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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

I patogeni opportunisti fungini possono causare infezioni pericolose per la vita e infezioni minori, ma i fenotipi non letali vengono spesso ignorati quando si studia la virulenza. Pertanto, abbiamo sviluppato un modello di nematode che monitora sia gli aspetti di sopravvivenza che di riproduzione dell'ospite per studiare la virulenza fungina.

Abstract

Sebbene gli agenti patogeni possano essere mortali per l'uomo, molti di essi causano una serie di tipi di infezione con fenotipi non letali. La Candida albicans, un patogeno fungino opportunista dell'uomo, è la quarta causa più comune di infezioni nosocomiali che si traduce in ~40% di mortalità. Tuttavia, altre infezioni da C. albicans sono meno gravi e raramente letali e includono la candidosi vulvovaginale, che colpisce ~ il 75% delle donne, così come la candidosi orofaringea, che colpisce prevalentemente i neonati, i pazienti affetti da AIDS e i malati di cancro. Mentre i modelli murini sono più frequentemente utilizzati per studiare la patogenesi di C. albicans, questi modelli valutano prevalentemente la sopravvivenza dell'ospite e sono costosi, richiedono tempo e sono limitati nella replicazione. Pertanto, per studiare C. albicans sono stati sviluppati diversi sistemi di mini-modelli, tra cui Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella e Caenorhabditis elegans. Questi mini-modelli sono adatti per lo screening di librerie mutanti o di diversi background genetici di C. albicans. Qui descriviamo due approcci per studiare l'infezione da C. albicans utilizzando C. elegans. Il primo è un test di fecondità che misura la riproduzione dell'ospite e monitora la sopravvivenza dei singoli ospiti. Il secondo è un saggio di espansione del lignaggio che misura come l'infezione da C. albicans influenzi la crescita della popolazione ospite per più generazioni. Insieme, questi saggi forniscono un modo semplice ed economico per valutare rapidamente la virulenza di C. albicans.

Introduzione

La Candida albicans è un patogeno fungino opportunista dell'uomo che risiede in diverse nicchie, tra cui il cavo orale, il tratto gastrointestinalee l'apparato urogenitale. Sebbene tipicamente commensale, C. albicans causa infezioni sia della mucosa che del flusso sanguigno, l'ultima delle quali può essere mortale. La gravità dell'infezione da C. albicans dipende dalla funzione immunitaria dell'ospite, con gli individui immunocompromessi più suscettibili all'infezione rispetto agli individui sani1. Oltre ai fattori correlati all'ospite, C. albicans ha diversi tratti di virulenza che includono ife, formazione di biofilm e produzione di aspartilprotein secretorie (SAP), che funzionano per promuovere l'adesione e l'invasione di C. albicans nelle cellule epiteliali dell'ospite2, e candidalisina, una tossina peptidica citolitica 3,4. Insieme, ciò suggerisce che la virulenza di C. albicans è un fenotipo complesso risultante da un'interazione tra il patogeno e il suo ambiente ospite. Pertanto, lo studio della virulenza è meglio studiato utilizzando organismi modello che fungono da ambienti ospiti, in contrasto con gli approcci in vitro.

Diversi modelli di ospiti, tra cui organismi vertebrati e invertebrati, sono stati sviluppati per studiare l'infezione da C. albicans. Il modello murino, considerato il gold standard, è spesso utilizzato per il suo sistema immunitario adattativo e innato e per la capacità di monitorare la progressione della malattia sia a livello sistemico che in organi specifici5. Tuttavia, ci sono limitazioni significative a questo modello ospite, tra cui i costi di manutenzione, il numero ridotto di prole e la diminuzione della potenza e della riproducibilità associate a campioni di piccole dimensioni5. Pertanto, sono stati sviluppati altri organismi modello più semplici come il pesce zebra (Danio rerio), il moscerino della frutta (Drosophila melanogaster), la falena della cera (Galleria mellonella) e il nematode (Caenorhabditis elegans). Questi organismi modello non mammiferi sono più piccoli, richiedono meno manutenzione in laboratorio e campioni di dimensioni maggiori consentono una maggiore potenza e riproducibilità rispetto ai modelli murini. Ognuno di questi modelli presenta vantaggi e svantaggi specifici che devono essere considerati quando si sceglie un modello di infezione. La G. mellonella offre l'ambiente fisiologicamente più simile all'uomo in quanto può essere coltivata a 37 °C e ha varie cellule fagocitiche7. Inoltre, questo modello consente l'iniezione diretta di un inoculo specifico7. Tuttavia, non esiste un genoma completamente sequenziato e non esiste un metodo stabilito per creare ceppi mutanti. Simile a G. mellonella, il modello D. rerio consente l'iniezione diretta di un inoculo specifico 5,7. Ha anche un sistema immunitario adattativo e innato5, che è unico per questo modello non mammifero, ma richiede vasche di riproduzione acquatiche per essere mantenuto. D. melanogaster e C. elegans hanno vantaggi e svantaggi simili, che includono genomi completamente sequenziati che sono facili da manipolare e generano ceppi mutanti7 ma non hanno immunità adattativa o citochine7. Di tutti questi modelli non mammiferi, C. elegans ha il ciclo di vita più rapido, si autofeconda per generare un gran numero di prole geneticamente identica ed è il più suscettibile a schermi su larga scala 6,7,8. C. elegans si è dimostrato estremamente potente per lo screening ad alto rendimento di farmaci antifungini 9,10, per la caratterizzazione dei fattori di virulenza7 e per l'identificazione delle reti di difesa dell'ospite specifiche per C. albicans 11. Il sistema immunitario innato in C. elegans ha molteplici componenti che sono altamente conservati negli esseri umani12. Le difese innate dell'ospite includono la produzione di peptidi antimicrobici13 (AMP) e specie reattive dell'ossigeno 14,15,16.

La gravità dell'infezione da C. albicans è misurata prevalentemente in base alla sopravvivenza dell'ospite, ma non è in grado di catturare fenotipi di virulenza non letali. Un aspetto spesso trascurato della fitness dell'ospite è la riproduzione, ma diversi studi suggeriscono che C. albicans influisce sulla riproduzione riducendo la vitalità degli spermatozoi17,18, suggerendo che questo potrebbe essere un aspetto importante da studiare della fitness dell'ospite. Pertanto, l'impatto dell'infezione da C. albicans sulla fecondità dell'ospite è un modo utile per studiare i fenotipi di virulenza non letali. Abbiamo sviluppato due test di infezione utilizzando C. elegans per studiare sia i fenotipi di sopravvivenza che quelli di riproduzione in ospiti sani19,20. Qui descriviamo sia i saggi di fecondità che quelli di espansione del lignaggio. La fecondità misura sia la progenie prodotta che la sopravvivenza dei singoli ospiti, mentre l'espansione del lignaggio valuta le conseguenze dell'infezione su tre generazioni di ospiti. Dimostriamo come questi saggi possano essere utilizzati per lo screening dei mutanti di delezione di C. albicans per catturare differenze sia drammatiche che sottili nei fenotipi di virulenza letali e non letali.

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Protocollo

1. Fasi preparatorie degli esperimenti

  1. Preparazione delle colture di C. albicans ed Escherichia coli
    NOTA: I ceppi utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella 1.
    1. Mantenere i ceppi di C. albicans ed E. coli come scorte di glicerolo a -80 °C.
    2. Usando uno stuzzicadenti sterile, strisciare il C. albicans desiderato, filtrare sul peptone di lievito solido destrosio (YPD) (1% estratto di lievito, 2% bactopeptone, 2% glucosio, 1,5% agar, 0,004% adenina, 0,008% uridina) e crescere per una notte a 30 °C.
      NOTA: Se il ceppo di C. albicans è auxotrofico, integrare il terreno con gli amminoacidi necessari.
    3. Utilizzando un'ansa sterile o uno stuzzicadenti, inoculare una singola colonia di C. albicans in 2 ml di YPD liquido. Incubare a 30 °C agitando per 24 ore.
    4. Utilizzando uno stuzzicadenti sterile, strisciare E. coli (OP50) su piastre di agar Luria Broth (LB; 10 g/L di triptone, 5 g/L di estratto di lievito, 10 g/L di NaCl, 15 g/L di agar). Incubare per una notte a 30 °C.
    5. Inoculare una singola colonia di OP50 in 50 mL di LB. Incubare a 30 °C agitando per una notte.
  2. Preparazione dei terreni di crescita dei nematodi
    1. In un pallone da 2 litri, aggiungere 29 g di polvere di terreno di crescita per nematodi (NGM; 17,5 g/L di agar, 3,0 g/L di cloruro di sodio, 2,5 g/L di peptone, 0,005 g/L di colesterolo) a 1 litro di acqua e mescolare con una barra di agitazione.
    2. Per inibire la crescita eccessiva di E. coli e consentire la proliferazione di C. albicans, integrare NGM con 0,2 g/L di streptomicina solfato dopo autoclave.
      NOTA: Se si utilizza NGM per il mantenimento dei nematodi, la streptomicina non è necessaria.
  3. Mantenimento delle popolazioni di nematodi
    1. Distribuire 300 μl di coltura di E. coli durante la notte su piastre di agar NGM preparate utilizzando uno spandiconcime metallico. Questa tecnica sarà indicata come semina.
    2. Lasciare asciugare le piastre a temperatura ambiente (RT). Coltivare le piastre durante la notte a 30 °C.
    3. Mantenere la popolazione di nematodi tagliando ogni 3-4 giorni su una piastra NGM appena seminata con E. coli. Conservare a 20 °C. Il chunking è una tecnica utilizzata per trasferire rapidamente una popolazione casuale di nematodi su una piastra appena seminata, che consente la proliferazione delle popolazioni. Per fare ciò, utilizzare una spatola sterile per tagliare un piccolo quadrato (1 x 1 pollice) dalla piastra di agar NGM. Trasferire con cura il quadrato su una nuova piastra NGM seminata con il lato con i nematodi rivolto verso il basso sul nuovo agar8.
      NOTA: C. elegans mantenuto a 20 °C produrrà prole ~48 ore dopo, il che è utile da considerare quando si sincronizza una popolazione di nematodi. C. elegans mantenuto a 25 °C si svilupperà e si riprodurrà più velocemente e le popolazioni mantenute a 15 °C avranno una crescita più lenta.
  4. Sincronizzazione della popolazione di nematodi
    1. Iniziare con una popolazione di nematodi esistente mantenuta su NGM/OP50.
    2. Pipettare ~3 mL di tampone M9 sulla piastra NGM contenente i nematodi. Lavare le uova dei nematodi dal piatto e usare delicatamente la punta della pipetta per raschiare le uova dall'agar (tendono ad attaccarsi). Utilizzando una pipetta P1000, trasferire il liquido contenente uova e vermi in una provetta conica da 15 mL. Per valutare il numero di uova ancora sulla piastra, utilizzare un microscopio da dissezione per osservare l'agar.
    3. Centrifugare conica per 2 min a 279 x g e RT.
    4. Rimuovere il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet del nematode.
    5. Aggiungere 3 ml di soluzione di candeggina al 25% ("ATTENZIONE" durante la manipolazione).
    6. Capovolgere il tubo per 2 minuti. Controlla che i nematodi siano morti usando il microscopio da dissezione: saranno dritti e non mobili.
      NOTA: Questo ucciderà solo i nematodi esistenti. L'integrità delle uova non sarà compromessa.
    7. Centrifugare per 2 minuti a 279 x g e RT.
    8. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 3 mL M9.
    9. Centrifugare per 2 minuti a 279 x g e RT.
    10. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 300 μl di M9.
    11. Utilizzando un microscopio da dissezione, controllare la concentrazione di uova pipettando 5 μl di uova su una piccola piastra di Petri. La concentrazione ideale dovrebbe essere tra 20-100 uova. Se la coltura è troppo diluita, concentrare la soluzione mediante centrifugazione e rimozione del liquido in eccesso. Se la coltura è troppo concentrata, aggiungere altro M9 fino a raggiungere la concentrazione desiderata.
  5. Preparare le colture di C. albicans ed E. coli per l'infezione da nematodi (semina).
    1. Prepara una soluzione in bianco. In una cuvetta, combinare 900 μL di ddH2O e 100 μL di YPD liquido.
    2. Inserire la cuvetta nello spettrofotometro. Impostare la lunghezza d'onda a 600 nanometri utilizzando la freccia su. Fare clic sul pulsante "0 ABS 100% T" per impostare la soluzione vuota.
    3. In una nuova cuvetta, combinare 900 μL di ddH2O e 100 μL di coltura di lievito durante la notte. Estrarre la soluzione in bianco dallo spettrofotometro e aggiungere la cuvetta contenente la soluzione di lievito. Registrare la densità ottica mostrata sullo schermo (non premere alcun pulsante). Moltiplicare la lettura per 10 (la soluzione di lievito misurata era una diluizione di 1 su 10).
    4. Normalizzare la coltura a 3,0 OD600/mL con ddH2O in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. 1 OD600 corrisponde a circa 3 x 10-7 CFU/mL21.
      NOTA: Se la lettura di OD600 è 6,7, 3 OD/6,7 OD= 0,447 mL, aggiungere 447 μL di coltura di C. albicans alla provetta per microcentrifuga. Centrifugare alla massima velocità (16, 873 x g) per 30 s. Rimuovere il surnatante e risospendere in 1 mL di ddH2O.
    5. Trasferire la coltura di E. coli durante la notte in una provetta conica da 50 mL.
    6. Centrifugare la coltura a 279 x g per 2 minuti a RT.
    7. Aspirare la maggior parte del surnatante, lasciando ~1 mL.
    8. Risospendere il pellet nel surnatante rimanente e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL prepesata.
    9. Far girare la provetta della microcentrifuga alla massima velocità per 30 s.
    10. Utilizzando una pipetta p1000, rimuovere il surnatante e pesare il pellet finale.
    11. Diluire E. coli a 200 mg/mL in ddH2O.
    12. Utilizzare i calcoli del mix master (Tabella 2) e scalare in modo appropriato.

2. Dosaggio della fecondità

NOTA: I dati rappresentativi sono mostrati nella Tabella supplementare 1 e uno schema è mostrato nella Figura 1A.

  1. Ottenere o preparare quanto segue: piastre di Petri da 35 mm x 10 mm, NGM integrato con 0,2 g/L di streptomicina solfato, coltura di E. coli OP50, LB, coltura di C. albicans , YPD, Wire Pick, tampone M9 (3,0 g/L KH2PO4, 6,0 g/L Na2HPO4, 0,5 g/L NaCl, 1,0 g/L NH4Cl), Provette coniche da 15 mL.
    Due giorni prima dell'esperimento
  2. Inoculare i ceppi di C. albicans in 2 mL di YPD ed E. coli (OP50) in 50 mL di LB e crescere per una notte a 30 °C.
  3. Preparare piastre di Petri da 35 mm x 10 mm con NGM integrato con 0,2 g/L di streptomicina solfato. Il numero di piastre preparate dovrebbe durare per l'intero esperimento. Il numero raccomandato di repliche è di 10 per trattamento. Per 10 repliche verranno utilizzate 70 lastre. 1 L di NGM produrrà ~250 lastre.
    Un giorno prima dell'esperimento
  4. Seminare piastre di agar NGM da 35 mm x 10 mm integrate con streptomicina per il giorno 0, il giorno 2 e il giorno 3 secondo il protocollo di semina descritto sopra con la concentrazione del mastermix (Tabella 2). Pipettare la quantità appropriata di mastermix al centro della piastra. La diffusione della coltura non è necessaria perché un singolo punto di crescita microbica è sufficiente per l'alimentazione dell'ospite e ci consente di identificare facilmente gli ospiti al di fuori del seme. Incubare le piastre per una notte a RT.
    NOTA: La mastermix del giorno 0 contiene 50 μl di "seme" per replica per ogni trattamento sperimentale. I giorni 2-7 includono 10 μL di "seme" per replica per ogni trattamento sperimentale. Non esiste una piastra del giorno 1 perché i nematodi raggiungeranno lo stadio L4 48 ore dopo essere stati sincronizzati su una piastra del giorno 0. Una volta raggiunto L4, i singoli nematodi verranno trasferiti alle piastre del giorno 2.
Per 1 replicaCondizione di controllo di E. coli (OP50)Condizione di trattamento di C. albicans & E. coli (OP50)
OP50H2OTotaleOP50C. albicansH2OTotale
Giorno 06.25 ul43.75 ul50 ul6.25 ul1.25 ul42.5 ul50 ul
Giorni 2-71.25 ul8.75 ul10 ul1.25 ul.25 ul8.5 ul10 ul

Tabella 2: Mastermix di colture di E. coli e C. albicans necessari per infettare i nematodi per il test di fecondità.

Giorno dell'esperimento (Giorno 0)

  1. Sincronizzare i nematodi e le piastre ~50 uova su ogni replica del giorno 0 delle piastre di controllo (solo OP50) e delle piastre di trattamento (C. albicans + OP50). Incubare a 20 °C per 48 h.
    Giorno 2
  2. Trasferisci un singolo nematode L4 prelevandone8 dalla piastra del Giorno 0 a ciascuna delle piastre di semina del Giorno 2 replicate. Gli ospiti L4 possono essere identificati da una piccola tasca al centro del lato dorsale del loro corpo22. Trasferire i nematodi nati e maturati dallo stesso tipo di piastra seminata (ad esempio, i nematodi L4 dalle piastre di controllo D0 devono essere trasferiti alle piastre di controllo del giorno 2).
  3. Inoculare le colture di C. albicans necessarie in 2 mL di YPD ed E. coli (ceppo OP50) in 50 mL di LB.
    Giorno 3
  4. Trasferire i nematodi dalle piastre del giorno 2 alle piastre seminate del giorno 3, tenendo traccia di ciascuna replica (ad esempio, la replica A del giorno 2 deve essere spostata nella piastra della replica A del giorno 3).
  5. Incubare le piastre del giorno 2 (contenenti solo uova) e del giorno 3 (contenenti l'unico adulto) a 20 °C per 24 ore.
  6. Seme NGM da 35 mm x 10 mm integrato con piastre per streptomicina per i giorni 4 e 5 utilizzando 10 μL di mastermix per piastra (Tabella 2) e incubare le piastre a RT per 24 ore.
    Giorno 4
  7. Trasferisci i nematodi dalle piastre del giorno 3 alle piastre seminate del giorno 4.
  8. Incubare le piastre del giorno 3 e del giorno 4 a 20 °C per 24 ore.
  9. Utilizzando un cannocchiale da dissezione, contare la progenie vitale per ogni piastra del Giorno 2. Notare eventuali repliche che sono morte o non sono più sulla lastra (censurate). Una volta registrato il numero di progenie, scartare le piastre del giorno 2.
    NOTA: Censurato si riferisce ai nematodi che scompaiono sulla piastra. Ciò può verificarsi quando i nematodi strisciano fuori dalla piastra. Sebbene meno comuni durante la finestra di 24 ore, le carcasse dei nematodi morti si disintegrano nell'agar, con conseguente censura. I dati censurati non sono inclusi nell'analisi finale dei dati sulla progenie e sulla sopravvivenza.
  10. Inoculare nuove colture di ceppi di C. albicans in 2 mL di YPD ed E. coli (OP50) in 50 mL di LB.
    Giorno 5
  11. Trasferire i nematodi dalle piastre del giorno 4 alle piastre seminate del giorno 5.
  12. Incubare le piastre del giorno 4 e del giorno 5 a 20 °C per 24 ore.
  13. Conta la progenie vitale per ogni piastra del giorno 3. Notare eventuali repliche che sono morte o non sono più sulla lastra (censurate). Una volta registrato il numero di prole, scartare le piastre del giorno 3.
  14. Seme NGM 35 mm x 10 mm integrato con piastre di streptomicina per i giorni 6 e 7 utilizzando 10 μL di mastermix per piastra (Tabella 2) e incubare le piastre a temperatura ambiente per 24 ore.
    Giorno 6
  15. Trasferire i nematodi dalle piastre del giorno 5 alle piastre seminate del giorno 6.
  16. Incubare le piastre Day 5 e Day 6 a 20 °C per 24 h.
  17. Conta la progenie vitale per ogni piastra del giorno 4. Notare eventuali repliche che sono morte o non sono più sulla lastra (censurate). Una volta registrato il numero di prole, scartare le piastre del giorno 4.
    Giorno 7
  18. Trasferire i nematodi dalle piastre del giorno 6 alle piastre seminate del giorno 7.
  19. Incubare le piastre Day 6 e Day 7 a 20 °C per 24 h.
  20. Conta la progenie vitale per ogni piatto del giorno 5. Notare eventuali repliche che sono morte o non sono più sulla lastra (censurate). Una volta registrato il numero di prole, scartare le piastre del giorno 5.
    Giorno 8
  21. Conta la progenie vitale per ogni piatto del giorno 6. Notare eventuali repliche che sono morte o non sono più sulla lastra (censurate). Una volta registrato il numero di prole, scartare le piastre del giorno 6.
    Giorno 9
  22. Conta la progenie vitale per ogni piatto del giorno 7. Non contare il nematode più grande (genitore). Notare eventuali repliche che sono morte o non sono più sulla lastra (censurate). Una volta registrato il numero di prole, scartare le tavole del giorno 7.
    NOTA: Questo test può essere utilizzato anche per valutare la sopravvivenza. Registra quando ogni nematode è morto. Alla fine dell'esperimento, la percentuale di nematodi sopravvissuti nell'esperimento di sette giorni può essere confrontata per ciascun trattamento. I nematodi a volte strisciano via dalla fonte di cibo/agente patogeno e cercano di arrampicarsi sui vetrini della piastra di Petri. Controllare tutte le aree della piastra prima di andare avanti. I nematodi morti generalmente lasciano dietro di sé una carcassa. Censura qualsiasi nematode che non può essere localizzato e non contare quel nematode come morto. Non includere dati censurati nell'analisi finale della progenie e della sopravvivenza.
  23. Analizza i dati per le dimensioni della covata e la riproduzione tardiva utilizzando l'ANOVA unidirezionale o Kruskal-Wallis, a seconda della normalità dei set di dati, nonché i test multipli post-hoc di Tukey/Dunn per identificare differenze significative tra i gruppi di trattamento utilizzando il software GraphPad Prism. Rileva le differenze tra le curve di sopravvivenza utilizzando il test del rango logaritmico di Wilcoxon.

3. Saggio di espansione del lignaggio

NOTA: I dati rappresentativi sono mostrati nella Tabella 2 supplementare e uno schema è mostrato nella Figura 2A.

  1. Ottenere o preparare quanto segue: piastre di Petri da 100 mm x 15 mm contenenti agar NGM integrate con 0,2 g/L di streptomicina solfato, colture di E. coli OP50, colture di LB, colture di C. albicans , YPD, tampone M9, plettro, provette coniche da 15 mL.
    Giorno -2
  2. Inoculare i ceppi di C. albicans in 2 mL di YPD ed E. coli (OP50) in 50 mL di LB e crescere per una notte a 30 °C.
    Giorno -1
  3. Semina piastre di agar NGM da 100 mm x 15 mm integrate con streptomicina con 300 μL di mastermix per piastra (Tabella 3). Stendere il mastermix sulla piastra utilizzando uno spatola metallica sterile. Incubare le piastre per una notte a 30 °C. Si raccomandano sei repliche per trattamento. Pertanto, preparare sette piastre (una piastra per nematodi sincronizzati, sei piastre per ogni nematode adulto) per ogni trattamento.
Condizione di controllo di E. coli (OP50)C. albicans & E. coli (OP50). condizione di trattamento
Per 1 replicaOP50H2OTotaleOP50C. albicansH2OTotale
1.25 ul8.75 ul10 ul37.5 ul7.5 ul255 ul300 ul

Tabella 3: Mastermix dei volumi di colture di E. coli e C. albicans necessari per infettare i nematodi per il saggio di espansione del lignaggio.

Crescita della popolazione di nematodi: Giorno 0

  1. Sincronizzare i nematodi e preparare 10-25 uova su un'unica piastra per ogni controllo (solo OP50) e trattamento (C. albicans + OP50) e incubare a 20 °C per 48 ore.
    Giorno 2:
  2. Trasferire un singolo verme L4 da ciascuna piastra di controllo e trattamento del giorno 0 alle piastre seminate dello stesso trattamento. Gli ospiti L4 possono essere identificati da una piccola tasca al centro del lato dorsale del loro corpo22.
  3. Incubare a 20 °C per 5 giorni (per un totale di una settimana dopo la sincronizzazione).
    Giorno 7:
  4. Utilizzando una pipetta p1000, lavare l'intera popolazione di nematodi da ciascuna piastra utilizzando 5 mL di tampone M9 e trasferire in una provetta conica da 15 mL.
  5. Conservare a 4 °C per 1 ora per consentire ai nematodi di depositarsi e facilitare il conteggio.
  6. Diluire ciascun conico al volume finale di 10 mL con tampone M9.
  7. Per ogni replica biologica, contare il numero di nematodi in un'aliquota di 20 μL. Ripetere l'operazione per ottenere 6 repliche tecniche per ogni replica biologica. Calcola a ritroso per determinare la dimensione totale della popolazione. Se i campioni sono troppo diluiti (cioè meno di 10 nematodi per campione), concentrare la popolazione in un volume più piccolo di tampone M9.
    NOTA: La centrifugazione di nematodi vivi non danneggerà i nematodi.
    Esempio di calcolo:
    70 host = X (host totali)
    20 μl (aliquota) 10.000μl (volume totale)
  8. Analizza i dati per l'espansione del lignaggio utilizzando l'ANOVA unidirezionale o Kruskal-Wallis, a seconda della normalità dei set di dati, nonché i test multipli post-hoc di Tukey/Dunn per identificare differenze significative tra i gruppi di trattamento utilizzando il software GraphPad Prism.

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Risultati

Qui presentiamo due saggi che misurano la virulenza di C. albicans come fenotipo non letale utilizzando C. elegans come modello di infezione. Il primo test, la fecondità, monitora l'impatto dell'infezione da C. albicans sui singoli ospiti per la produzione e la sopravvivenza della progenie. Il secondo test, l'espansione del lignaggio, misura il modo in cui l'infezione da C. albicans influisce sulla crescita de...

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Discussione

Qui, presentiamo due semplici saggi che misurano la virulenza fungina. Entrambi i test sfruttano C. elegans come sistema ospite che include il monitoraggio dei fenotipi dell'ospite letali e non letali. Ad esempio, i test di fecondità indagano il successo riproduttivo dei singoli ospiti infetti, misurando al contempo la sopravvivenza individuale. Il monitoraggio giornaliero fornisce non solo la dimensione totale della covata, ma anche i tempi riproduttivi e l'ora della morte. Il...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno interessi concorrenti da rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo Dorian Feistel, Rema Elmostafa e McKenna Penley per la loro assistenza nello sviluppo dei nostri saggi e della raccolta dei dati. Questa ricerca è supportata da NSF DEB-1943415 (MAH).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL eppendorf microtubes 3810XMillipore SigmaZ606340
100 mm x 15 mm petri platesSigma-AldrichP5856-500EA
15 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-959-70C
50 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-432-22
AdenineMillipore SigmaA8626
Agar (granulated, bacterilogical grade)Apex BioResearch Produces20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)Genesee Scientific59-1M32P
Ammonium ChlorideMillipore Sigma254134
Bacterial Cell SpreaderSP Scienceware21TP50
BactoPeptoneFisher BioReagantsBP1420-500
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)FIsherBrand14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)Nikon Instrument Inc.
E. coliCaenorhabditis Genetics CenterOP50
GlucoseMillipore Sigma50-99-7
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)Falcon353001
Metal SpatulaSP Scienceware8TL24
Nematode Growth Media (NGM)Dot ScientificDSN81800-500
Potassium Phosphate monobasicSigmaP0662-500G
Sodium ChlorideFisher ScientificBP358-1
Sodium PhosphateFisher ScientificBP332-500
Streptomycin SulfateThermo-Fisher Scientific11860038
TryptoneMillipore Sigma91079-40-2
UridineMillipore SigmaU3750
Wildtype C. elegansCaenorhabditis Genetics CenterN2
Yeast ExtractMillipore Sigma8013-01-2

Riferimenti

  1. Underhill, D. M., Iliev, I. D. The mycobiota: interactions between commensal fungi and the host immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (6), (2014).
  2. Ibrahim, A. S., Filler, S. G., Sanglard, D., Edwards, J. E., Hube, B. Secreted Aspartyl Proteinases and Interactions of Candida albicans with Human Endothelial Cells. Infection and Immunity. 66 (6), 3003-3005 (1998).
  3. Calderone, R. A., Fonzi, W. A. Virulence factors of Candida albicans. Trends in Microbiology. 9 (7), 327-335 (2001).
  4. Mayer, F. L., Wilson, D., Hube, B. Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence. 4 (2), 119-128 (2013).
  5. Chin, V., Lee, T., Rusliza, B., Chong, P. Dissecting Candida albicans Infection from the Perspective of C. albicans Virulence and Omics Approaches on Host-Pathogen Interaction: A Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (10), 1643(2016).
  6. Elkabti, A., Issi, L., Rao, R. Caenorhabditis elegans as a Model Host to Monitor the Candida Infection Processes. Journal of Fungi. 4 (4), 123(2018).
  7. Arvanitis, M., Glavis-Bloom, J., Mylonakis, E. Invertebrate models of fungal infection. Biochimica et biophysica acta. 1832 (9), 1378-1383 (2013).
  8. Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. Journal of Visualized Experiments. (128), e56487(2017).
  9. Breger, J., et al. Antifungal Chemical Compounds Identified Using a C. elegans Pathogenicity Assay. PLoS Pathogens. 3 (2), 18(2007).
  10. Okoli, I., et al. Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay. PloS one. 4 (9), 7025(2009).
  11. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans Infection of Caenorhabditis elegans Induces Antifungal Immune Defenses. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002074(2011).
  12. Kim, D. H., Ausubel, F. M. Evolutionary perspectives on innate immunity from the study of Caenorhabditis elegans. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 4-10 (2005).
  13. Kim, D. H., et al. A Conserved p38 MAP Kinase Pathway in Caenorhabditis elegans Innate Immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  14. van der Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generated Reactive Oxygen Species Trigger Protective SKN-1 Activity via p38 MAPK Signaling during Infection in C. elegans. PLoS Pathogens. 7 (12), 1002453(2011).
  15. van der Hoeven, R., Cruz, M. R., Chávez, V., Garsin, D. A. Localization of the Dual Oxidase BLI-3 and Characterization of Its NADPH Oxidase Domain during Infection of Caenorhabditis elegans. PLOS ONE. 10 (4), 0124091(2015).
  16. Chávez, V., Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generates Reactive Oxygen Species as a Protective Innate Immune Mechanism in Caenorhabditis elegans. Infection and Immunity. 77 (11), 4983-4989 (2009).
  17. Vander, H., Prabha, V. Evaluation of fertility outcome as a consequence of intravaginal inoculation with sperm-impairing micro-organisms in a mouse model. Journal of Medical Microbiology. 64, Pt_4 344-347 (2015).
  18. Castrillón-Duque, E. X., Suárez, J. P., Maya, W. D. C. Yeast and Fertility: Effects of In Vitro Activity of Candida spp. on Sperm Quality. Journal of Reproduction & Infertility. 19 (1), 49-55 (2018).
  19. Feistel, D. J., et al. A Novel Virulence Phenotype Rapidly Assesses Candida Fungal Pathogenesis in Healthy and Immunocompromised Caenorhabditis elegans Hosts. mSphere. 4 (2), (2019).
  20. Feistel, D. J., Elmostafa, R., Hickman, M. A. Virulence phenotypes result from interactions between pathogen ploidy and genetic background. Ecology and Evolution. 10 (17), 9326-9338 (2020).
  21. Mitchell, B. M., Wu, T. G., Jackson, B. E., Wilhelmus, K. R. Candida albicans Strain-Dependent Virulence and Rim13p-Mediated Filamentation in Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (2), 774-780 (2007).
  22. Altun, Z. F., Hall, D. H. WormAtas Hermaphrodite Handbook - Introduction. WormAtlas. , (2006).
  23. Yuan, X., Mitchell, B. M., Hua, X., Davis, D. A., Wilhelmus, K. R. The RIM101 Signal Transduction Pathway Regulates Candida albicans Virulence during Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (9), 4668-4676 (2010).
  24. Davis, D., Edwards, J. E., Mitchell, A. P., Ibrahim, A. S. Candida albicans RIM101 pH Response Pathway Is Required for Host-Pathogen Interactions. Infection and Immunity. 68 (10), 5953-5959 (2000).
  25. Chamilos, G., et al. Candida albicans Cas5, a Regulator of Cell Wall Integrity, Is Required for Virulence in Murine and Toll Mutant Fly Models. The Journal of Infectious Diseases. 200 (1), 152-157 (2009).
  26. Bruno, V. M., et al. Control of the C. albicans Cell Wall Damage Response by Transcriptional Regulator Cas5. PLoS Pathogens. 2 (3), 21(2006).
  27. Davis, D. Adaptation to environmental pH in Candida albicans and its relation to pathogenesis. Current Genetics. 44 (1), 58(2003).
  28. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A Pathogenesis Assay Using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans Reveals Novel Roles for Yeast AP-1, Yap1, and Host Dual Oxidase BLI-3 in Fungal Pathogenesis. Eukaryotic Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
  29. De, A., Sahu, A. K., Singh, V. Bite size of Caenorhabditis elegans regulates feeding, satiety and development on yeast diet. bioRxiv. , 473256(2018).
  30. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24 (1), 3-9 (2012).
  31. Smith, A. C., Hickman, M. A. Host-Induced Genome Instability Rapidly Generates Phenotypic Variation across Candida albicans Strains and Ploidy States. mSphere. 5 (3), 00433(2020).
  32. Palominos, M. F., Calixto, A. Quantification of Bacteria Residing in Caenorhabditis elegans Intestine. BIO-PROTOCOL. 10 (9), (2020).
  33. Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a Model Organism for Investigating Immunity. Applied and Environmental Microbiology. 78 (7), 2075-2081 (2012).
  34. Liberati, N. T., et al. Requirement for a conserved Toll/interleukin-1 resistance domain protein in the Caenorhabditis elegans immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6593-6598 (2004).

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