası yeterlidir ve tohum dışındaki konukçuları kolayca tanımlamamızı sağlar. Plakaları gece boyunca RT'de inkübe edin.
    NOT: Gün 0 mastermix, her deneysel tedavi için kopya başına 50 μL "tohum" içerir. 2-7. günler, her deneysel tedavi için kopya başına 10 μL "tohum" içerir. 1. Gün plakası yoktur çünkü nematodlar bir Gün 0 plakasına senkronize edildikten 48 saat sonra L4 aşamasına ulaşacaktır. L4'e ulaştıklarında, tek tek nematodlar 2. gün plakalarına aktarılacaktır.
1 çoğaltma içinE. coli (OP50) kontrol koşuluC. albicans & E. coli (OP50) tedavi durumu
OP50 SerisiH2OToplamOP50 SerisiC. albicansH2OToplam
Gün 06.25 ul43.75 ul50 ul6.25 ul1.25 ul42.5 ul50 ul
2-7. Günler1.25 ul8.75 ul10 ul1.25 ul.25 ul8.5 ul10 ul

Tablo 2: Doğurganlık testi için nematodları enfekte etmek için gereken E. coli ve C. albicans kültürlerinin mastermix hacimleri.

Deney Günü (Gün 0)

  1. Nematodları ve plaka ~ 50 yumurtayı, kontrol plakalarının (yalnızca OP50) ve tedavi plakalarının (C. albicans + OP50) her Gün 0 kopyasına senkronize edin. 20 °C'de 48 saat inkübe edin.
    2. Gün
  2. Tek bir L4 nematodunu, Gün 0 plakasından8 toplayarak, kopya Gün 2 tohumlanmış plakaların her birine aktarın. L4 konakçıları, vücutlarının dorsal tarafının ortasındaki küçük bir cep ile tanımlanabilir22. Yumurtadan çıkan ve olgunlaştırılan nematodları aynı tip tohumlanmış plakadan aktarın (yani, D0 kontrol plakalarından L4 nematodları 2. gün kontrol plakalarına aktarılmalıdır).
  3. İhtiyaç duyulan C. albicans kültürlerini 2 mL YPD ve E. coli'yi (OP50 suşu) 50 mL LB'de aşılayın.
    3. Gün
  4. Nematodları 2. gün plakalarından 3. gün tohumlanmış plakalara aktarın, her bir kopyayı takip edin (yani, 2. günden itibaren Replike A, Replicate A Day 3 plakasına taşınmalıdır).
  5. 2. Gün (sadece yumurta içeren) ve 3. Gün (tek yetişkin içeren) plakalarını 20 ° C'de 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
  6. Tohum 35 mm x 10 mm NGM, plaka başına 10 μL mastermix kullanılarak 4. ve 5. günler için streptomisin plakaları ile desteklenmiştir (Tablo 2) ve plakaları RT'de 24 saat inkübe edin.
    4. Gün
  7. Nematodları 3. gün plakalarından 4. gün tohumlanmış plakalara aktarın.
  8. 3. ve 4. gün plakalarını 20 °C'de 24 saat inkübe edin.
  9. Bir diseksiyon dürbünü kullanarak, her Gün 2 plakası için uygun dölleri sayın. Ölen veya artık plakada olmayan (sansürlü) kopyaları not edin. Döl sayısı kaydedildikten sonra, 2. gün plakalarını atın.
    NOT: Sansürlü, plaka üzerinde kaybolan nematodları ifade eder. Bu, nematodlar plakadan süründüğünde ortaya çıkabilir. 24 saatlik pencerede daha az yaygın olmasına rağmen, ölü nematodların leşleri agarda parçalanır ve bu da sansüre neden olur. Sansürlenmiş veriler, nihai döl ve hayatta kalma veri analizine dahil edilmez.
  10. C . albicans suşlarının yeni kültürlerini 2 mL YPD'de ve E. coli'yi (OP50) 50 mL LB'de aşılayın.
    5. Gün
  11. Nematodları 4. gün plakalarından 5. gün tohumlanmış plakalara aktarın.
  12. Gün 4 ve Gün 5 plakalarını 20 °C'de 24 saat inkübe edin.
  13. Her Gün 3 plakası için uygun dölleri sayın. Ölen veya artık plakada olmayan (sansürlü) kopyaları not edin. Döl sayısı kaydedildikten sonra, 3. gün plakalarını atın.
  14. Tohum 35 mm x 10 mm NGM, 6. ve 7. günler için streptomisin plakaları ile desteklenmiş, plaka başına 10 μL mastermix kullanılarak (Tablo 2) ve plakaları 24 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    6. Gün
  15. Nematodları 5. gün plakalarından 6. gün tohumlanmış plakalara aktarın.
  16. 5. ve 6. gün plakalarını 20 °C'de 24 saat inkübe edin.
  17. Her Gün 4 plakası için canlı dölleri sayın. Ölen veya artık plakada olmayan (sansürlü) kopyaları not edin. Döl sayısı kaydedildikten sonra, 4. gün plakalarını atın.
    7. Gün
  18. Nematodları 6. gün plakalarından 7. gün tohumlanmış plakalara aktarın.
  19. 6. ve 7. gün plakalarını 20 ° C'de 24 saat inkübe edin.
  20. Her Gün 5 plakası için uygun dölleri sayın. Ölen veya artık plakada olmayan (sansürlü) kopyaları not edin. Döl sayısı kaydedildikten sonra, 5. gün plakalarını atın.
    8. Gün
  21. Her Gün 6 plakası için canlı dölleri sayın. Ölen veya artık plakada olmayan (sansürlü) kopyaları not edin. Döl sayısı kaydedildikten sonra, 6. gün plakalarını atın.
    9. Gün
  22. Her Gün 7 plakası için uygun dölleri sayın. En büyük nematodu (ebeveyn) saymayın. Ölen veya artık plakada olmayan (sansürlü) kopyaları not edin. Döl sayısı kaydedildikten sonra, 7. gün plakalarını atın.
    NOT: Bu test, sağkalımı değerlendirmek için de kullanılabilir. Her nematodun ne zaman öldüğünü kaydedin. Deneyin sonunda, yedi günlük deney boyunca hayatta kalan nematodların yüzdesi her tedavi için karşılaştırılabilir. Nematodlar bazen gıda/patojen kaynağından uzaklaşır ve Petri plakasının slaytlarına tırmanmaya çalışır. Devam etmeden önce plakanın tüm alanlarını kontrol edin. Ölü nematodlar genellikle bir leşi geride bırakır. Yeri tespit edilemeyen herhangi bir nematodu sansürleyin ve o nematodu ölü olarak saymayın. Sansürlenmiş verileri soy ve hayatta kalmanın son analizine dahil etmeyin.
  23. Veri setlerinin normalliğine bağlı olarak tek yönlü ANOVA veya Kruskal-Wallis kullanarak kuluçka boyutu ve geç üreme verilerini analiz edin ve ayrıca GraphPad Prism yazılımını kullanarak tedavi grupları arasındaki önemli farklılıkları belirlemek için post-hoc Tukey/Dunn'ın çoklu testini kullanın. Wilcoxon log-rank testini kullanarak hayatta kalma eğrileri arasındaki farkları tespit edin.

3. Soy Genişleme Testi

NOT: Ek Tablo 2'de gösterilen temsili veriler ve Şekil 2A'da bir şema gösterilmiştir.

  1. Aşağıdakileri elde edin veya hazırlayın: 0,2 g/L streptomisin sülfat, E. coli OP50 kültürleri, LB, C. albicans kültürleri, YPD, M9 tamponu, Tel Çekme, 15 mL konik tüpler ile desteklenmiş NGM agar içeren 100 mm x 15 mm Petri plakaları.
    Gün -2
  2. C. albicans suşlarını 2 mL YPD ve E. coli'yi (OP50) 50 mL LB içinde aşılayın ve gece boyunca 30 ° C'de büyütün.
    Gün -1
  3. Tohum 100 mm x 15 mm NGM agar plakaları, plaka başına 300 μL mastermix ile streptomisin ile desteklenmiştir (Tablo 3). Mastermix'i steril bir metal yayıcı kullanarak plakaya yayın. Plakaları gece boyunca 30 °C'de inkübe edin. Tedavi başına altı kopya önerilir. Bu nedenle, tedavi başına yedi plaka (senkronize nematodlar için bir plaka, her yetişkin nematod için altı plaka) hazırlayın.
E. coli (OP50) kontrol koşuluC. albicans ve E. coli (OP50). Tedavi durumu
1 çoğaltma içinOP50 SerisiH2OToplamOP50 SerisiC. albicansH2OToplam
1.25 ul8.75 ul10 ul37.5 ul7.5 ul255 ul300 ul

Tablo 3: Soy genişleme testi için nematodları enfekte etmek için gereken E. coli ve C. albicans kültürlerinin mastermix hacimleri.

Nematod popülasyon artışı: Gün 0

  1. Nematodları senkronize edin ve her kontrol (yalnızca OP50) ve tedavi (C. albicans + OP50) için tek bir plaka üzerinde 10-25 yumurtayı yerleştirin ve 20 ° C'de 48 saat inkübe edin.
    2. Gün:
  2. Her kontrol ve tedavi 0 Gün plakasından tek bir L4 solucanını aynı tedavinin tohumlanmış plakalarına aktarın. L4 konakçıları, vücutlarının dorsal tarafının ortasındaki küçük bir cep ile tanımlanabilir22.
  3. 20 °C'de 5 gün inkübe edin (senkronizasyonu takiben toplam bir hafta).
    7. Gün:
  4. Bir p1000 pipeti kullanarak, 5 mL M9 tamponu kullanarak her plakadan tüm nematod popülasyonunu yıkayın ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
  5. Nematodların daha kolay sayılması için çökelmesini sağlamak için 4 °C'de 1 saat saklayın.
  6. Her bir koniği M9 tamponu ile 10 mL'lik son hacme kadar seyreltin.
  7. Her biyolojik kopya için, 20 μL'lik bir alikottaki nematod sayısını sayın. Her biyolojik kopya için 6 teknik kopya elde etmek için bunu tekrarlayın. Toplam popülasyon büyüklüğünü belirlemek için geri hesaplayın. Numuneler çok seyreltikse (yani, numune başına 10 nematoddan az), popülasyonu daha küçük bir hacimde M9 tamponunda konsantre edin.
    NOT: Canlı nematodların santrifüjlenmesi nematodlara zarar vermez.
    Örnek hesaplama:
    70 Ana Bilgisayar = X (Toplam ana bilgisayar)
    20 μL (alikot) 10.000μL (Toplam Hacim)
  8. Veri setlerinin normalliğine bağlı olarak tek yönlü ANOVA veya Kruskal-Wallis kullanarak soy genişlemesi için verileri analiz edin ve ayrıca GraphPad Prism yazılımını kullanarak tedavi grupları arasındaki önemli farklılıkları belirlemek için post-hoc Tukey/Dunn'ın çoklu testini kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Burada, C. elegans'ı bir enfeksiyon modeli olarak kullanarak ölümcül olmayan bir fenotip olarak C . albicans virülansını ölçen iki test sunuyoruz. İlk tahlil olan doğurganlık, C. albicans enfeksiyonunun döl üretimi ve sağkalımı için tek konakçıları nasıl etkilediğini izler. İkinci tahlil olan soy genişlemesi, C. albicans enfeksiyonunun birden fazla nesil boyunca nüfus artışını nas?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, mantar virülansını ölçen iki basit test sunuyoruz. Her iki test de C. elegans'ı hem ölümcül hem de ölümcül olmayan konak fenotiplerinin izlenmesini içeren bir konak sistemi olarak kullanır. Örneğin, doğurganlık tahlilleri, bireysel enfekte konakçıların üreme başarısını araştırırken aynı zamanda bireysel sağkalımı da ölçer. Günlük izleme sadece toplam kuluçka boyutunu değil, aynı zamanda üreme zamanlamasını ve ölüm zamanını d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmek için rekabet eden çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Tahlillerimizi ve veri toplamamızı geliştirmedeki yardımları için Dorian Feistel, Rema Elmostafa ve McKenna Penley'e teşekkür ederiz. Bu araştırma NSF DEB-1943415 (MAH) tarafından desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL eppendorf microtubes 3810XMillipore SigmaZ606340
100 mm x 15 mm petri platesSigma-AldrichP5856-500EA
15 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-959-70C
50 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-432-22
AdenineMillipore SigmaA8626
Agar (granulated, bacterilogical grade)Apex BioResearch Produces20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)Genesee Scientific59-1M32P
Ammonium ChlorideMillipore Sigma254134
Bacterial Cell SpreaderSP Scienceware21TP50
BactoPeptoneFisher BioReagantsBP1420-500
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)FIsherBrand14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)Nikon Instrument Inc.
E. coliCaenorhabditis Genetics CenterOP50
GlucoseMillipore Sigma50-99-7
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)Falcon353001
Metal SpatulaSP Scienceware8TL24
Nematode Growth Media (NGM)Dot ScientificDSN81800-500
Potassium Phosphate monobasicSigmaP0662-500G
Sodium ChlorideFisher ScientificBP358-1
Sodium PhosphateFisher ScientificBP332-500
Streptomycin SulfateThermo-Fisher Scientific11860038
TryptoneMillipore Sigma91079-40-2
UridineMillipore SigmaU3750
Wildtype C. elegansCaenorhabditis Genetics CenterN2
Yeast ExtractMillipore Sigma8013-01-2

Referanslar

  1. Underhill, D. M., Iliev, I. D. The mycobiota: interactions between commensal fungi and the host immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (6), (2014).
  2. Ibrahim, A. S., Filler, S. G., Sanglard, D., Edwards, J. E., Hube, B. Secreted Aspartyl Proteinases and Interactions of Candida albicans with Human Endothelial Cells. Infection and Immunity. 66 (6), 3003-3005 (1998).
  3. Calderone, R. A., Fonzi, W. A. Virulence factors of Candida albicans. Trends in Microbiology. 9 (7), 327-335 (2001).
  4. Mayer, F. L., Wilson, D., Hube, B. Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence. 4 (2), 119-128 (2013).
  5. Chin, V., Lee, T., Rusliza, B., Chong, P. Dissecting Candida albicans Infection from the Perspective of C. albicans Virulence and Omics Approaches on Host-Pathogen Interaction: A Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (10), 1643(2016).
  6. Elkabti, A., Issi, L., Rao, R. Caenorhabditis elegans as a Model Host to Monitor the Candida Infection Processes. Journal of Fungi. 4 (4), 123(2018).
  7. Arvanitis, M., Glavis-Bloom, J., Mylonakis, E. Invertebrate models of fungal infection. Biochimica et biophysica acta. 1832 (9), 1378-1383 (2013).
  8. Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. Journal of Visualized Experiments. (128), e56487(2017).
  9. Breger, J., et al. Antifungal Chemical Compounds Identified Using a C. elegans Pathogenicity Assay. PLoS Pathogens. 3 (2), 18(2007).
  10. Okoli, I., et al. Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay. PloS one. 4 (9), 7025(2009).
  11. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans Infection of Caenorhabditis elegans Induces Antifungal Immune Defenses. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002074(2011).
  12. Kim, D. H., Ausubel, F. M. Evolutionary perspectives on innate immunity from the study of Caenorhabditis elegans. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 4-10 (2005).
  13. Kim, D. H., et al. A Conserved p38 MAP Kinase Pathway in Caenorhabditis elegans Innate Immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  14. van der Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generated Reactive Oxygen Species Trigger Protective SKN-1 Activity via p38 MAPK Signaling during Infection in C. elegans. PLoS Pathogens. 7 (12), 1002453(2011).
  15. van der Hoeven, R., Cruz, M. R., Chávez, V., Garsin, D. A. Localization of the Dual Oxidase BLI-3 and Characterization of Its NADPH Oxidase Domain during Infection of Caenorhabditis elegans. PLOS ONE. 10 (4), 0124091(2015).
  16. Chávez, V., Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generates Reactive Oxygen Species as a Protective Innate Immune Mechanism in Caenorhabditis elegans. Infection and Immunity. 77 (11), 4983-4989 (2009).
  17. Vander, H., Prabha, V. Evaluation of fertility outcome as a consequence of intravaginal inoculation with sperm-impairing micro-organisms in a mouse model. Journal of Medical Microbiology. 64, Pt_4 344-347 (2015).
  18. Castrillón-Duque, E. X., Suárez, J. P., Maya, W. D. C. Yeast and Fertility: Effects of In Vitro Activity of Candida spp. on Sperm Quality. Journal of Reproduction & Infertility. 19 (1), 49-55 (2018).
  19. Feistel, D. J., et al. A Novel Virulence Phenotype Rapidly Assesses Candida Fungal Pathogenesis in Healthy and Immunocompromised Caenorhabditis elegans Hosts. mSphere. 4 (2), (2019).
  20. Feistel, D. J., Elmostafa, R., Hickman, M. A. Virulence phenotypes result from interactions between pathogen ploidy and genetic background. Ecology and Evolution. 10 (17), 9326-9338 (2020).
  21. Mitchell, B. M., Wu, T. G., Jackson, B. E., Wilhelmus, K. R. Candida albicans Strain-Dependent Virulence and Rim13p-Mediated Filamentation in Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (2), 774-780 (2007).
  22. Altun, Z. F., Hall, D. H. WormAtas Hermaphrodite Handbook - Introduction. WormAtlas. , (2006).
  23. Yuan, X., Mitchell, B. M., Hua, X., Davis, D. A., Wilhelmus, K. R. The RIM101 Signal Transduction Pathway Regulates Candida albicans Virulence during Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (9), 4668-4676 (2010).
  24. Davis, D., Edwards, J. E., Mitchell, A. P., Ibrahim, A. S. Candida albicans RIM101 pH Response Pathway Is Required for Host-Pathogen Interactions. Infection and Immunity. 68 (10), 5953-5959 (2000).
  25. Chamilos, G., et al. Candida albicans Cas5, a Regulator of Cell Wall Integrity, Is Required for Virulence in Murine and Toll Mutant Fly Models. The Journal of Infectious Diseases. 200 (1), 152-157 (2009).
  26. Bruno, V. M., et al. Control of the C. albicans Cell Wall Damage Response by Transcriptional Regulator Cas5. PLoS Pathogens. 2 (3), 21(2006).
  27. Davis, D. Adaptation to environmental pH in Candida albicans and its relation to pathogenesis. Current Genetics. 44 (1), 58(2003).
  28. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A Pathogenesis Assay Using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans Reveals Novel Roles for Yeast AP-1, Yap1, and Host Dual Oxidase BLI-3 in Fungal Pathogenesis. Eukaryotic Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
  29. De, A., Sahu, A. K., Singh, V. Bite size of Caenorhabditis elegans regulates feeding, satiety and development on yeast diet. bioRxiv. , 473256(2018).
  30. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24 (1), 3-9 (2012).
  31. Smith, A. C., Hickman, M. A. Host-Induced Genome Instability Rapidly Generates Phenotypic Variation across Candida albicans Strains and Ploidy States. mSphere. 5 (3), 00433(2020).
  32. Palominos, M. F., Calixto, A. Quantification of Bacteria Residing in Caenorhabditis elegans Intestine. BIO-PROTOCOL. 10 (9), (2020).
  33. Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a Model Organism for Investigating Immunity. Applied and Environmental Microbiology. 78 (7), 2075-2081 (2012).
  34. Liberati, N. T., et al. Requirement for a conserved Toll/interleukin-1 resistance domain protein in the Caenorhabditis elegans immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6593-6598 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

C Albicansld r c Olmayan Vir lansEnfeksiyon DeneyleriCaenorhabditis ElegansDo urganl k DeneyiSoy Geni leme DeneyiKandida EnfeksiyonlarF rsat PatojenHastane EnfeksiyonlarVulvovajinal KandidiyazisOrofaringeal KandidiyazisMini Model SistemlerKonak Pop lasyon ArtGenetik Arka Plan

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır