JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Opportunistische Pilzerreger können sowohl lebensbedrohliche als auch leichte Infektionen verursachen, aber nicht-letale Phänotypen werden bei der Untersuchung der Virulenz häufig ignoriert. Aus diesem Grund haben wir ein Nematodenmodell entwickelt, das sowohl die Überlebens- als auch die Fortpflanzungsaspekte des Wirts überwacht, um die Virulenz von Pilzen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Während Krankheitserreger für den Menschen tödlich sein können, verursachen viele von ihnen eine Reihe von Infektionstypen mit nicht-tödlichen Phänotypen. Candida albicans, ein opportunistischer Pilzerreger des Menschen, ist die vierthäufigste Ursache für nosokomiale Infektionen, die zu einer Mortalität von ~40% führen. Andere C . albicans-Infektionen sind jedoch weniger schwerwiegend und selten tödlich und umfassen die vulvovaginale Candidiasis, von der ~75% der Frauen betroffen sind, sowie die oropharyngeale Candidiasis, von der hauptsächlich Säuglinge, AIDS-Patienten und Krebspatienten betroffen sind. Während Mausmodelle am häufigsten zur Untersuchung der Pathogenese von C. albicans verwendet werden, bewerten diese Modelle überwiegend das Überleben des Wirts und sind kostspielig, zeitaufwändig und in der Replikation begrenzt. Daher wurden mehrere Minimodellsysteme, darunter Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella und Caenorhabditis elegans, entwickelt, um C. albicans zu untersuchen. Diese Mini-Modelle eignen sich gut für das Screening von Mutantenbibliotheken oder unterschiedlichen genetischen Hintergründen von C. albicans. Hier beschreiben wir zwei Ansätze zur Untersuchung von C. albicans-Infektionen mit C. elegans. Der erste ist ein Fruchtbarkeitsassay, der die Wirtsreproduktion misst und das Überleben einzelner Wirte überwacht. Der zweite ist ein Abstammungsexpansions-Assay, der misst, wie sich eine C . albicans-Infektion auf das Wachstum der Wirtspopulation über mehrere Generationen auswirkt. Zusammen bieten diese Assays eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, die Virulenz von C. albicans schnell zu beurteilen.

Einleitung

Candida albicans ist ein opportunistischer Pilzerreger des Menschen, der in verschiedenen Nischen lebt, einschließlich der Mundhöhle, des Magen-Darm-Trakts und des Urogenitaltrakts1. Obwohl C. albicans in der Regel kommensal, verursacht es sowohl Schleimhaut- als auch Blutbahninfektionen, von denen letztere tödlich verlaufen können. Der Schweregrad einer C. albicans-Infektion hängt von der Immunfunktion des Wirts ab, wobei immungeschwächte Personen anfälliger für eine Infektion sind als gesunde Personen1. Zusätzlich zu den wirtsbezogenen Faktoren weist C. albicans mehrere Virulenzmerkmale auf, darunter Hyphen, Biofilmbildung und die Produktion von sekretorischen Aspartylproteinasen (SAPs), die die Adhäsion und Invasion von C. albicans in Wirtsepithelzellen fördern2, und Candidalysin, ein zytolytisches Peptidtoxin 3,4. Zusammengenommen deutet dies darauf hin, dass es sich bei der Virulenz von C. albicans um einen komplexen Phänotyp handelt, der aus einer Interaktion zwischen dem Erreger und seiner Wirtsumgebung resultiert. Daher lässt sich die Untersuchung der Virulenz am besten anhand von Modellorganismen untersuchen, die als Wirtsumgebung dienen, im Gegensatz zu in vitro-Ansätzen.

Mehrere Wirtsmodelle, darunter sowohl Wirbeltiere als auch wirbellose Organismen, wurden entwickelt, um die Infektion mit C. albicans zu untersuchen. Das Mausmodell, das als Goldstandard gilt, wird häufig wegen seines adaptiven und angeborenen Immunsystems und seiner Fähigkeit, das Fortschreiten der Krankheit sowohl systemisch als auch in bestimmten Organen zu überwachen, verwendet5. Dieses Wirtsmodell weist jedoch erhebliche Einschränkungen auf, darunter Wartungskosten, eine geringe Anzahl von Nachkommen sowie eine verringerte Leistung und Reproduzierbarkeit im Zusammenhang mit kleinen Stichprobengrößen5. Daher wurden weitere, einfachere Modellorganismen wie Zebrafisch (Danio rerio), Fruchtfliege (Drosophila melanogaster), Wachsmotte (Galleria mellonella) und Fadenwurm (Caenorhabditis elegans) entwickelt. Diese Modellorganismen, die keine Säugetiere sind, sind kleiner, benötigen weniger Wartung im Labor und größere Probengrößen ermöglichen eine höhere Aussagekraft und Reproduzierbarkeit im Vergleich zu Mausmodellen. Jedes dieser Modelle hat spezifische Vor- und Nachteile, die bei der Auswahl eines Infektionsmodells berücksichtigt werden müssen. G. mellonella bietet die physiologisch ähnlichste Umgebung für den Menschen, da er bei 37 °C gezüchtet werden kann und verschiedene phagozytäre Zellen hat7. Darüber hinaus ermöglicht dieses Modell die direkte Injektion eines spezifischen Inokulums7. Es gibt jedoch kein vollständig sequenziertes Genom und keine etablierte Methode zur Erzeugung mutierter Stämme. Ähnlich wie bei G. mellonella ermöglicht das D. rerio-Modell die direkte Injektion eines spezifischen Inokulums 5,7. Außerdem verfügt es sowohl über ein adaptives als auch über ein angeborenes Immunsystem5, das nur bei diesem Nicht-Säugetiermodell vorkommt, aber für dessen Aufrechterhaltung Wasserzuchtbecken erforderlich sind. D. melanogaster und C. elegans haben ähnliche Vor- und Nachteile, zu denen vollständig sequenzierte Genome gehören, die leicht zu manipulieren sind und mutierte Stämme erzeugen7, aber keine adaptive Immunität oder Zytokine aufweisen7. Von all diesen Nicht-Säugetiermodellen hat C. elegans den schnellsten Lebenszyklus, befruchtet sich selbst, um eine große Anzahl genetisch identischer Nachkommen zu erzeugen, und ist am besten für großflächige Screenings geeignet 6,7,8. C. elegans erwies sich als äußerst leistungsfähig für das Hochdurchsatz-Screening von Antimykotika 9,10, charakterisierte Virulenzfaktoren7 und identifizierte C. albicans-spezifische Wirtsabwehrnetzwerke11. Das angeborene Immunsystem von C. elegans besteht aus mehreren Komponenten, die beim Menschen stark konserviert sind12. Zu den angeborenen Abwehrmechanismen des Wirts gehören die Produktion von antimikrobiellen Peptiden13 (AMPs) und reaktiven Sauerstoffspezies 14,15,16.

Der Schweregrad der C. albicans-Infektion wird hauptsächlich durch das Überleben des Wirts gemessen, kann aber keine nicht-letalen Virulenz-Phänotypen erfassen. Ein oft übersehener Aspekt der Wirtsfitness ist die Fortpflanzung, aber mehrere Studien deuten darauf hin, dass C. albicans die Fortpflanzung beeinflusst, indem es die Lebensfähigkeit der Spermien verringert17,18, was darauf hindeutet, dass dies ein wichtiger Aspekt der Wirtsfitness sein könnte, der untersucht werden sollte. Daher ist der Einfluss einer C. albicans-Infektion auf die Fruchtbarkeit des Wirts ein nützlicher Weg, um nicht-letale Virulenz-Phänotypen zu untersuchen. Wir haben zwei Infektionsassays mit C. elegans entwickelt, um sowohl Überlebens- als auch Reproduktionsphänotypen in gesunden Wirten zu untersuchen19,20. Hier beschreiben wir sowohl die Fruchtbarkeits- als auch die Abstammungsexpansionsassays. Die Fruchtbarkeit misst sowohl die produzierten Nachkommen als auch das Überleben einzelner Wirte, und die Generationserweiterung bewertet die Folgen einer Infektion über drei Wirtsgenerationen. Wir zeigen, wie diese Assays zum Screening von C. albicans-Deletionsmutanten verwendet werden können, um sowohl dramatische als auch subtile Unterschiede zwischen letalen und nicht-letalen Virulenz-Phänotypen zu erfassen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

1. Vorbereitende Schritte für die Versuche

  1. Aufbereitung von C. albicans- und Escherichia coli-Kulturen
    HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Stämme sind in Tabelle 1 aufgeführt.
    1. C . albicans und E. coli-Stämme als Glycerin-Stämme bei -80 °C halten.
    2. Mit einem sterilen Zahnstocher die gewünschte C. albicans auf feste Hefe-Pepton-Dextrose (YPD) (1 % Hefeextrakt, 2 % Bactopepton, 2 % Glukose, 1,5 % Agar, 0,004 % Adenin, 0,008 % Uridin) abseihen und über Nacht bei 30 °C wachsen lassen.
      HINWEIS: Wenn der C . albicans-Stamm auxotroph ist, ergänzen Sie das Medium mit den notwendigen Aminosäuren.
    3. Beimpfen Sie mit einer sterilen Schlaufe oder einem Zahnstocher eine einzelne C . albicans-Kolonie in 2 ml flüssiges YPD. Inkubieren bei 30 °C unter Schütteln für 24 h.
    4. Mit einem sterilen Zahnstocher E. coli (OP50) auf die Agarplatten der Luria-Brühe (LB; 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, 15 g/l Agar) streichen. Über Nacht bei 30 °C inkubieren.
    5. Eine einzelne OP50-Kolonie in 50 ml LB impfen. Inkubieren bei 30 °C unter Schütteln über Nacht.
  2. Vorbereitung des Nematoden-Wachstumsmediums
    1. In einem 2-Liter-Kolben 29 g Nematoden-Wachstumsmedienpulver (NGM; 17,5 g/l Agar, 3,0 g/l Natriumchlorid, 2,5 g/l Pepton, 0,005 g/l Cholesterin) zu 1 l Wasser geben und mit einem Rührstab mischen.
    2. Um das Überwuchern von E. coli zu hemmen und die Proliferation von C. albicans zu ermöglichen, ergänzen Sie NGM nach dem Autoklavieren mit 0,2 g/L Streptomycinsulfat.
      HINWEIS: Wenn Sie NGM zur Nematodenpflege verwenden, ist Streptomycin nicht erforderlich.
  3. Erhaltung der Nematodenpopulationen
    1. 300 μl E. coli-Kultur über Nacht mit einem Metallstreuer auf vorbereitete NGM-Agarplatten verteilen. Diese Technik wird als Seeding bezeichnet.
    2. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur (RT) trocknen. Die Platten über Nacht bei 30 °C wachsen lassen.
    3. Halten Sie die Nematodenpopulation aufrecht, indem Sie alle 3-4 Tage auf eine neu ausgesäte NGM-Platte mit E. coli chunken. Bei 20 °C lagern. Chunking ist eine Technik, mit der eine zufällige Population von Nematoden schnell auf eine neu ausgesäte Platte übertragen wird, wodurch sich die Populationen vermehren können. Schneide dazu mit einem sterilen Spatel ein kleines Quadrat (1 x 1 Zoll) aus der NGM-Agarplatte aus. Übertragen Sie das Quadrat vorsichtig auf eine neu ausgesäte NGM-Platte, wobei die Seite mit den Nematoden nach unten auf den neuen Agar8 zeigt.
      HINWEIS: C. elegans , die bei 20 °C gehalten werden, produzieren ~48 Stunden später Nachkommen, was bei der Synchronisierung einer Population von Nematoden sinnvoll ist. C. elegans , die bei 25 °C gehalten werden, entwickeln und vermehren sich schneller, und Populationen, die bei 15 °C gehalten werden, wachsen langsamer.
  4. Synchronisierung der Nematodenpopulation
    1. Beginnen Sie mit einer bestehenden Nematodenpopulation, die auf NGM/OP50 gepflegt wird.
    2. Pipettieren Sie ~3 mL M9-Puffer auf die NGM-Platte, die Nematoden enthält. Waschen Sie die Nematodeneier vom Teller und kratzen Sie die Eier vorsichtig mit der Spitze der Pipette vom Agar ab (sie neigen dazu, zu kleben). Übertragen Sie die Flüssigkeit, die sowohl Eier als auch Würmer enthält, mit einer P1000-Pipette in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Um die Anzahl der noch auf der Platte befindlichen Eier zu beurteilen, verwenden Sie ein Präpariermikroskop, um den Agar zu betrachten.
    3. 2 min bei 279 x g und RT konisch zentrifugieren.
    4. Entfernen Sie den Überstand und achten Sie darauf, das Nematodenpellet nicht zu stören.
    5. Fügen Sie 3 ml 25%ige Bleichlösung hinzu ("VORSICHT" bei der Handhabung).
    6. Röhrchen 2 Minuten lang umdrehen. Überprüfen Sie mit dem Präpariermikroskop, ob die Nematoden tot sind - sie sind stäbchengerade und unbeweglich.
      HINWEIS: Dadurch werden nur die vorhandenen Nematoden abgetötet. Die Unversehrtheit der Eizellen wird nicht beeinträchtigt.
    7. 2 min bei 279 x g und RT zentrifugieren.
    8. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 3 mL M9.
    9. 2 min bei 279 x g und RT zentrifugieren.
    10. Den Überstand entfernen und das Pellet in 300 μl M9 resuspendieren.
    11. Überprüfen Sie mit einem Präpariermikroskop die Konzentration der Eizellen, indem Sie 5 μl Eier auf eine kleine Petriplatte pipettieren. Die ideale Konzentration sollte zwischen 20 und 100 Eiern liegen. Wenn die Kultur zu verdünnt ist, die Lösung durch Zentrifugieren und Entfernen von überschüssiger Flüssigkeit konzentrieren. Wenn die Kultur zu konzentriert ist, fügen Sie mehr M9 hinzu, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist.
  5. Bereiten Sie C . albicans - und E. coli-Kulturen für die Nematodeninfektion vor (Aussaat).
    1. Bereiten Sie eine leere Lösung vor. In einer Küvette werden 900 μl ddH2O und 100 μl flüssiges YPD vermischt.
    2. Setzen Sie die Küvette in das Spektralphotometer ein. Stellen Sie die Wellenlänge mit dem Pfeil nach oben auf 600 Nanometer ein. Klicken Sie auf den Button "0 ABS 100% T", um die Blindlösung einzustellen.
    3. In einer neuen Küvette werden 900 μl ddH2O und 100 μl Nachthefekultur kombiniert. Nehmen Sie die Blindlösung aus dem Spektralphotometer und fügen Sie die Küvette mit der Hefelösung hinzu. Nehmen Sie die auf dem Bildschirm angezeigte optische Dichte auf (drücken Sie keine Tasten). Multiplizieren Sie den Messwert mit 10 (die gemessene Hefelösung war eine Verdünnung von 1 zu 10).
    4. Normalisieren Sie die Kultur auf 3,0 OD600/ml mit ddH2O in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. 1 OD600 entspricht ca. 3 x 10-7 KBE/mL 21.
      HINWEIS: Wenn der OD600-Messwert 6,7, 3 OD/6,7 OD = 0,447 ml beträgt, geben Sie 447 μl C . albicans-Kultur in das Mikrozentrifugenröhrchen. Bei maximaler Drehzahl (16.873 x g) 30 s zentrifugieren. Überstand entfernen und in 1 ml ddH2O resuspendieren.
    5. Übertragen Sie die E. coli-Kultur über Nacht in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
    6. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 279 x g für 2 min bei RT.
    7. Aspirieren Sie den größten Teil des Überstands und lassen Sie ~1 ml übrig.
    8. Das Pellet wird im verbleibenden Überstand resuspendiert und in ein vorgewogenes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
    9. Drehen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen 30 s lang mit maximaler Geschwindigkeit nach unten.
    10. Entfernen Sie mit einer p1000-Pipette den Überstand und wiegen Sie das endgültige Pellet.
    11. Verdünnen Sie E. coli auf 200 mg/ml in ddH2O.
    12. Verwenden Sie Master-Mix-Berechnungen (Tabelle 2) und skalieren Sie entsprechend.

2. Fruchtbarkeits-Test

HINWEIS: Repräsentative Daten sind in der ergänzenden Tabelle 1 und ein Schema in Abbildung 1A dargestellt.

  1. Beziehen oder bereiten Sie Folgendes vor: 35 mm x 10 mm Petriplatten, NGM, ergänzt mit 0,2 g/l Streptomycinsulfat, E. coli OP50-Kultur, LB, C. albicans-Kultur , YPD, Wire Pick, M9-Puffer (3,0 g/L KH2PO4, 6,0 g/L Na2HPO4, 0,5 g/L NaCl, 1,0 g/L NH4Cl), 15 mL konische Röhrchen.
    Zwei Tage vor dem Experiment
  2. C. albicans-Stämme in 2 mL YPD und E. coli (OP50) in 50 mL LB impfen und über Nacht bei 30 °C züchten.
  3. Bereiten Sie 35 mm x 10 mm Petriplatten mit NGM zu, ergänzt mit 0,2 g/L Streptomycinsulfat. Die Anzahl der vorbereiteten Platten sollte für das gesamte Experiment reichen. Die empfohlene Anzahl von Replikaten beträgt 10 pro Behandlung. Für 10 Replikate werden 70 Platten verwendet. 1 L NGM ergibt ~250 Platten.
    Einen Tag vor dem Experiment
  4. Samen 35 mm x 10 mm NGM-Agarplatten, ergänzt mit Streptomycin für Tag 0, Tag 2 und Tag 3 gemäß dem oben beschriebenen Aussaatprotokoll mit der Mastermix-Konzentration (Tabelle 2). Pipettieren Sie die entsprechende Menge Mastermix in die Mitte der Platte. Eine Ausbreitung der Kultur ist nicht notwendig, da ein einziger Punkt mikrobiellen Wachstums für die Wirtsfütterung ausreicht und es uns ermöglicht, Wirte außerhalb des Samens leicht zu identifizieren. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei RT.
    HINWEIS: Der Day-0-Mastermix enthält 50 μl "Seed" pro Replikat für jede experimentelle Behandlung. Die Tage 2 bis 7 enthalten 10 μl "Saatgut" pro Replikat für jede experimentelle Behandlung. Es gibt keine Tag-1-Platte, da Nematoden das L4-Stadium 48 h nach der Synchronisierung mit einer Tag-0-Platte erreichen. Sobald sie L4 erreicht haben, werden die einzelnen Nematoden auf die Tag-2-Platten übertragen.
Für 1 ReplikatE. coli (OP50) KontrollbedingungC. albicans & E. coli (OP50) Behandlungsbedingung
OP50H2OGesamtOP50C. albicansH2OGesamt
Tag 06,25 μl43,75 μl50 UL6,25 μl1,25 μl42,5 μl50 UL
Tag 2-71,25 μl8,75 μl10 UL1,25 μl.25 ul8,5 μl10 UL

Tabelle 2: Mastermix-Volumina von E. coli- und C. albicans-Kulturen, die zur Infektion von Nematoden für den Fruchtbarkeitstest benötigt werden.

Tag des Experiments (Tag 0)

  1. Synchronisieren Sie Nematoden und Platten ~50 Eier auf jedes Tag 0-Replikat der Kontrollplatten (nur OP50) und Behandlungsplatten (C. albicans + OP50). Bei 20 °C 48 h inkubieren.
    Tag 2
  2. Übertragen Sie einen einzelnen L4-Nematoden, indem Sie8 von der Tag-0-Platte auf jede der replizierten Tag-2-Saatplatten auswählen. L4-Wirte sind an einer kleinen Tasche in der Mitte der dorsalen Seite ihres Körpers zu erkennen22. Übertragen Sie die geschlüpften und gereiften Nematoden aus der gleichen Art von Saatplatte (d. h. L4-Nematoden von D0-Kontrollplatten müssen auf Tag-2-Kontrollplatten übertragen werden).
  3. C . albicans-Kulturen , die in 2 ml YPD und E. coli (OP50-Stamm) benötigt werden, in 50 ml LB impfen.
    Tag 3
  4. Übertragen Sie Nematoden von Tag-2-Platten auf Tag-3-Platten, wobei Sie jedes Replikat im Auge behalten (d. h. Replikat A von Tag 2 muss auf die Replizieren A-Platte von Tag 3 verschoben werden).
  5. Inkubieren Sie die Platten an Tag 2 (nur mit Eiern) und Tag 3 (mit einem einzigen Erwachsenen) bei 20 °C für 24 h.
  6. Samen Sie 35 mm x 10 mm NGM, ergänzt mit Streptomycinplatten für die Tage 4 und 5 mit 10 μl Mastermix pro Platte (Tabelle 2) und inkubieren Sie die Platten bei RT für 24 Stunden.
    Tag 4
  7. Nematoden von Tag 3 auf Tag 4 ausgesäte Platten übertragen.
  8. Inkubieren Sie die Platten für Tag 3 und Tag 4 bei 20 °C für 24 h.
  9. Zählen Sie mit einem Präparierfernrohr die lebensfähigen Nachkommen für jede Platte an Tag 2. Notieren Sie alle Replikate, die gestorben sind oder sich nicht mehr auf der Platte befinden (zensiert). Sobald die Anzahl der Nachkommen erfasst ist, entsorgen Sie die Platten von Tag 2.
    HINWEIS: Zensiert bezieht sich auf Nematoden, die auf dem Teller verschwinden. Dies kann passieren, wenn Nematoden von der Platte kriechen. Obwohl sie während des 24-Stunden-Fensters seltener sind, zerfallen die Kadaver toter Nematoden in den Agar, was ebenfalls zu Zensur führt. Zensierte Daten werden nicht in die abschließende Analyse der Nachkommen- und Überlebensdaten einbezogen.
  10. Beimpfen Sie neue Kulturen von C. albicans-Stämmen in 2 mL YPD und E. coli (OP50) in 50 mL LB.
    Tag 5
  11. Übertragen Sie Nematoden von Tag 4 auf Tag 5 ausgesäte Platten.
  12. Inkubieren Sie die Platten für Tag 4 und Tag 5 bei 20 °C für 24 h.
  13. Zähle die lebensfähigen Nachkommen für jeden Teller an Tag 3. Notieren Sie alle Replikate, die gestorben sind oder sich nicht mehr auf der Platte befinden (zensiert). Sobald die Anzahl der Nachkommen erfasst ist, entsorgen Sie die Platten von Tag 3.
  14. Samen 35 mm x 10 mm NGM, ergänzt mit Streptomycinplatten für die Tage 6 und 7 mit 10 μl Mastermix pro Platte (Tabelle 2) und Platten bei Raumtemperatur für 24 h inkubieren.
    Tag 6
  15. Übertragen Sie Nematoden von Tag 5 auf Tag 6 ausgesäte Platten.
  16. Inkubieren Sie die Platten für Tag 5 und Tag 6 bei 20 °C für 24 h.
  17. Zählen Sie die lebensfähigen Nachkommen für jeden Teller an Tag 4. Notieren Sie alle Replikate, die gestorben sind oder sich nicht mehr auf der Platte befinden (zensiert). Sobald die Anzahl der Nachkommen erfasst ist, entsorgen Sie die Platten von Tag 4.
    Tag 7
  18. Nematoden von Tag-6-Platten auf Tag-7-Saatplatten übertragen.
  19. Inkubieren Sie die Platten für Tag 6 und Tag 7 bei 20 °C für 24 h.
  20. Zähle die lebensfähigen Nachkommen für jede Platte an Tag 5. Notieren Sie alle Replikate, die gestorben sind oder sich nicht mehr auf der Platte befinden (zensiert). Sobald die Anzahl der Nachkommen erfasst ist, entsorgen Sie die Teller von Tag 5.
    Tag 8
  21. Zähle die lebensfähigen Nachkommen für jede Platte an Tag 6. Notieren Sie alle Replikate, die gestorben sind oder sich nicht mehr auf der Platte befinden (zensiert). Sobald die Anzahl der Nachkommen erfasst ist, entsorgen Sie die Teller von Tag 6.
    Tag 9
  22. Zähle die lebensfähigen Nachkommen für jede Platte an Tag 7. Zählen Sie nicht den größten Fadenwurm (Elternteil). Notieren Sie alle Replikate, die gestorben sind oder sich nicht mehr auf der Platte befinden (zensiert). Sobald die Anzahl der Nachkommen erfasst ist, entsorgen Sie die Teller von Tag 7.
    HINWEIS: Dieser Assay kann auch zur Beurteilung des Überlebens verwendet werden. Notieren Sie, wann jeder Fadenwurm gestorben ist. Am Ende des Experiments kann der Prozentsatz der Nematoden, die das siebentägige Experiment überlebt haben, für jede Behandlung verglichen werden. Nematoden kriechen manchmal von der Nahrungs-/Krankheitserregerquelle weg und versuchen, die Rutschen der Petriplatte zu erklimmen. Überprüfen Sie alle Bereiche der Platte, bevor Sie fortfahren. Tote Nematoden hinterlassen in der Regel einen Kadaver. Zensieren Sie jeden Nematoden, der nicht lokalisiert werden kann, und zählen Sie diesen Nematoden nicht als tot. Beziehen Sie zensierte Daten nicht in die abschließende Analyse der Nachkommenschaft und des Überlebens ein.
  23. Analysieren Sie die Daten für die Brutgröße und die späte Reproduktion entweder mit einer unidirektionalen ANOVA oder Kruskal-Wallis, abhängig von der Normalität der Datensätze, sowie mit post-hoc-Mehrfachtests von Tukey/Dunn, um signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen mit der GraphPad Prism-Software zu identifizieren. Erkennen Sie Unterschiede zwischen den Überlebenskurven mit dem Wilcoxon-Log-Rank-Test.

3. Assay zur Erweiterung der Abstammungslinie

HINWEIS: Repräsentative Daten sind in der ergänzenden Tabelle 2 dargestellt, und ein Schema ist in Abbildung 2A dargestellt.

  1. Beschaffen oder bereiten Sie Folgendes vor: 100 mm x 15 mm Petriplatten mit NGM-Agar, ergänzt mit 0,2 g/l Streptomycinsulfat, E. coli OP50-Kulturen, LB, C. albicans-Kulturen , YPD, M9-Puffer, Wire Pick, konische 15-ml-Röhrchen.
    Tag -2
  2. C. albicans-Stämme in 2 mL YPD und E. coli (OP50) in 50 mL LB impfen und über Nacht bei 30 °C züchten.
    Tag -1
  3. Saatgut 100 mm x 15 mm NGM-Agarplatten, ergänzt mit Streptomycin mit 300 μl Mastermix pro Platte (Tabelle 3). Verteilen Sie den Mastermix mit einem sterilen Metallstreuer auf der Platte. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 30 °C. Sechs Wiederholungen pro Behandlung werden empfohlen. Bereiten Sie also sieben Platten (eine Platte für synchronisierte Nematoden, sechs Platten für jeden adulten Nematoden) pro Behandlung vor.
E. coli (OP50) KontrollbedingungC. albicans & E. coli (OP50). Zustand der Behandlung
Für 1 ReplikatOP50H2OGesamtOP50C. albicansH2OGesamt
1,25 μl8,75 μl10 UL37,5 μl7,5 μl255 ul300 UL

Tabelle 3: Mastermix-Volumina von E. coli- und C. albicans-Kulturen, die zur Infektion von Nematoden für den Lineage-Expansions-Assay benötigt werden.

Wachstum der Nematodenpopulation: Tag 0

  1. Synchronisieren Sie Nematoden und Platten 10-25 Eier auf einer einzigen Platte für jede Kontrolle (nur OP50) und Behandlung (C. albicans + OP50) und inkubieren Sie sie 48 Stunden lang bei 20 °C.
    Tag 2:
  2. Übertragen Sie einen einzelnen L4-Wurm von jeder Platte am Tag 0 der Kontrolle und Behandlung auf ausgesäte Platten derselben Behandlung. L4-Wirte sind an einer kleinen Tasche in der Mitte der dorsalen Seite ihres Körpers zu erkennen22.
  3. Inkubieren Sie 5 Tage lang bei 20 °C (insgesamt eine Woche nach der Synchronisation).
    Tag 7:
  4. Waschen Sie mit einer p1000-Pipette die gesamte Nematodenpopulation von jeder Platte mit 5 ml M9-Puffer und geben Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
  5. 1 h bei 4 °C lagern, damit sich die Nematoden absetzen können, damit sie leichter zählen können.
  6. Verdünnen Sie jedes konische Volumen auf ein Endvolumen von 10 mL mit M9-Puffer.
  7. Zählen Sie für jedes biologische Replikat die Anzahl der Nematoden in einem 20-μl-Aliquot. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um 6 technische Replikate für jedes biologische Replikat zu erhalten. Berechnen Sie rückwärts, um die Gesamtgröße der Grundgesamtheit zu bestimmen. Wenn die Proben zu verdünnt sind (d. h. weniger als 10 Nematoden pro Probe), konzentrieren Sie die Population in einem kleineren Volumen M9-Puffer.
    HINWEIS: Die Zentrifugation von lebenden Nematoden schadet den Nematoden nicht.
    Rechenbeispiel:
    70 Hosts = X (Hosts insgesamt)
    20 μL (aliquot) 10.000 μL (Gesamtvolumen)
  8. Analysieren Sie die Daten auf die Erweiterung der Abstammungslinie entweder mit einer unidirektionalen ANOVA oder Kruskal-Wallis, abhängig von der Normalität der Datensätze, sowie mit Post-hoc-Tests von Tukey/Dunn, um signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen mit der GraphPad Prism-Software zu identifizieren.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Hier stellen wir zwei Assays vor, die die Virulenz von C. albicans als nicht-letalen Phänotyp unter Verwendung von C. elegans als Infektionsmodell messen. Der erste Assay, die Fruchtbarkeit, überwacht, wie sich eine C . albicans-Infektion auf einzelne Wirte für die Nachkommenproduktion und das Überleben auswirkt. Der zweite Assay, die Erweiterung der Abstammungslinie, misst, wie sich eine C . albicans-Infektion<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Hier stellen wir zwei einfache Assays vor, die die Virulenz von Pilzen messen. Beide Assays nutzen C. elegans als Wirtssystem, das die Überwachung sowohl auf letale als auch auf nicht-letale Wirtsphänotypen umfasst. So untersuchen Fruchtbarkeitsassays beispielsweise den Fortpflanzungserfolg einzelner infizierter Wirte und messen gleichzeitig das individuelle Überleben. Die tägliche Überwachung liefert nicht nur die Gesamtbrutgröße, sondern auch den Zeitpunkt der Fortpflan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Dorian Feistel, Rema Elmostafa und McKenna Penley für ihre Unterstützung bei der Entwicklung unserer Assays und der Datenerfassung. Diese Forschung wird durch NSF DEB-1943415 (MAH) unterstützt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL eppendorf microtubes 3810XMillipore SigmaZ606340
100 mm x 15 mm petri platesSigma-AldrichP5856-500EA
15 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-959-70C
50 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-432-22
AdenineMillipore SigmaA8626
Agar (granulated, bacterilogical grade)Apex BioResearch Produces20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)Genesee Scientific59-1M32P
Ammonium ChlorideMillipore Sigma254134
Bacterial Cell SpreaderSP Scienceware21TP50
BactoPeptoneFisher BioReagantsBP1420-500
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)FIsherBrand14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)Nikon Instrument Inc.
E. coliCaenorhabditis Genetics CenterOP50
GlucoseMillipore Sigma50-99-7
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)Falcon353001
Metal SpatulaSP Scienceware8TL24
Nematode Growth Media (NGM)Dot ScientificDSN81800-500
Potassium Phosphate monobasicSigmaP0662-500G
Sodium ChlorideFisher ScientificBP358-1
Sodium PhosphateFisher ScientificBP332-500
Streptomycin SulfateThermo-Fisher Scientific11860038
TryptoneMillipore Sigma91079-40-2
UridineMillipore SigmaU3750
Wildtype C. elegansCaenorhabditis Genetics CenterN2
Yeast ExtractMillipore Sigma8013-01-2

Referenzen

  1. Underhill, D. M., Iliev, I. D. The mycobiota: interactions between commensal fungi and the host immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (6), (2014).
  2. Ibrahim, A. S., Filler, S. G., Sanglard, D., Edwards, J. E., Hube, B. Secreted Aspartyl Proteinases and Interactions of Candida albicans with Human Endothelial Cells. Infection and Immunity. 66 (6), 3003-3005 (1998).
  3. Calderone, R. A., Fonzi, W. A. Virulence factors of Candida albicans. Trends in Microbiology. 9 (7), 327-335 (2001).
  4. Mayer, F. L., Wilson, D., Hube, B. Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence. 4 (2), 119-128 (2013).
  5. Chin, V., Lee, T., Rusliza, B., Chong, P. Dissecting Candida albicans Infection from the Perspective of C. albicans Virulence and Omics Approaches on Host-Pathogen Interaction: A Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (10), 1643(2016).
  6. Elkabti, A., Issi, L., Rao, R. Caenorhabditis elegans as a Model Host to Monitor the Candida Infection Processes. Journal of Fungi. 4 (4), 123(2018).
  7. Arvanitis, M., Glavis-Bloom, J., Mylonakis, E. Invertebrate models of fungal infection. Biochimica et biophysica acta. 1832 (9), 1378-1383 (2013).
  8. Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. Journal of Visualized Experiments. (128), e56487(2017).
  9. Breger, J., et al. Antifungal Chemical Compounds Identified Using a C. elegans Pathogenicity Assay. PLoS Pathogens. 3 (2), 18(2007).
  10. Okoli, I., et al. Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay. PloS one. 4 (9), 7025(2009).
  11. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans Infection of Caenorhabditis elegans Induces Antifungal Immune Defenses. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002074(2011).
  12. Kim, D. H., Ausubel, F. M. Evolutionary perspectives on innate immunity from the study of Caenorhabditis elegans. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 4-10 (2005).
  13. Kim, D. H., et al. A Conserved p38 MAP Kinase Pathway in Caenorhabditis elegans Innate Immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  14. van der Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generated Reactive Oxygen Species Trigger Protective SKN-1 Activity via p38 MAPK Signaling during Infection in C. elegans. PLoS Pathogens. 7 (12), 1002453(2011).
  15. van der Hoeven, R., Cruz, M. R., Chávez, V., Garsin, D. A. Localization of the Dual Oxidase BLI-3 and Characterization of Its NADPH Oxidase Domain during Infection of Caenorhabditis elegans. PLOS ONE. 10 (4), 0124091(2015).
  16. Chávez, V., Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generates Reactive Oxygen Species as a Protective Innate Immune Mechanism in Caenorhabditis elegans. Infection and Immunity. 77 (11), 4983-4989 (2009).
  17. Vander, H., Prabha, V. Evaluation of fertility outcome as a consequence of intravaginal inoculation with sperm-impairing micro-organisms in a mouse model. Journal of Medical Microbiology. 64, Pt_4 344-347 (2015).
  18. Castrillón-Duque, E. X., Suárez, J. P., Maya, W. D. C. Yeast and Fertility: Effects of In Vitro Activity of Candida spp. on Sperm Quality. Journal of Reproduction & Infertility. 19 (1), 49-55 (2018).
  19. Feistel, D. J., et al. A Novel Virulence Phenotype Rapidly Assesses Candida Fungal Pathogenesis in Healthy and Immunocompromised Caenorhabditis elegans Hosts. mSphere. 4 (2), (2019).
  20. Feistel, D. J., Elmostafa, R., Hickman, M. A. Virulence phenotypes result from interactions between pathogen ploidy and genetic background. Ecology and Evolution. 10 (17), 9326-9338 (2020).
  21. Mitchell, B. M., Wu, T. G., Jackson, B. E., Wilhelmus, K. R. Candida albicans Strain-Dependent Virulence and Rim13p-Mediated Filamentation in Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (2), 774-780 (2007).
  22. Altun, Z. F., Hall, D. H. WormAtas Hermaphrodite Handbook - Introduction. WormAtlas. , (2006).
  23. Yuan, X., Mitchell, B. M., Hua, X., Davis, D. A., Wilhelmus, K. R. The RIM101 Signal Transduction Pathway Regulates Candida albicans Virulence during Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (9), 4668-4676 (2010).
  24. Davis, D., Edwards, J. E., Mitchell, A. P., Ibrahim, A. S. Candida albicans RIM101 pH Response Pathway Is Required for Host-Pathogen Interactions. Infection and Immunity. 68 (10), 5953-5959 (2000).
  25. Chamilos, G., et al. Candida albicans Cas5, a Regulator of Cell Wall Integrity, Is Required for Virulence in Murine and Toll Mutant Fly Models. The Journal of Infectious Diseases. 200 (1), 152-157 (2009).
  26. Bruno, V. M., et al. Control of the C. albicans Cell Wall Damage Response by Transcriptional Regulator Cas5. PLoS Pathogens. 2 (3), 21(2006).
  27. Davis, D. Adaptation to environmental pH in Candida albicans and its relation to pathogenesis. Current Genetics. 44 (1), 58(2003).
  28. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A Pathogenesis Assay Using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans Reveals Novel Roles for Yeast AP-1, Yap1, and Host Dual Oxidase BLI-3 in Fungal Pathogenesis. Eukaryotic Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
  29. De, A., Sahu, A. K., Singh, V. Bite size of Caenorhabditis elegans regulates feeding, satiety and development on yeast diet. bioRxiv. , 473256(2018).
  30. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24 (1), 3-9 (2012).
  31. Smith, A. C., Hickman, M. A. Host-Induced Genome Instability Rapidly Generates Phenotypic Variation across Candida albicans Strains and Ploidy States. mSphere. 5 (3), 00433(2020).
  32. Palominos, M. F., Calixto, A. Quantification of Bacteria Residing in Caenorhabditis elegans Intestine. BIO-PROTOCOL. 10 (9), (2020).
  33. Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a Model Organism for Investigating Immunity. Applied and Environmental Microbiology. 78 (7), 2075-2081 (2012).
  34. Liberati, N. T., et al. Requirement for a conserved Toll/interleukin-1 resistance domain protein in the Caenorhabditis elegans immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6593-6598 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

C albicansnicht letale VirulenzInfektionsassaysCaenorhabditis elegansFruchtbarkeitsassayLineage Expansion AssayCandida Infektionenopportunistischer Erregernosokomiale Infektionenvulvovaginale Candidiasisoropharyngeale CandidiasisMinimodellsystemeWachstum der Wirtspopulationgenetischer Hintergrund

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten