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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Les agents pathogènes opportunistes fongiques peuvent provoquer des infections potentiellement mortelles ou mineures, mais les phénotypes non létaux sont souvent ignorés lors de l’étude de la virulence. Par conséquent, nous avons développé un modèle de nématode qui surveille à la fois les aspects de survie et de reproduction de l’hôte afin d’étudier la virulence fongique.

Résumé

Bien que les agents pathogènes puissent être mortels pour l’homme, beaucoup d’entre eux provoquent une gamme de types d’infections avec des phénotypes non mortels. Candida albicans, un agent pathogène fongique opportuniste de l’homme, est la quatrième cause la plus fréquente d’infections nosocomiales, ce qui entraîne une mortalité de ~40 %. Cependant, d’autres infections à C. albicans sont moins graves et rarement mortelles et comprennent la candidose vulvo-vaginale, affectant ~75 % des femmes, ainsi que la candidose oropharyngée, affectant principalement les nourrissons, les patients atteints du sida et les patients atteints de cancer. Bien que les modèles murins soient le plus souvent utilisés pour étudier la pathogenèse de C. albicans , ces modèles évaluent principalement la survie de l’hôte et sont coûteux, longs et limités dans leur réplication. Par conséquent, plusieurs mini-systèmes modèles, y compris Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria melonella et Caenorhabditis elegans, ont été développés pour étudier C. albicans. Ces mini-modèles sont bien adaptés au criblage de banques de mutants ou de divers antécédents génétiques de C. albicans. Nous décrivons ici deux approches pour étudier l’infection à C. albicans à l’aide de C. elegans. Le premier est un test de fécondité qui mesure la reproduction de l’hôte et surveille la survie des hôtes individuels. Le second est un essai d’expansion de la lignée qui mesure comment l’infection à C. albicans affecte la croissance de la population hôte sur plusieurs générations. Ensemble, ces tests constituent un moyen simple et rentable d’évaluer rapidement la virulence de C. albicans .

Introduction

Candida albicans est un agent pathogène fongique opportuniste de l’homme résidant dans différentes niches, notamment la cavité buccale, les voies gastro-intestinales et urogénitales1. Bien qu’il soit généralement commensaux, C. albicans provoque des infections des muqueuses et du sang, ces dernières pouvant être mortelles. La gravité de l’infection à C. albicans dépend de la fonction immunitaire de l’hôte, les individus immunodéprimés étant plus sensibles à l’infection que les individus en bonne santé1. En plus des facteurs liés à l’hôte, C. albicans présente plusieurs traits de virulence, notamment des hyphes, la formation d’un biofilm et la production de protéinases aspartyl sécrétoires (SAP), qui favorisent l’adhésion et l’invasion de C. albicans dans les cellules épithéliales de l’hôte2, et la candidalysine, une toxine peptidique cytolytique 3,4. L’ensemble de ces éléments suggère que la virulence de C. albicans est un phénotype complexe résultant d’une interaction entre l’agent pathogène et son environnement hôte. Par conséquent, il est préférable d’étudier la virulence à l’aide d’organismes modèles qui servent d’environnements hôtes, contrairement aux approches in vitro.

Plusieurs modèles d’hôtes, y compris des organismes vertébrés et invertébrés, ont été développés pour étudier l’infection à C. albicans. Le modèle murin, considéré comme l’étalon-or, est souvent utilisé pour son système immunitaire adaptatif et inné, ainsi que pour sa capacité à surveiller la progression de la maladie à la fois systémiquement et dans des organes spécifiques5. Cependant, ce modèle hôte présente des limites importantes, notamment les coûts de maintenance, le petit nombre de descendants et la diminution de la puissance et de la reproductibilité associées à la petite taille des échantillons5. Par conséquent, d’autres organismes modèles plus simples tels que le poisson-zèbre (Danio rerio), la mouche des fruits (Drosophila melanogaster), la teigne de la cire (Galleria mellonella) et le nématode (Caenorhabditis elegans) ont été développés. Ces organismes modèles non mammifères sont plus petits, nécessitent moins d’entretien en laboratoire et des échantillons de plus grande taille permettent une plus grande puissance et reproductibilité par rapport aux modèles murins. Chacun de ces modèles présente des avantages et des inconvénients spécifiques qui doivent être pris en compte lors du choix d’un modèle d’infection. G. mellonella offre l’environnement physiologiquement le plus similaire à celui de l’homme car il peut être cultivé à 37 °C et possède diverses cellules phagocytaires7. De plus, ce modèle permet l’injection directe d’un inoculum spécifique7. Cependant, il n’existe pas de génome entièrement séquencé et aucune méthode établie pour créer des souches mutantes. Semblable à G. mellonella, le modèle D. rerio permet l’injection directe d’un inoculum spécifique 5,7. Il possède également un système immunitaire adaptatif et inné5, ce qui est unique à ce modèle non mammifère, mais nécessite des bassins de reproduction aquatiques pour être entretenu. D. melanogaster et C. elegans présentent des avantages et des inconvénients similaires, notamment des génomes entièrement séquencés qui sont faciles à manipuler et génèrent des souches mutantes7 mais n’ont pas d’immunité adaptative ni de cytokines7. De tous ces modèles non mammifères, C. elegans a le cycle de vie le plus rapide, s’autoféconde pour générer un grand nombre de descendants génétiquement identiques, et est le plus susceptible d’être dépisté à grande échelle 6,7,8. C. elegans s’est avéré extrêmement puissant pour le criblage à haut débit de médicaments antifongiques 9,10, la caractérisation des facteurs de virulence7 et l’identification des réseaux de défense de l’hôte spécifiques de C. albicans 11. Le système immunitaire inné de C. elegans comporte de multiples composants qui sont hautement conservés chez l’homme12. Les défenses innées de l’hôte comprennent la production de peptides antimicrobiens13 (AMP) et d’espèces réactives de l’oxygène 14,15,16.

La gravité de l’infection à C. albicans est principalement mesurée par la survie de l’hôte, mais ne peut pas saisir les phénotypes de virulence non létales. La reproduction est un aspect souvent négligé de la valeur adaptative de l’hôte, mais plusieurs études suggèrent que C. albicans a un impact sur la reproduction en réduisant la viabilité des spermatozoïdes17,18, ce qui suggère qu’il peut s’agir d’un aspect important de la valeur adaptative de l’hôte à étudier. Par conséquent, l’impact de l’infection à C. albicans sur la fécondité de l’hôte est un moyen utile d’étudier les phénotypes de virulence non létal. Nous avons mis au point deux tests d’infection utilisant C. elegans pour étudier les phénotypes de survie et de reproduction chez des hôtes sains19,20. Nous décrivons ici à la fois les tests de fécondité et d’expansion de lignée. La fécondité mesure à la fois la progéniture produite et la survie d’hôtes uniques, et l’expansion de la lignée évalue les conséquences de l’infection sur trois générations d’hôtes. Nous démontrons comment ces tests peuvent être utilisés pour cribler les mutants de délétion de C. albicans afin de capturer des différences spectaculaires et subtiles dans les phénotypes de virulence létale et non létale.

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Protocole

1. Étapes préparatoires aux expériences

  1. Préparation des cultures de C. albicans et d’Escherichia coli
    REMARQUE : Les souches utilisées dans cette étude sont énumérées dans le tableau 1.
    1. Maintenir les souches de C. albicans et d’E. coli sous forme de stocks de glycérol à −80 °C.
    2. À l’aide d’un cure-dent stérile, striez la sérision souhaitée de C. albicans sur du dextrose peptone de levure solide (YPD) (1 % d’extrait de levure, 2 % de bactopeptone, 2 % de glucose, 1,5 % d’agar-agar, 0,004 % d’adénine, 0,008 % d’uridine) et faites pousser toute la nuit à 30 °C.
      REMARQUE : Si la souche de C. albicans est auxotrophe, compléter le milieu avec les acides aminés nécessaires.
    3. À l’aide d’une anse stérile ou d’un cure-dent, inoculer une seule colonie de C. albicans dans 2 mL de YPD liquide. Incuber à 30 °C en secouant pendant 24 h.
    4. À l’aide d’un cure-dent stérile, étalez E. coli (OP50) sur des plaques de gélose contenant du bouillon Luria (LB ; 10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure, 10 g/L de NaCl, 15 g/L d’agar). Incuber toute la nuit à 30 °C.
    5. Inoculer une seule colonie d’OP50 dans 50 mL de LB. Incuber à 30 °C en agitant pendant la nuit.
  2. Préparation du milieu de croissance des nématodes
    1. Dans une fiole de 2 L, ajouter 29 g de poudre de milieu de croissance des nématodes (NGM ; 17,5 g/L de gélose, 3,0 g/L de chlorure de sodium, 2,5 g/L de peptone, 0,005 g/L de cholestérol) à 1 L d’eau et mélanger à l’aide d’un agitateur.
    2. Pour inhiber la prolifération d’E. coli et permettre la prolifération de C. albicans , compléter NGM avec 0,2 g/L de sulfate de streptomycine après l’autoclavage.
      REMARQUE : Si vous utilisez NGM pour l’entretien des nématodes, la streptomycine n’est pas nécessaire.
  3. Maintien des populations de nématodes
    1. Étaler 300 μL de culture d’E. coli pendant la nuit sur des plaques de gélose NGM préparées à l’aide d’un épandeur métallique. Cette technique sera appelée ensemencement.
    2. Laissez les plaques sécher à température ambiante (RT). Cultivez les plaques pendant la nuit à 30 °C.
    3. Maintenir la population de nématodes en morcelant tous les 3 à 4 jours sur une plaque NGM nouvellement ensemencée avec E. coli. Conserver à 20 °C. Le découpage est une technique utilisée pour transférer rapidement une population aléatoire de nématodes vers une plaque nouvellement ensemencée, ce qui permet aux populations de proliférer. Pour ce faire, utilisez une spatule stérile pour découper un petit carré (1 x 1 pouce) dans la plaque de gélose NGM. Transférez soigneusement le carré sur une nouvelle plaque NGM ensemencée avec le côté avec les nématodes vers le bas sur la nouvelle gélose8.
      REMARQUE : C. elegans maintenu à 20 °C produira une progéniture ~48 h plus tard, ce qui est utile à prendre en compte lors de la synchronisation d’une population de nématodes. C. elegans maintenu à 25 °C se développera et se reproduira plus rapidement, et les populations maintenues à 15 °C auront une croissance plus lente.
  4. Synchronisation de la population de nématodes
    1. Commencer avec une population de nématodes existante maintenue sur NGM/OP50.
    2. Pipeter ~3 mL de tampon M9 sur la plaque NGM contenant les nématodes. Lavez les œufs de nématodes de la plaque et utilisez doucement la pointe de la pipette pour gratter les œufs de la gélose (ils ont tendance à coller). À l’aide d’une pipette P1000, transférez le liquide contenant les œufs et les vers dans un tube conique de 15 ml. Pour évaluer le nombre d’œufs encore dans l’assiette, utilisez un microscope de dissection pour regarder la gélose.
    3. Centrifugeuse conique pendant 2 min à 279 x g et RT.
    4. Retirez le surnageant en faisant attention de ne pas déranger la pastille de nématode.
    5. Ajouter 3 ml de solution d’eau de Javel à 25 % (« ATTENTION » lors de la manipulation).
    6. Retournez le tube pendant 2 minutes. Vérifiez que les nématodes sont morts à l’aide du microscope de dissection - ils seront droits et non mobiles.
      REMARQUE : Cela ne tuera que les nématodes existants. L’intégrité des œufs ne sera pas affectée.
    7. Centrifugeuse pendant 2 min à 279 x g et RT.
    8. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 3 mL M9.
    9. Centrifugeuse pendant 2 min à 279 x g et RT.
    10. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 300 μL de M9.
    11. À l’aide d’un microscope de dissection, vérifiez la concentration des œufs en pipetant 5 μL d’œufs sur une petite plaque de Pétri. La concentration idéale devrait se situer entre 20 et 100 œufs. Si la culture est trop diluée, concentrer la solution par centrifugation et élimination de l’excès de liquide. Si la culture est trop concentrée, ajoutez plus de M9 jusqu’à ce que la concentration souhaitée soit atteinte.
  5. Préparer les cultures de C. albicans et d’E . coli pour l’infection par les nématodes (ensemencement).
    1. Préparez une solution à blanc. Dans une cuvette, mélanger 900 μL de ddH2O et 100 μL de YPD liquide.
    2. Insérez la cuvette dans le spectrophotomètre. Réglez la longueur d’onde sur 600 nanomètres à l’aide de la flèche vers le haut. Cliquez sur le bouton « 0 ABS 100 % T » pour définir la solution vierge.
    3. Dans une nouvelle cuvette, mélanger 900 μL de ddH2O et 100 μL de levure de culture pendant la nuit. Sortez la solution à blanc du spectrophotomètre et ajoutez la cuvette contenant la solution de levure. Enregistrez la densité optique affichée à l’écran (n’appuyez sur aucun bouton). Multipliez la lecture par 10 (la solution de levure mesurée était une dilution de 1 sur 10).
    4. Normaliser la culture à 3,0 OD600/mL avec ddH2O dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. 1 OD600 correspond à environ 3 x 10-7 UFC/mL21.
      REMARQUE : Si la lecture de la DO600 est de 6,7, 3 DO/6,7 DO = 0,447 mL, ajoutez 447 μL de culture de C. albicans dans le tube de la microcentrifugeuse. Centrifugeuse à vitesse maximale (16, 873 x g) pendant 30 s. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL de ddH2O.
    5. Transférez la culture d’E. coli pendant la nuit dans un tube conique de 50 ml.
    6. Centrifuger la culture à 279 x g pendant 2 min à RT.
    7. Aspirer la majorité du surnageant, en laissant ~1 mL.
    8. Remettre la pastille en suspension dans le surnageant restant et la transférer dans un tube de microcentrifugation prépesé de 1,5 mL.
    9. Faites tourner le tube de la microcentrifugeuse à vitesse maximale pendant 30 s.
    10. À l’aide d’une pipette p1000, prélever le surnageant et peser la pastille finale.
    11. Diluer E. coli à 200 mg/mL dans du jard2O.
    12. Utilisez les calculs de mélange principal (Tableau 2) et mettez à l’échelle de manière appropriée.

2. Dosage de la fécondité

REMARQUE : Les données représentatives sont présentées dans le tableau supplémentaire 1 et un schéma dans la figure 1A.

  1. Obtenir ou préparer les éléments suivants : plaques de Pétri de 35 mm x 10 mm, NGM complétée par 0,2 g/L de sulfate de streptomycine, culture d’E. coli OP50, LB, culture de C. albicans , YPD, pic de fil, tampon M9 (3,0 g/L KH2PO4, 6,0 g/L Na2HPO4, 0,5 g/L de NaCl, 1,0 g/L de NH4Cl), Tubes coniques de 15 ml.
    Deux jours avant l’expérience
  2. Inoculer des souches de C. albicans dans 2 mL de YPD et E. coli (OP50) dans 50 mL de LB et les faire croître pendant la nuit à 30 °C.
  3. Préparez des plaques de Pétri de 35 mm x 10 mm avec du NGM complété par 0,2 g/L de sulfate de streptomycine. Le nombre de plaques préparées doit durer toute l’expérience. Le nombre recommandé de répétitions est de 10 par traitement. Pour 10 répétitions, 70 plaques seront utilisées. 1 L de NGM fera ~250 plaques.
    Un jour avant l’expérience
  4. Semencer des plaques de gélose NGM de 35 mm x 10 mm complétées par de la streptomycine pour les jours 0, 2 et 3 selon le protocole d’ensemencement décrit ci-dessus avec la concentration du mélange maître (tableau 2). Pipetez la quantité appropriée de mastermix au centre de la plaque. L’épandage de la culture n’est pas nécessaire car une seule tache de croissance microbienne est suffisante pour l’alimentation de l’hôte et nous permet d’identifier facilement les hôtes à l’extérieur de la graine. Incuber les plaques pendant la nuit à RT.
    REMARQUE : Le mastermix Day 0 contient 50 μL de « graines » par répétition pour chaque traitement expérimental. Les jours 2 à 7 comprennent 10 μL de « graines » par répétition pour chaque traitement expérimental. Il n’y a pas de plaque du jour 1 car les nématodes atteindront le stade L4 48 h après avoir été synchronisés sur une plaque du jour 0. Une fois qu’ils atteignent L4, les nématodes individuels seront transférés dans les plaques du jour 2.
Pour 1 réplicaCondition de contrôle d’E. coli (OP50)Condition de traitement de C. albicans et E. coli (OP50)
OP50H2OTotalOP50C. albicansH2OTotal
Jour 06,25 UL43,75 UL50 UL6,25 UL1,25 UL42,5 UL50 UL
Jours 2-71,25 UL8,75 UL10 UL1,25 UL.25 UL8,5 UL10 UL

Tableau 2 : Volumes de mastermix de cultures d’E. coli et de C. albicans nécessaires pour infecter les nématodes pour l’essai de fécondité.

Journée d’expérimentation (Jour 0)

  1. Synchronisez les nématodes et mettez ~50 œufs en boîte sur chaque répétition du jour 0 des plaques de contrôle (OP50 seulement) et des plaques de traitement (C. albicans + OP50). Incuber à 20 °C pendant 48 h.
    Jour 2
  2. Transférez un seul nématode L4 en prélevant8 de la plaque du jour 0 dans chacune des plaques ensemencées du jour 2. Les hôtes L4 peuvent être identifiés par une petite poche au milieu de la face dorsale de leur corps22. Transférez les nématodes éclos et matures à partir du même type de boîte ensemencée (c.-à-d. que les nématodes L4 des plaques témoins D0 doivent être transférés sur les plaques témoins du jour 2).
  3. Inoculer les cultures de C. albicans nécessaires dans 2 mL de YPD et E. coli (souche OP50) dans 50 mL de LB.
    Jour 3
  4. Transférez les nématodes des plaques du jour 2 aux plaques ensemencées du jour 3, en gardant une trace de chaque répétition (c.-à-d. que la répétition A du jour 2 doit être déplacée vers la plaque de la répétition A du jour 3).
  5. Incuber les plaques du jour 2 (contenant uniquement les œufs) et du jour 3 (contenant l’adulte seul) à 20 °C pendant 24 h.
  6. Grainez 35 mm x 10 mm NGM complété par des plaques de streptomycine pendant les jours 4 et 5 à l’aide de 10 μL de mastermix par boîte (tableau 2) et incubez des plaques à RT pendant 24 h.
    Jour 4
  7. Transférez les nématodes des plaques du jour 3 aux plaques ensemencées du jour 4.
  8. Incuber les plaques du Jour 3 et du Jour 4 à 20 °C pendant 24 h.
  9. À l’aide d’une lunette de dissection, comptez la progéniture viable pour chaque plaque du jour 2. Notez toutes les répliques qui sont mortes ou qui ne sont plus sur l’assiette (censurées). Une fois que le nombre de descendants est enregistré, jetez les plaques du jour 2.
    REMARQUE : Censuré fait référence aux nématodes qui disparaissent sur la plaque. Cela peut se produire lorsque les nématodes rampent hors de la plaque. Bien que moins fréquentes pendant la fenêtre de 24 heures, les carcasses des nématodes morts se désintègrent dans la gélose, ce qui entraîne également la censure. Les données censurées ne sont pas incluses dans l’analyse finale des données de descendance et de survie.
  10. Inoculer de nouvelles cultures de souches de C. albicans dans 2 mL de YPD et d’E. coli (OP50) dans 50 mL de LB.
    Jour 5
  11. Transférez les nématodes des plaques du jour 4 aux boîtes ensemencées du jour 5.
  12. Incuber les plaques du jour 4 et du jour 5 à 20 °C pendant 24 h.
  13. Comptez la descendance viable pour chaque plaque du Jour 3. Notez toutes les répliques qui sont mortes ou qui ne sont plus sur l’assiette (censurées). Une fois que le nombre de descendants est enregistré, jetez les plaques du jour 3.
  14. Grainez 35 mm x 10 mm NGM complété par des plaques de streptomycine pendant les jours 6 et 7 à l’aide de 10 μL de mélange maître par boîte (tableau 2) et incubez des plaques à température ambiante pendant 24 h.
    Jour 6
  15. Transférez les nématodes des plaques du jour 5 aux plaques ensemencées du jour 6.
  16. Incuber les plaques du jour 5 et du jour 6 à 20 °C pendant 24 h.
  17. Comptez la progéniture viable pour chaque assiette du jour 4. Notez toutes les répliques qui sont mortes ou qui ne sont plus sur l’assiette (censurées). Une fois que le nombre de descendants est enregistré, jetez les plaques du jour 4.
    Jour 7
  18. Transférez les nématodes des plaques du jour 6 aux boîtes ensemencées du jour 7.
  19. Incuber les plaques du Jour 6 et du Jour 7 à 20 °C pendant 24 h.
  20. Comptez la progéniture viable pour chaque plaque du jour 5. Notez toutes les répliques qui sont mortes ou qui ne sont plus sur l’assiette (censurées). Une fois que le nombre de descendants est enregistré, jetez les plaques du jour 5.
    Jour 8
  21. Comptez la progéniture viable pour chaque plaque du Jour 6. Notez toutes les répliques qui sont mortes ou qui ne sont plus sur l’assiette (censurées). Une fois que le nombre de descendants est enregistré, jetez les plaques du jour 6.
    Jour 9
  22. Comptez la progéniture viable pour chaque assiette du jour 7. Ne comptez pas le plus gros nématode (parent). Notez toutes les répliques qui sont mortes ou qui ne sont plus sur l’assiette (censurées). Une fois que le nombre de descendants est enregistré, jeter les plaques du jour 7.
    REMARQUE : Ce test peut également être utilisé pour évaluer la survie. Notez quand chaque nématode est mort. À la fin de l’expérience, le pourcentage de nématodes qui ont survécu au cours de l’expérience de sept jours peut être comparé pour chaque traitement. Les nématodes s’éloignent parfois de la source de nourriture ou d’agent pathogène et tentent de grimper sur les lames de la plaque de Pétri. Vérifiez toutes les zones de la plaque avant de continuer. Les nématodes morts laissent généralement derrière eux une carcasse. Censurez tout nématode qui ne peut pas être localisé et ne considérez pas ce nématode comme mort. N’incluez pas de données censurées dans l’analyse finale de la descendance et de la survie.
  23. Analyser les données pour la taille de la couvée et la reproduction tardive à l’aide de l’ANOVA à un facteur ou de Kruskal-Wallis, selon la normalité des ensembles de données, ainsi que des tests multiples post-hoc de Tukey/Dunn pour identifier les différences significatives entre les groupes de traitement à l’aide du logiciel GraphPad Prism. Détectez les différences entre les courbes de survie à l’aide du test de log-rank de Wilcoxon.

3. Essai d’expansion de la lignée

REMARQUE : Les données représentatives sont présentées dans le tableau supplémentaire 2 et un schéma est présenté à la figure 2A.

  1. Obtenir ou préparer les éléments suivants : Plaques de Pétri de 100 mm x 15 mm contenant de la gélose NGM complétée par 0,2 g/L de sulfate de streptomycine, cultures d’E. coli OP50, cultures de LB, de C. albicans , YPD, tampon M9, aiguille, tubes coniques de 15 mL.
    Jour -2
  2. Inoculer des souches de C. albicans dans 2 mL de YPD et E. coli (OP50) dans 50 mL de LB et les faire croître pendant la nuit à 30 °C.
    Jour -1
  3. Graines : 100 mm x 15 mm de gélose NGM additionnées de streptomycine et de 300 μL de mastermix par boîte (tableau 3). Étalez le mastermix sur la plaque à l’aide d’un épandeur en métal stérile. Incuber les plaques pendant la nuit à 30 °C. Six répétitions par traitement sont recommandées. Ainsi, préparez sept plaques (une plaque pour les nématodes synchronisés, six plaques pour chaque nématode adulte) par traitement.
Condition de contrôle d’E. coli (OP50)C. albicans et E. coli (OP50). condition de traitement
Pour 1 réplicaOP50H2OTotalOP50C. albicansH2OTotal
1,25 UL8,75 UL10 UL37,5 UL7,5 UL255 ul300 ul

Tableau 3 : Volumes de mastermix de cultures d’E. coli et de C. albicans nécessaires pour infecter les nématodes pour l’essai d’expansion de la lignée.

Croissance de la population de nématodes : Jour 0

  1. Synchroniser les nématodes et déposer 10 à 25 œufs sur une seule plaque pour chaque contrôle (OP50 seulement) et traitement (C. albicans + OP50) et incuber à 20 °C pendant 48 h.
    Jour 2 :
  2. Transférez un seul ver L4 de chaque plaque de contrôle et de traitement du jour 0 dans des plaques ensemencées du même traitement. Les hôtes L4 peuvent être identifiés par une petite poche au milieu de la face dorsale de leur corps22.
  3. Incuber à 20 °C pendant 5 jours (soit un total d’une semaine après la synchronisation).
    Jour 7 :
  4. À l’aide d’une pipette p1000, laver toute la population de nématodes de chaque plaque à l’aide de 5 mL de tampon M9 et transférer dans un tube conique de 15 mL.
  5. Conserver à 4 °C pendant 1 h pour permettre aux nématodes de s’installer et de faciliter le comptage.
  6. Diluer chaque conique à un volume final de 10 mL avec un tampon M9.
  7. Pour chaque répétition biologique, compter le nombre de nématodes dans une aliquote de 20 μL. Répétez cette opération pour obtenir 6 répétitions techniques pour chaque réplication biologique. Rétrocalculez pour déterminer la taille totale de la population. Si les échantillons sont trop dilués (c.-à-d. moins de 10 nématodes par échantillon), concentrer la population dans un plus petit volume de tampon M9.
    REMARQUE : La centrifugation des nématodes vivants n’endommagera pas les nématodes.
    Exemple de calcul :
    70 hôtes = X (nombre total d’hôtes)
    20 μL (aliquote) 10 000 μL (volume total)
  8. Analysez les données pour l’expansion de la lignée à l’aide de l’ANOVA à un facteur ou de Kruskal-Wallis, en fonction de la normalité des ensembles de données, ainsi que des tests multiples post-hoc de Tukey/Dunn pour identifier les différences significatives entre les groupes de traitement à l’aide du logiciel GraphPad Prism.

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Résultats

Nous présentons ici deux tests qui mesurent la virulence de C. albicans en tant que phénotype non létal en utilisant C. elegans comme modèle d’infection. Le premier essai, intitulé « Fécondité », permet de suivre l’impact de l’infection à C. albicans sur les hôtes uniques pour la production et la survie de la descendance. Le deuxième essai, l’expansion de la lignée, mesure l’impact de l’infectio...

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Discussion

Ici, nous présentons deux tests simples qui mesurent la virulence fongique. Les deux essais exploitent C. elegans comme système hôte qui comprend la surveillance des phénotypes d’hôtes létaux et non létaux. Par exemple, les tests de fécondité étudient le succès reproducteur des hôtes infectés individuels tout en mesurant la survie individuelle. La surveillance quotidienne fournit non seulement la taille totale de la couvée, mais aussi le moment de la reproduction...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun intérêt concurrent à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Dorian Feistel, Rema Elmostafa et McKenna Penley pour leur aide dans le développement de nos tests et la collecte de données. Cette recherche est soutenue par NSF DEB-1943415 (MAH).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL eppendorf microtubes 3810XMillipore SigmaZ606340
100 mm x 15 mm petri platesSigma-AldrichP5856-500EA
15 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-959-70C
50 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-432-22
AdenineMillipore SigmaA8626
Agar (granulated, bacterilogical grade)Apex BioResearch Produces20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)Genesee Scientific59-1M32P
Ammonium ChlorideMillipore Sigma254134
Bacterial Cell SpreaderSP Scienceware21TP50
BactoPeptoneFisher BioReagantsBP1420-500
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)FIsherBrand14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)Nikon Instrument Inc.
E. coliCaenorhabditis Genetics CenterOP50
GlucoseMillipore Sigma50-99-7
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)Falcon353001
Metal SpatulaSP Scienceware8TL24
Nematode Growth Media (NGM)Dot ScientificDSN81800-500
Potassium Phosphate monobasicSigmaP0662-500G
Sodium ChlorideFisher ScientificBP358-1
Sodium PhosphateFisher ScientificBP332-500
Streptomycin SulfateThermo-Fisher Scientific11860038
TryptoneMillipore Sigma91079-40-2
UridineMillipore SigmaU3750
Wildtype C. elegansCaenorhabditis Genetics CenterN2
Yeast ExtractMillipore Sigma8013-01-2

Références

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