JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פתוגנים אופורטוניסטיים פטרייתיים יכולים לגרום לזיהומים מסכני חיים כמו גם לזיהומים קלים, אך לעתים קרובות מתעלמים מפנוטיפים לא קטלניים בעת חקר אלימות. לכן, פיתחנו מודל נמטודות המנטר הן את היבטי ההישרדות והן את היבטי הרבייה של המארח כדי לחקור אלימות פטרייתית.

Abstract

בעוד שפתוגנים יכולים להיות קטלניים לבני אדם, רבים מהם גורמים למגוון סוגי זיהום עם פנוטיפים לא קטלניים. קנדידה אלביקנס, פתוגן פטרייתי אופורטוניסטי של בני אדם, הוא הגורם הרביעי בשכיחותו לזיהומים נוסוקומיאליים המביאים לתמותה של ~40%. עם זאת, זיהומים אחרים של C. albicans הם פחות חמורים ולעתים רחוקות קטלניים וכוללים קנדידה וולווגינלית, המשפיעה על ~75% מהנשים, כמו גם קנדידה אורו-לועית, המשפיעה בעיקר על תינוקות, חולי איידס וחולי סרטן. בעוד שמודלים של עכברים משמשים לרוב לחקר פתוגנזה של C. albicans , מודלים אלה מעריכים בעיקר את הישרדות המארח והם יקרים, גוזלים זמן ומוגבלים בשכפול. לכן, פותחו מספר מערכות מיני-מודל, כולל Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella ו-Caenorhabditis elegans, כדי לחקור את C. albicans. מיני-מודלים אלה מתאימים היטב לסינון ספריות מוטנטיות או רקע גנטי מגוון של C. albicans. כאן אנו מתארים שתי גישות לחקר זיהום C. albicans באמצעות C. elegans. הראשון הוא בדיקת פוריות המודדת את רביית המארח ומנטרת את ההישרדות של פונדקאים בודדים. השני הוא בדיקת הרחבת שושלת המודדת כיצד זיהום C. albicans משפיע על גידול אוכלוסיית המארח לאורך מספר דורות. יחד, בדיקות אלה מספקות דרך פשוטה וחסכונית להעריך במהירות את האלימות של C. albicans .

Introduction

קנדידה אלביקנס היא פתוגן פטרייתי אופורטוניסטי של בני אדם המתגוררים בנישות שונות, כולל חלל הפה, מערכת העיכול ודרכי השתן1. בעוד שבדרך כלל קומנסליים, C. albicans גורם הן לזיהומים ברירית והן לזיהומים בזרם הדם, שהאחרון שבהם עלול להיות קטלני. חומרת הזיהום של C. albicans תלויה בתפקוד החיסוני של המארח, כאשר אנשים מדוכאי חיסון רגישים יותר לזיהום מאשר אנשים בריאים1. בנוסף לגורמים הקשורים למארח, ל-C. albicans יש מספר תכונות אלימות הכוללות קורים, היווצרות ביופילם וייצור של פרוטאינאזות אספרטיל מפרישות (SAPs), המתפקדות לקידום הידבקות ופלישה של C. albicans לתאי אפיתל מארח2, וקנדידליסין, רעלן פפטיד ציטוליטי 3,4. יחד, זה מצביע על כך שאלימות C. albicans היא פנוטיפ מורכב הנובע מאינטראקציה בין הפתוגן לסביבה המארחת שלו. לכן, חקירת אלימות נחקרת בצורה הטובה ביותר באמצעות אורגניזמים מודלים המשמשים כסביבות מארח, בניגוד לגישות במבחנה.

מספר מודלים מארחים, כולל אורגניזמים בעלי חוליות וחסרי חוליות, פותחו כדי לחקור זיהום של C. albicans. מודל העכברים, הנחשב לסטנדרט הזהב, משמש לעתים קרובות בשל מערכת החיסון הנרכשת והמולדת שלו, ויכולתו לנטר את התקדמות המחלה הן באופן מערכתי והןבאיברים ספציפיים. עם זאת, ישנן מגבלות משמעותיות למודל מארח זה, כולל עלויות תחזוקה, מספר קטן של צאצאים וירידה בהספק וביכולת השחזור הקשורים לגדלים קטניםשל מדגם 5. לכן, פותחו אורגניזמים מודלים אחרים, פשוטים יותר, כגון דג הזברה (Danio rerio), זבוב הפירות (Drosophila melanogaster), עש השעווה (Galleria mellonella) ונמטודה (Caenorhabditis elegans). אורגניזמים אלה שאינם יונקים קטנים יותר, דורשים פחות תחזוקת מעבדה וגדלי מדגם גדולים יותר מאפשרים כוח ושחזור גדולים יותר בהשוואה למודלים של עכברים. לכל אחד מהדגמים הללו יתרונות וחסרונות ספציפיים שיש לקחת בחשבון בבחירת מודל זיהום. G. mellonella מציע את הסביבה הדומה ביותר מבחינה פיזיולוגית לבני אדם מכיוון שניתן לגדל אותו ב-37 מעלות צלזיוס ויש לו תאים פגוציטים שונים7. יתר על כן, מודל זה מאפשר הזרקה ישירה של חיסון ספציפי7. עם זאת, אין גנום מרוצף במלואו, ואין שיטה מבוססת ליצירת זנים מוטנטיים. בדומה ל-G. mellonella, מודל D. rerio מאפשר הזרקה ישירה של חיסון ספציפי 5,7. יש לו גם מערכת חיסון נרכשת ומולדת5, שהיא ייחודית למודל הלא-יונקים הזה, אך דורשת מיכלי רבייה ימיים כדי לתחזק. ל-D. melanogaster ו-C. elegans יש יתרונות וחסרונות דומים, הכוללים גנומים מרוצפים במלואם שקל לתמרן וליצור זנים מוטנטיים7 אך אין להם חסינות אדפטיבית או ציטוקינים7. מבין כל המודלים הלא-יונקים הללו, ל-C. elegans יש את מחזור החיים המהיר ביותר, הוא מפרה את עצמו כדי לייצר מספר גדול של צאצאים זהים גנטית, והם המתאימים ביותר למסכים בקנה מידה גדול 6,7,8. C. elegans היה חזק ביותר להקרנה בתפוקה גבוהה של תרופות אנטי פטרייתיות 9,10, אפיון גורמי אלימות7 וזיהוי רשתות הגנה מארח ספציפיות ל- C. albicans 11. למערכת החיסון המולדת ב-C. elegans יש מרכיבים מרובים שנשמרו מאוד בבני אדם12. ההגנות המולדות של המארח כוללות ייצור של פפטידים אנטי-מיקרוביאליים13 (AMPs) ומיני חמצן תגובתיים 14,15,16.

חומרת הזיהום של C. albicans נמדדת בעיקר על ידי הישרדות הפונדקאי, אך אינה יכולה ללכוד פנוטיפים של אלימות לא קטלנית. היבט שלעתים קרובות מתעלמים ממנו בכושר המארח הוא רבייה, אך מספר מחקרים מצביעים על כך ש- C. albicans משפיע על הרבייה על ידי הפחתת כדאיות הזרע17,18, מה שמרמז על כך שזה עשוי להיות היבט חשוב של כשירות המארח למחקר. לכן, ההשפעה של זיהום C. albicans על פוריות המארח היא דרך שימושית לחקור פנוטיפים של אלימות לא קטלנית. פיתחנו שתי בדיקות זיהום באמצעות C. elegans כדי לחקור הן פנוטיפים של הישרדות והן רבייה במארחים בריאים19,20. כאן אנו מתארים הן את מבחני הפוריות והן את מבחני הרחבת השושלת. פוריות מודדת הן את הצאצאים המיוצרים והן את ההישרדות של פונדקאים בודדים, והרחבת השושלת מעריכה את ההשלכות של זיהום על פני שלושה דורות מארחים. אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש במבחנים אלה כדי לסנן מוטציות של מחיקת C. albicans כדי ללכוד הבדלים דרמטיים ועדינים בפנוטיפים של אלימות קטלנית ולא קטלנית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. שלבי הכנה לניסויים

  1. הכנת תרביות C. albicans ו-Escherichia coli
    הערה: הזנים ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלה 1.
    1. שמור על זני C. albicans ו-E. coli כאשר מלאי הגליצרול נמצא ב-80 מעלות צלזיוס.
    2. בעזרת קיסם סטרילי, פס את הזן הרצוי של C. albicans על פפטון דקסטרוז שמרים מוצק (YPD) (1% תמצית שמרים, 2% בקטופפטון, 2% גלוקוז, 1.5% אגר, 0.004% אדנין, 0.008% אורידין) וגדל בן לילה ב-30 מעלות צלזיוס.
      הערה: אם הזן C. albicans הוא אוקסוטרופי, יש להשלים את המדיה עם חומצות האמינו הדרושות.
    3. בעזרת לולאה סטרילית או קיסם, חסנו מושבה אחת של C. albicans ל-2 מ"ל של YPD נוזלי. יש לדגור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך 24 שעות.
    4. בעזרת קיסם סטרילי, פס E. coli (OP50) על צלחות אגר מרק לוריא (LB; 10 גרם/ליטר טריפטון, 5 גרם/ליטר תמצית שמרים, 10 גרם/ליטר NaCl, 15 גרם/ליטר אגר). יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
    5. יש לחסן מושבת OP50 בודדת ל-50 מ"ל של LB. לדגור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך הלילה.
  2. הכנת מצעי גידול נמטודות
    1. בבקבוק של 2 ליטר, יש להוסיף 29 גרם של אבקת מצע גידול נמטודות (NGM; 17.5 גרם/ליטר אגר, 3.0 גרם/ליטר נתרן כלורי, 2.5 גרם/ליטר פפטון, 0.005 גרם/ליטר כולסטרול) ל-1 ליטר מים ולערבב עם מוט ערבוב.
    2. כדי לעכב צמיחת יתר של E. coli ולאפשר התפשטות של C. albicans יש להוסיף NGM עם 0.2 גרם/ליטר סטרפטומיצין סולפט לאחר חיטוי.
      הערה: אם משתמשים ב-NGM לתחזוקת נמטודות, אין צורך בסטרפטומיצין.
  3. שמירה על אוכלוסיות נמטודות
    1. מורחים 300 מיקרוליטר של תרבית אי קולי למשך הלילה על צלחות אגר NGM מוכנות באמצעות מפזר מתכת. טכניקה זו תיקרא זריעה.
    2. הניחו לצלחות להתייבש בטמפרטורת החדר (RT). גדלו צלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
    3. שמרו על אוכלוסיית הנמטודות על ידי קיבוץ כל 3-4 ימים על צלחת NGM חדשה עם E. coli. יש לאחסן בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. קיבוץ הוא טכניקה המשמשת להעברה מהירה של אוכלוסייה אקראית של נמטודות לצלחת שזה עתה נזרעה, המאפשרת לאוכלוסיות להתרבות. לשם כך, השתמש במרית סטרילית כדי לחתוך ריבוע קטן (1 x 1 אינץ ') מצלחת האגר של NGM. העבירו בזהירות את הריבוע לצלחת NGM חדשה עם זרעים כשהצד עם הנמטודות פונה כלפי מטה על האגר8 החדש.
      הערה: C. elegans הנשמר ב-20 מעלות צלזיוס ייצר צאצאים ~ 48 שעות מאוחר יותר, וזה שימושי לקחת בחשבון בעת סנכרון אוכלוסיית נמטודות. C. elegans הנשמרים ב-25 מעלות צלזיוס יתפתחו ויתרבו מהר יותר ואוכלוסיות שנשמרות ב-15 מעלות צלזיוס יהיו בעלות צמיחה איטית יותר.
  4. סנכרון אוכלוסיית נמטודות
    1. נתחיל עם אוכלוסיית נמטודות קיימת שנשמרה על NGM/OP50.
    2. פיפטה ~ 3 מ"ל של מאגר M9 על צלחת ה-NGM המכילה נמטודות. שוטפים ביצי נמטודות מהצלחת ומשתמשים בעדינות בקצה הפיפטה כדי לגרד ביצים מהאגר (הן נוטות להידבק). בעזרת פיפטה P1000, העבירו את הנוזל המכיל גם ביצים וגם תולעים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. כדי להעריך את מספר הביצים שעדיין על הצלחת, השתמשו במיקרוסקופ מנתח כדי להסתכל על האגר.
    3. צנטריפוגה חרוטית למשך 2 דקות ב-279 x גרם ו-RT.
    4. הסר את הסופרנטנט, היזהר לא להפריע לכדור הנמטודה.
    5. הוסף 3 מ"ל של תמיסת אקונומיקה 25% ("זהירות" בעת הטיפול).
    6. יש להפוך את השפופרת למשך 2 דקות. בדוק שהנמטודות מתות באמצעות מיקרוסקופ הניתוח - הן יהיו ישרות ולא תנועתיות.
      הערה: זה יהרוג רק את הנמטודות הקיימות. שלמות הביצים לא תושפע.
    7. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב-279 x גרם ו-RT.
    8. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-3 מ"ל M9.
    9. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב-279 x גרם ו-RT.
    10. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-300 מיקרוליטר של M9.
    11. בעזרת מיקרוסקופ מנתח, בדקו את ריכוז הביצים על ידי פיפטינג של 5 מיקרוליטר ביצים על צלחת פטרי קטנה. הריכוז האידיאלי צריך להיות בין 20-100 ביצים. אם התרבות מדוללת מדי, יש לרכז את התמיסה על ידי צנטריפוגה והסרת עודפי נוזלים. אם התרבית מרוכזת מדי, מוסיפים עוד M9 עד להגעה לריכוז הרצוי.
  5. הכן תרביות C. albicans ו - E. coli לזיהום נמטודות (זריעה).
    1. הכן פיתרון ריק. בקובטה, שלב 900 מיקרוליטר של ddH2O ו-100 מיקרוליטר של YPD נוזלי.
    2. הכנס את הקובט לספקטרופוטומטר. הגדר את אורך הגל ל-600 ננומטר באמצעות החץ למעלה. לחץ על הכפתור "0 ABS 100% T" כדי להגדיר את הפתרון הריק.
    3. בקובט חדש, שלבו 900 מיקרוליטר של ddH2O ו-100 מיקרוליטר של תרבית שמרים לילה. הוציאו את התמיסה הריקה מהספקטרופוטומטר והוסיפו את הקובט המכיל את תמיסת השמרים. הקלט את הצפיפות האופטית המוצגת על המסך (אל תלחץ על כפתורים כלשהם). הכפילו את הקריאה ב-10 (תמיסת השמרים שנמדדה הייתה דילול של 1 ל-10).
    4. נרמל תרבית ל-3.0 OD600/mL עם ddH2O בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. 1 OD600 הוא בערך 3 x 10-7 CFU/mL21.
      הערה: אם קריאת OD600 היא 6.7, 3 OD/6.7 OD= 0.447 מ"ל, הוסף 447 מיקרוליטר של תרבית C. albicans לצינור המיקרו-צנטריפוגה. צנטריפוגה במהירות מרבית (16, 873 x גרם) למשך 30 שניות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש ב-1 מ"ל של ddH2O.
    5. העבירו את תרבית האי קולי הלילה לצינור חרוטי של 50 מ"ל.
    6. צנטריפוגה את התרבית ב 279 x גרם למשך 2 דקות ב- RT.
    7. שאפו את רוב הסופרנטנט, והשאירו ~1 מ"ל.
    8. השעו מחדש את הגלולה בסופרנטנט שנותר והעבירו לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל שנשקל מראש.
    9. סובב את צינור המיקרו-צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 30 שניות.
    10. בעזרת פיפטה p1000 מסירים את הסופרנטנט ושוקלים את הגלולה הסופית.
    11. לדלל E. coli ל-200 מ"ג/מ"ל ב-ddH2O.
    12. השתמש בחישובי תמהיל מאסטר (טבלה 2) ושנה את קנה המידה בהתאם.

2. בדיקת פוריות

הערה: נתונים מייצגים מוצגים בטבלה משלימה 1 וסכימה באיור 1A.

  1. השג או הכין את הדברים הבאים: לוחות פטרי בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ, NGM בתוספת 0.2 גרם/ליטר סטרפטומיצין סולפט, תרבית E. coli OP50, LB, תרבית C. albicans , YPD, Wire Pick, מאגר M9 (3.0 גרם/ליטר KH2PO4, 6.0 גרם/ליטר Na2HPO4, 0.5 גרם/ליטר NaCl, 1.0 גרם/ליטר NH4Cl), צינורות חרוטיים של 15 מ"ל.
    יומיים לפני הניסוי
  2. לחסן זנים של C. albicans ב-2 מ"ל של YPD ו-E. coli (OP50) ב-50 מ"ל של LB וגדלים בן לילה ב-30 מעלות צלזיוס.
  3. הכינו צלחות פטרי בגודל 35 מ"מ על 10 מ"מ עם NGM בתוספת 0.2 גרם/ליטר סטרפטומיצין סולפט. מספר הצלחות שהוכנו אמור להחזיק מעמד לאורך כל הניסוי. מספר השכפולים המומלץ הוא 10 לטיפול. עבור 10 שכפולים, ישמשו 70 לוחות. 1 ליטר NGM יכין ~ 250 צלחות.
    יום לפני הניסוי
  4. צלחות אגר זרעים בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ NGM בתוספת סטרפטומיצין ליום 0, יום 2 ויום 3 בהתאם לפרוטוקול הזריעה המתואר לעיל עם ריכוז המאסטרמיקס (טבלה 2). פיפטו את הכמות המתאימה של מאסטרמיקס על מרכז הצלחת. הפצת התרבית אינה הכרחית מאחר שנקודה אחת של גדילה מיקרוביאלית מספיקה להזנת המארח ומאפשרת לנו לזהות בקלות מארחים מחוץ לזרע. דגרו את הצלחות למשך הלילה ב-RT.
    הערה: המאסטרמיקס של Day 0 מכיל 50 מיקרוליטר של "זרע" לכל שכפול עבור כל טיפול ניסיוני. ימים 2-7 כוללים 10 מיקרוליטר של "זרע" לכל שכפול עבור כל טיפול ניסיוני. אין צלחת יום 1 מכיוון שנמטודות יגיעו לשלב L4 48 שעות לאחר שהן מסונכרנות על צלחת יום 0. ברגע שהן מגיעות ל-L4, נמטודות בודדות יועברו לצלחות יום 2.
עבור שכפול אחדתנאי בקרה של E. coli (OP50)C. albicans & E. coli (OP50) מצב טיפול
OP50H2OסךOP50C. albicansH2Oסך
יום 06.25 ul43.75 ul50 ul6.25 ul1.25 ul42.5 ul50 ul
ימים 2-71.25 ul8.75 ul10 ul1.25 ul.25 ul8.5 אול10 ul

טבלה 2: נפחי מאסטרמיקס של תרביות E. coli ו-C. albicans הדרושים כדי להדביק נמטודות לבדיקת הפוריות.

יום הניסוי (יום 0)

  1. סנכרן נמטודות וצלחת ~50 ביצים על כל שכפול יום 0 של לוחות הבקרה (OP50 בלבד) וצלחות הטיפול (C. albicans + OP50). דגירה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
    יום 2
  2. העבירו נמטודה L4 בודדת על ידי בחירת8 מצלחת יום 0 לכל אחת מהצלחות המדורגות של יום 2. ניתן לזהות מארחי L4 על ידי כיס קטן באמצע הצד הגבי של גופם22. העבירו את הנמטודות שבקעו והבשילו מאותו סוג של צלחת זרעים (כלומר, יש להעביר נמטודות L4 מלוחות בקרה D0 ללוחות בקרה של יום 2).
  3. חיסון תרביות C. albicans הדרושות ב-2 מ"ל של YPD ו-E. coli (זן OP50) ב-50 מ"ל של LB.
    יום 3
  4. העבר נמטודות מלוחות יום 2 לצלחות זרעים ביום 3, תוך מעקב אחר כל שכפול (כלומר, יש להעביר את Replicate A מהיום 2 לצלחת Replicate A Day 3).
  5. דגירה של צלחות יום 2 (המכילות ביצים בלבד) ויום 3 (המכילות את הבוגר היחיד) בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  6. זרעים בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ NGM בתוספת צלחות סטרפטומיצין לימים 4 ו-5 תוך שימוש ב-10 מיקרוליטר של מאסטרמיקס לצלחת (טבלה 2) וצלחות דגירה ב-RT למשך 24 שעות.
    יום 4
  7. העבירו נמטודות מצלחות יום 3 לצלחות זרעים ביום 4.
  8. דגירה של צלחות יום 3 ויום 4 בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  9. בעזרת היקף ניתוח, ספרו את הצאצאים הקיימים עבור כל צלחת יום 2. שימו לב לשכפולים שמתו או שכבר אינם על הצלחת (מצונזרים). לאחר רישום מספר הצאצאים, השליכו את צלחות היום השני.
    הערה: מצונזר מתייחס לנמטודות שנעלמות על הצלחת. זה יכול להתרחש כאשר נמטודות זוחלות מהצלחת. למרות שפחות נפוץ במהלך חלון 24 השעות, פגרי נמטודות מתות מתפרקים לתוך האגר וכתוצאה מכך גם צנזורה. נתונים מצונזרים אינם נכללים בניתוח נתוני הצאצאים וההישרדות.
  10. חיסון תרביות חדשות של זני C. albicans ב-2 מ"ל של YPD ו-E. coli (OP50) ב-50 מ"ל של LB.
    יום 5
  11. העבירו נמטודות מצלחות יום 4 לצלחות זרעים ביום 5.
  12. דגירה של צלחות יום 4 ויום 5 בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  13. ספרו את הצאצאים בני הקיימא עבור כל צלחת של יום 3. שימו לב לשכפולים שמתו או שכבר אינם על הצלחת (מצונזרים). לאחר רישום מספר הצאצאים, השליכו את צלחות היום השלישי.
  14. זרעים בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ NGM בתוספת צלחות סטרפטומיצין לימים 6 ו-7 תוך שימוש ב-10 מיקרוליטר של מאסטרמיקס לצלחת (טבלה 2) ודגירת צלחות בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
    יום 6
  15. העבירו נמטודות מצלחות יום 5 לצלחות זרעים ביום 6.
  16. דגירה של צלחות יום 5 ויום 6 בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  17. ספרו את הצאצאים בני הקיימא עבור כל צלחת של יום 4. שימו לב לשכפולים שמתו או שכבר אינם על הצלחת (מצונזרים). לאחר רישום מספר הצאצאים, השליכו את צלחות היום הרביעי.
    יום 7
  18. העבירו נמטודות מצלחות יום 6 לצלחות זרעים של יום 7.
  19. דגירה של צלחות יום 6 ויום 7 בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  20. ספרו את הצאצאים בני הקיימא עבור כל צלחת של יום 5. שימו לב לשכפולים שמתו או שכבר אינם על הצלחת (מצונזרים). לאחר רישום מספר הצאצאים, השליכו את לוחיות היום החמישי.
    יום 8
  21. ספרו את הצאצאים בני הקיימא עבור כל צלחת של יום 6. שימו לב לשכפולים שמתו או שכבר אינם על הצלחת (מצונזרים). לאחר רישום מספר הצאצאים, השליכו את צלחות היום השישי.
    יום 9
  22. ספרו את הצאצאים בני הקיימא עבור כל צלחת של יום 7. אל תספור את הנמטודה הגדולה ביותר (הורה). שימו לב לשכפולים שמתו או שכבר אינם על הצלחת (מצונזרים). לאחר רישום מספר הצאצאים, השליכו את לוחיות היום השביעי.
    הערה: בדיקה זו יכולה לשמש גם להערכת הישרדות. רשום מתי כל נמטודה מתה. בסוף הניסוי ניתן להשוות את אחוז הנמטודות ששרדו במהלך הניסוי בן שבעת הימים עבור כל טיפול. נמטודות לפעמים יזחלו הרחק ממקור המזון/פתוגן וינסו לטפס על המגלשות של צלחת הפטרי. בדוק את כל אזורי הצלחת לפני שתמשיך הלאה. נמטודות מתות בדרך כלל ישאירו אחריהן נבלה. צנזרו כל נמטודה שלא ניתן לאתר ואל תספרו את הנמטודה כמתה. אל תכלול נתונים מצונזרים בניתוח הסופי של צאצאים והישרדות.
  23. נתח נתונים עבור גודל הדגירה ורבייה מאוחרת באמצעות ANOVA חד כיווני או Kruskal-Wallis, בהתאם לנורמליות של מערכי הנתונים, כמו גם בדיקות מרובות פוסט-הוק של Tukey/Dunn כדי לזהות הבדלים משמעותיים בין קבוצות הטיפול באמצעות תוכנת GraphPad Prism. זהה הבדלים בין עקומות הישרדות באמצעות מבחן דירוג היומן של Wilcoxon.

3. בדיקת הרחבת שושלת

הערה: נתונים מייצגים מוצגים בטבלה משלימה 2 וסכימה מוצגת באיור 2A.

  1. השג או הכין את הדברים הבאים: צלחות פטרי בגודל 100 מ"מ על 15 מ"מ המכילות אגר NGM בתוספת 0.2 גרם/ליטר סטרפטומיצין סולפט, תרביות E. coli OP50, תרביות LB, C. albicans , YPD, מאגר M9, Wire Pick, צינורות חרוטיים של 15 מ"ל.
    יום -2
  2. לחסן זנים של C. albicans ב-2 מ"ל של YPD ו-E. coli (OP50) ב-50 מ"ל של LB וגדלים בן לילה ב-30 מעלות צלזיוס.
    יום -1
  3. זרעים 100 מ"מ x 15 מ"מ צלחות אגר NGM בתוספת סטרפטומיצין עם 300 מיקרוליטר של מאסטרמיקס לצלחת (טבלה 3). מורחים את המאסטרמיקס על הצלחת בעזרת מפזר מתכת סטרילי. דוגרים את הצלחות למשך הלילה בחום של 30 מעלות צלזיוס. מומלץ שישה שכפולים לכל טיפול. לפיכך, הכינו שבע צלחות (צלחת אחת לנמטודות מסונכרנות, שש צלחות לכל נמטודה בוגרת) לכל טיפול.
תנאי בקרה של E. coli (OP50)C. albicans & E. coli (OP50). מצב הטיפול
עבור שכפול אחדOP50H2OסךOP50C. albicansH2Oסך
1.25 ul8.75 ul10 ul37.5 ul7.5 אול255 ul300 ul

טבלה 3: נפחי מאסטרמיקס של תרביות E. coli ו-C. albicans הדרושים כדי להדביק נמטודות לבדיקת הרחבת השושלת.

גידול אוכלוסיית הנמטודות: יום 0

  1. סנכרנו נמטודות וצלחו 10-25 ביצים בצלחת אחת לכל ביקורת (OP50 בלבד) וטיפול (C. albicans + OP50) ודגרו בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
    יום 2:
  2. העבירו תולעת L4 בודדת מכל צלחת בקרה וטיפול ביום 0 לצלחות זרעים של אותו טיפול. ניתן לזהות מארחי L4 על ידי כיס קטן באמצע הצד הגבי של גופם22.
  3. דגירה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים (סה"כ שבוע לאחר הסנכרון).
    יום 7:
  4. בעזרת פיפטה p1000, שטפו את כל אוכלוסיית הנמטודות מכל צלחת באמצעות 5 מ"ל של מאגר M9 והעבירו לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
  5. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לאפשר לנמטודות להתיישב לספירה קלה יותר.
  6. מדללים כל חרוטי לנפח סופי של 10 מ"ל עם מאגר M9.
  7. עבור כל שכפול ביולוגי, ספרו את מספר הנמטודות במנה של 20 מיקרוליטר. חזור על כך כדי להשיג 6 שכפולים טכניים עבור כל שכפול ביולוגי. חישוב אחורי כדי לקבוע את גודל האוכלוסייה הכולל. אם הדגימות מדוללות מדי (כלומר, פחות מ-10 נמטודות לדגימה), רכזו את האוכלוסייה בנפח קטן יותר של מאגר M9.
    הערה: צנטריפוגה של נמטודות חיות לא תפגע בנמטודות.
    חישוב לדוגמא:
    70 מארחים = X (סה"כ מארחים)
    20 מיקרוליטר (לא כולל) 10,000 מיקרוליטר (נפח כולל)
  8. נתח נתונים להרחבת שושלת באמצעות ANOVA חד כיווני או Kruskal-Wallis, בהתאם לנורמליות של מערכי הנתונים, כמו גם בדיקות מרובות פוסט-הוק של Tukey/Dunn כדי לזהות הבדלים משמעותיים בין קבוצות הטיפול באמצעות תוכנת GraphPad Prism.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כאן אנו מציגים שתי בדיקות המודדות את האלימות של C. albicans כפנוטיפ לא קטלני תוך שימוש ב-C. elegans כמודל זיהום. הבדיקה הראשונה, פוריות, עוקבת אחר האופן שבו זיהום C. albicans משפיע על מארחים בודדים לייצור צאצאים והישרדותם הבדיקה השנייה, הרחבת שושלת,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן, אנו מציגים שתי בדיקות פשוטות המודדות אלימות פטרייתית. שתי הבדיקות ממנפות את C. elegans כמערכת מארחת הכוללת ניטור של פנוטיפים של מארח קטלני ולא קטלני כאחד. לדוגמה, מבחני פוריות חוקרים את הצלחת הרבייה של מארחים נגועים בודדים תוך מדידת הישרדות אינדיבידואלית. הניטור הי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים לדוריאן פייסטל, רמה אלמוסטפא ומקנה פנלי על עזרתם בפיתוח הבדיקות ואיסוף הנתונים שלנו. מחקר זה נתמך על ידי NSF DEB-1943415 (MAH).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL eppendorf microtubes 3810XMillipore SigmaZ606340
100 mm x 15 mm petri platesSigma-AldrichP5856-500EA
15 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-959-70C
50 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-432-22
AdenineMillipore SigmaA8626
Agar (granulated, bacterilogical grade)Apex BioResearch Produces20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)Genesee Scientific59-1M32P
Ammonium ChlorideMillipore Sigma254134
Bacterial Cell SpreaderSP Scienceware21TP50
BactoPeptoneFisher BioReagantsBP1420-500
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)FIsherBrand14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)Nikon Instrument Inc.
E. coliCaenorhabditis Genetics CenterOP50
GlucoseMillipore Sigma50-99-7
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)Falcon353001
Metal SpatulaSP Scienceware8TL24
Nematode Growth Media (NGM)Dot ScientificDSN81800-500
Potassium Phosphate monobasicSigmaP0662-500G
Sodium ChlorideFisher ScientificBP358-1
Sodium PhosphateFisher ScientificBP332-500
Streptomycin SulfateThermo-Fisher Scientific11860038
TryptoneMillipore Sigma91079-40-2
UridineMillipore SigmaU3750
Wildtype C. elegansCaenorhabditis Genetics CenterN2
Yeast ExtractMillipore Sigma8013-01-2

References

  1. Underhill, D. M., Iliev, I. D. The mycobiota: interactions between commensal fungi and the host immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (6), (2014).
  2. Ibrahim, A. S., Filler, S. G., Sanglard, D., Edwards, J. E., Hube, B. Secreted Aspartyl Proteinases and Interactions of Candida albicans with Human Endothelial Cells. Infection and Immunity. 66 (6), 3003-3005 (1998).
  3. Calderone, R. A., Fonzi, W. A. Virulence factors of Candida albicans. Trends in Microbiology. 9 (7), 327-335 (2001).
  4. Mayer, F. L., Wilson, D., Hube, B. Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence. 4 (2), 119-128 (2013).
  5. Chin, V., Lee, T., Rusliza, B., Chong, P. Dissecting Candida albicans Infection from the Perspective of C. albicans Virulence and Omics Approaches on Host-Pathogen Interaction: A Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (10), 1643(2016).
  6. Elkabti, A., Issi, L., Rao, R. Caenorhabditis elegans as a Model Host to Monitor the Candida Infection Processes. Journal of Fungi. 4 (4), 123(2018).
  7. Arvanitis, M., Glavis-Bloom, J., Mylonakis, E. Invertebrate models of fungal infection. Biochimica et biophysica acta. 1832 (9), 1378-1383 (2013).
  8. Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. Journal of Visualized Experiments. (128), e56487(2017).
  9. Breger, J., et al. Antifungal Chemical Compounds Identified Using a C. elegans Pathogenicity Assay. PLoS Pathogens. 3 (2), 18(2007).
  10. Okoli, I., et al. Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay. PloS one. 4 (9), 7025(2009).
  11. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans Infection of Caenorhabditis elegans Induces Antifungal Immune Defenses. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002074(2011).
  12. Kim, D. H., Ausubel, F. M. Evolutionary perspectives on innate immunity from the study of Caenorhabditis elegans. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 4-10 (2005).
  13. Kim, D. H., et al. A Conserved p38 MAP Kinase Pathway in Caenorhabditis elegans Innate Immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  14. van der Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generated Reactive Oxygen Species Trigger Protective SKN-1 Activity via p38 MAPK Signaling during Infection in C. elegans. PLoS Pathogens. 7 (12), 1002453(2011).
  15. van der Hoeven, R., Cruz, M. R., Chávez, V., Garsin, D. A. Localization of the Dual Oxidase BLI-3 and Characterization of Its NADPH Oxidase Domain during Infection of Caenorhabditis elegans. PLOS ONE. 10 (4), 0124091(2015).
  16. Chávez, V., Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generates Reactive Oxygen Species as a Protective Innate Immune Mechanism in Caenorhabditis elegans. Infection and Immunity. 77 (11), 4983-4989 (2009).
  17. Vander, H., Prabha, V. Evaluation of fertility outcome as a consequence of intravaginal inoculation with sperm-impairing micro-organisms in a mouse model. Journal of Medical Microbiology. 64, Pt_4 344-347 (2015).
  18. Castrillón-Duque, E. X., Suárez, J. P., Maya, W. D. C. Yeast and Fertility: Effects of In Vitro Activity of Candida spp. on Sperm Quality. Journal of Reproduction & Infertility. 19 (1), 49-55 (2018).
  19. Feistel, D. J., et al. A Novel Virulence Phenotype Rapidly Assesses Candida Fungal Pathogenesis in Healthy and Immunocompromised Caenorhabditis elegans Hosts. mSphere. 4 (2), (2019).
  20. Feistel, D. J., Elmostafa, R., Hickman, M. A. Virulence phenotypes result from interactions between pathogen ploidy and genetic background. Ecology and Evolution. 10 (17), 9326-9338 (2020).
  21. Mitchell, B. M., Wu, T. G., Jackson, B. E., Wilhelmus, K. R. Candida albicans Strain-Dependent Virulence and Rim13p-Mediated Filamentation in Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (2), 774-780 (2007).
  22. Altun, Z. F., Hall, D. H. WormAtas Hermaphrodite Handbook - Introduction. WormAtlas. , (2006).
  23. Yuan, X., Mitchell, B. M., Hua, X., Davis, D. A., Wilhelmus, K. R. The RIM101 Signal Transduction Pathway Regulates Candida albicans Virulence during Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (9), 4668-4676 (2010).
  24. Davis, D., Edwards, J. E., Mitchell, A. P., Ibrahim, A. S. Candida albicans RIM101 pH Response Pathway Is Required for Host-Pathogen Interactions. Infection and Immunity. 68 (10), 5953-5959 (2000).
  25. Chamilos, G., et al. Candida albicans Cas5, a Regulator of Cell Wall Integrity, Is Required for Virulence in Murine and Toll Mutant Fly Models. The Journal of Infectious Diseases. 200 (1), 152-157 (2009).
  26. Bruno, V. M., et al. Control of the C. albicans Cell Wall Damage Response by Transcriptional Regulator Cas5. PLoS Pathogens. 2 (3), 21(2006).
  27. Davis, D. Adaptation to environmental pH in Candida albicans and its relation to pathogenesis. Current Genetics. 44 (1), 58(2003).
  28. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A Pathogenesis Assay Using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans Reveals Novel Roles for Yeast AP-1, Yap1, and Host Dual Oxidase BLI-3 in Fungal Pathogenesis. Eukaryotic Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
  29. De, A., Sahu, A. K., Singh, V. Bite size of Caenorhabditis elegans regulates feeding, satiety and development on yeast diet. bioRxiv. , 473256(2018).
  30. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24 (1), 3-9 (2012).
  31. Smith, A. C., Hickman, M. A. Host-Induced Genome Instability Rapidly Generates Phenotypic Variation across Candida albicans Strains and Ploidy States. mSphere. 5 (3), 00433(2020).
  32. Palominos, M. F., Calixto, A. Quantification of Bacteria Residing in Caenorhabditis elegans Intestine. BIO-PROTOCOL. 10 (9), (2020).
  33. Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a Model Organism for Investigating Immunity. Applied and Environmental Microbiology. 78 (7), 2075-2081 (2012).
  34. Liberati, N. T., et al. Requirement for a conserved Toll/interleukin-1 resistance domain protein in the Caenorhabditis elegans immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6593-6598 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Caenorhabditis elegans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved