小鼠不变自然杀伤性T细胞的纯化和扩增用于体外和体内研究

摘要

我们描述了一种快速而强大的方案，以从小鼠脾脏中富集不变的自然杀伤T（iNKT）细胞，并在体外将其扩增至适合体外和体内研究的数量。

摘要

不变的自然杀伤性T（iNKT）细胞是先天性样T淋巴细胞，表达保守的半不变T细胞受体（TCR），该受体对非多态性MHC I类相关分子CD1d呈递的自身或微生物脂质抗原具有特异性。iNKT细胞在整个物种中都非常保守，小鼠模型（包括CD1d缺陷或iNKT缺陷小鼠）促进了它们的研究，并且有可能在小鼠和男性中明确检测到它们，CD1d四聚体或mAbs特异性为半不变TCR。然而，iNKT细胞是罕见的，它们需要扩增以达到任何研究的可管理数量。由于原代小鼠iNKT细胞系的体外生成已被证明是困难的，因此我们已经建立了一个强大的方案来纯化和扩增来自iVα14-Jα18转基因小鼠（iVα14Tg）的脾iNKT细胞，其中iNKT细胞的频率是其30倍。我们在这里表明，原代脾iVα14Tg iNKT细胞可以通过免疫磁性分离过程富集，产生约95-98%纯iNKT细胞。纯化的iNKT细胞受到抗CD3 / CD28微球加IL-2和IL-7的刺激，导致培养物的天+14的30倍扩增，纯度为85-99%。扩增的iNKT细胞可以很容易地进行遗传操纵，为在体外解剖激活和功能机制提供了宝贵的工具，更重要的是，在体内过继转移时也是如此。

引言

不变的自然杀伤性T细胞（iNKT细胞）是先天性T淋巴细胞，表达半不变的αβ T细胞受体（TCR），由不变的Vα14-Jα18链与一组有限的不同Vβ链¹配对，其特异性地存在于小鼠中，该链特异性于MHC I类相关分子CD1d²呈递的脂质抗原。iNKT细胞经历激动剂选择程序，导致获得已经在胸腺中的活化/先天效应表型，这发生在几个成熟阶段^3，4，产生CD4⁺和CD4^-亚群。通过该程序，iNKT细胞获得不同的T辅助（T_H）效应子表型，即T_H1（iNKT1），T_H2（iNKT2）和T_H17（iNKT17），可通过转录因子T-bet，GATA3，PLZF和RORγt的表达来识别，分别^为5。iNKT细胞识别一系列微生物脂质，但对内源性脂质也具有自我反应性，内源性脂质在细胞应激和组织损伤的病理情况下上调，例如癌症和自身免疫²。激活后，iNKT细胞通过直接接触和细胞因子产生调节其他先天性和适应性免疫效应细胞的功能^2。

小鼠模型（包括CD1d缺陷小鼠或Jα18缺陷小鼠）以及抗原负载CD1d四聚体的产生以及人为半不变TCR特异性单克隆抗体（mAbs）的产生促进了iNKT细胞的研究。然而，原代小鼠iNKT细胞系的产生已被证明是困难的。为了更好地表征iNKT细胞的抗肿瘤功能并将其用于过继细胞治疗，我们建立了一个方案来纯化和扩增iVα14-Jα18转基因小鼠（iVα14Tg）6的脾iNKT细胞，其中iNKT细胞的频率是野生型小鼠的30倍。

扩增的iNKT细胞可用于体外测定，并在体内转移回小鼠体内。例如，在这种情况下，我们已经展示了它们有效的抗肿瘤作用⁷。此外，体外扩增的iNKT细胞在体内注射⁸之前可以通过基因转移或编辑进行功能修饰，从而可以对分子途径进行有见地的功能分析，并为先进的细胞疗法铺平道路。

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研究方案

这里描述的程序由圣拉斐尔科学研究所的机构动物护理和使用委员会（IACUC）（第1048号）审查和批准。

注意:所有程序必须在无菌条件下进行。所有使用的试剂都列在 材料表。

1. 脾脏加工

1. 根据机构政策，通过吸入CO₂ 对iVα14-Jα18小鼠实施安乐死。
   注意:iVα14-Jα18小鼠必须8周大或以上。为了避免从细胞的体内转移中排斥细胞，请考虑从雌性小鼠中分离的细胞可以在雄性和雌性受体中过继转移，而从雄性小鼠中分离的细胞只能在雄性受体中转移。对于体外实验，必须不考虑性别偏见。可以汇集更多的小鼠以获得更多的细胞。
2. 解剖小鼠脾脏并通过70nm细胞过滤器粉碎，以获得10mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）和2%胎牛血清（FBS）中的单细胞悬浮液。
3. 以300×g离心5分钟。
4. 通过倒置并用红细胞裂解缓冲液处理去除上清液。用1mL无菌ACK（铵 - 氯化铵 - 钾）裂解缓冲液重悬细胞沉淀，在室温下孵育3分钟，并用5mLPBS和2%FBS阻断。以300×g离心5分钟。
   注意:ACK是市售的;它由0.15 M NH_{4 Cl，10}mM KHCO₃和0.1mM Na₂EDTA（乙二胺四乙酸）的溶液组成，溶解在双搅拌H₂O，pH 7.2-7.4中。如果是自制的，请用0.22μm过滤器过滤灭菌。
5. 通过反转除去上清液。将细胞沉淀重悬于3mLPBS中，含2%FBS，并通过移液去除脂肪残留物。如果需要，池化来自不同小鼠的细胞。
6. 计数细胞并保持50μL用于FACS分析。

2. T细胞富集

注意:对于富集步骤，快速工作，保持细胞冷，并使用在4°C下预冷过夜的溶液，然后保持在冰上

1. 以300×g离心5分钟。
2. 将所有细胞重悬于适量的PBS中，具有2%FBS（500μL用于10⁷ 个细胞）和Fc阻断剂（2.5μL×10⁷ 个细胞）;在室温（RT）下孵育15分钟。
3. 每10个⁷ 个细胞用1-2mL MACS分离缓冲液（MB）洗涤，并以300×g离心10分钟。
   注:MACS 缓冲器已市售。它由PBS pH 7.2，0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2mM EDTA组成。如果是自制的，请用0.22μm过滤器过滤灭菌。
4. 通过倒置除去上清液，并用CD19-FITC和H2（IA b）-FITC染色细胞（使用5μL×10⁷个细胞在100μLMB中）。充分混合，在4-8°C的黑暗中孵育15分钟。
5. 通过每10个⁷ 个细胞加入1-2mL MB来洗涤细胞，并以300×g离心10分钟。
6. 完全移液上清液，并将细胞沉淀重悬于每10个⁷ 个细胞的90μL MB中。每10个⁷ 个细胞加入10μL抗FITC微珠。充分混合，在4-8°C的黑暗中孵育15分钟。
7. 通过每10个⁷ 个细胞加入1-2mL MB来洗涤细胞，并以300×g离心10分钟。
8. 完全移液上清液，并在500μL MB中重悬至1.25×10⁸ 个细胞。
9. 在MACS分离器的磁场中放置一个LD柱以继续进行耗尽。为避免堵塞，请在LD柱上应用预分离过滤器，并用2 mL MB冲洗。
10. 当柱储液器为空时，将细胞悬浮液施加到过滤器上。收集通过列的未标记单元格。
11. 仅当色谱柱储液器为空时，用 1 mL MB 洗涤 3 次。收集总流出物，这些流出物将在T细胞中富集，并计数细胞。始终保持50μL用于FACS分析。

3. iNKT细胞富集

1. 以300×g离心5分钟，并通过倒置除去上清液。
2. 根据抗体滴定法，用CD1d-四聚体-PE（小鼠PBS57-CD1d-四聚体）染色细胞，每10^个6 个细胞中50μL MB。搅拌均匀，在黑暗中在冰上孵育30分钟。
   注:该程序也可以使用APC标记的mCD1d四聚体和抗APC珠进行;相应地调整用于以下染色的荧光染料。在本实验方案中，我们使用NIH提供的小鼠PBS-57-CD1d-四聚体。α半乳糖基神经酰胺（αGal-Cer）是iNKT细胞识别的原型抗原;PBS-57是αGal-Cer的类似物，溶解度提高^9;NIH四聚体设施提供与CD1d四聚体复合的PBS-57配体。然而，其他CD1d二聚体/四聚体/解构体是市售的，并且可以装载脂质抗原作为αGal-Cer。我们设想了调整协议以供其使用的可能性。
3. 通过每10个⁷ 个细胞加入1-2mL MB来洗涤细胞，并以300×g离心10分钟。
4. 完全移液上清液，并将细胞沉淀重悬于每10个⁷ 个细胞的80μL MB中。每10个⁷ 个细胞加入20μL抗PE微珠。充分混合，在4-8°C的黑暗中孵育15分钟。
5. 通过每10个⁷ 个细胞加入1-2mL MB来洗涤细胞，并以300×g离心10分钟。
6. 完全移液上清液，并在500μL MB中重悬多达10⁸ 个细胞。否则，如果细胞超过10^8，请相应地调节音量。
7. 根据细胞计数，在MACS分离器的磁场中放置LS（最多10^8）或MS（最多10^7）柱。用MB冲洗色谱柱（LS为3 mL，MS为500μL）。
8. 将细胞悬浮液施加到色谱柱上。
9. 收集通过的未标记的细胞。仅当色谱柱储液器为空时，通过加入适量的MB（LS柱为3 x 3 mL，MS柱为3 x 500μL）洗涤色谱柱3次。总出水量是 负分数。
10. 将色谱柱从磁场中取出，并将其放在新的收集管上。
11. 将MB移液到色谱柱上（LS色谱柱为5 mL，MS色谱柱为1 mL）;将提供的柱塞推入柱中并冲洗出 阳性部分 （在iNKT细胞中富集）。
12. 为了进一步提高iNKT细胞回收率，将阴性部分以300×g离心10分钟，并用新的LS或MS柱重复步骤3.6-3.7。汇集阳性组分并确定细胞计数。保留50μL的阳性和阴性馏分用于FACS分析。
13. 通过 FACS 分析检查纯化步骤。样品包括:脾脏离体、富含T细胞的级分、iNKT阳性级分和iNKT阴性级分。用CD19-FITC，IAb-FITC，CD1d-四聚体-PE，TCRβ-APC和DAPI染色细胞。
    注意:从一个iVα14-Jα18小鼠的预期恢复是2x10⁶ 个iNKT细胞。

4. iNKT细胞活化和扩增

1. 用小鼠T激活剂抗CD3 / CD28磁珠以1:1的比例激活纯化的iNKT细胞。
   1. 将iNKT细胞阳性级分以300×g离心5分钟。
   2. 同时将适量的抗CD3/CD28磁珠转移到管中，加入等体积的PBS，涡旋5秒。将管子放在磁铁上1分钟，然后丢弃上清液。
   3. 从磁体中取出管子，并将洗涤的磁珠重悬于适当体积的完全RPMI（RPMI 1640培养基，10%热灭活的FCS，1mM丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，10 U / ml青霉素和链霉素，50μM β-巯基乙醇）中，在1mL中具有^{5×10 5} 个iNKT细胞。使用该悬浮液重悬离心的iNKT阳性馏分。
2. 将细胞悬浮液（5 x 10⁵ iNKT细胞）和抗CD3 / CD28磁珠的板1mL放入具有20 U / mL IL-2的48孔板中，并在37°C下孵育。
3. 5 天后，加入 10 纳克/毫升 IL-7。
4. 当细胞达到80-90%汇合时，以1:2的比例分裂细胞，始终添加20U / mL IL-2和10 ng / mL IL-7。在这些条件下，iNKT细胞可以扩增长达15天。

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结果

本手稿中描述的方案能够通过图1A中总结的免疫磁性分离过程从iVa14-Ja18转基因小鼠的脾脏中富集iNKT细胞。首先通过消耗B细胞和单核细胞来对总脾T细胞进行阴性选择，然后用PBS-57脂质抗原负载的CD1d四聚体进行iNKT细胞阳性免疫磁性分选，从而能够特异性地仅染色iNKT细胞。该方案从单个iVa14-Ja18 Tg小鼠的脾脏中产生约2 x 10⁶个95-98%纯iNKT细胞。在阴性部分中没有或实际上?...

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讨论

在这里，我们展示了一种可重复且可行的方案，以获得数百万个即用型iNKT细胞。由于这些细胞在体内的缺乏，因此非常需要一种扩增它们的方法。我们提出的协议既不需要特定的仪器，也不需要大量的小鼠。我们故意利用iVα14-Jα18转基因小鼠来减少手术所需的小鼠数量。

来自iVα14-Jα18转基因小鼠的iNKT细胞扩增的另一种成功方案在文献¹⁰中可用。该协议涉及?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution	in house		0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4
anti-FITC Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Brefeldin A	Sigma	B6542
CD19 -FITC	Biolegend	115506	clone 6D5
CD1d-tetramer -PE	NIH tetramer core facility		mouse PBS57-Cd1d-tetramers
CD4 -PeCy7	Biolegend	100528	clone RM4-5
Fc blocker	BD Bioscience	553142
Fetal Bovine Serum (FBS)	Euroclone	ECS0186L	heat-inactivated and filtered .22 before use
FOXP3 Transcription factor staining buffer	eBioscience	00-5523-00
H2 (IAb) -FITC	Biolegend	114406	clone AF6-120.1
hrIL-2	Chiron Corp
Ionomycin	Sigma	I0634
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS buffer (MB)	in house		0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Non-essential amino acids	Gibco	11140-035
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep)	Lonza	15140-122
PermWash	BD Bioscience	51-2091KZ
PFA	Sigma	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	EuroClone	ECB4004L
PMA	Sigma	P1585
Pre-Separation Filters (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
Recombinat Mouse IL-7	R&D System	407-ML-025
RPMI 1640 with glutamax	Gibco	61870-010
sodium pyruvate	Gibco	11360-039
TCRβ -APC	Biolegend	109212	clone H57-597
αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads	Gibco	11452D
β-mercaptoethanol	Gibco	31350010