インビトロおよびインビボ研究のためのマウス不変性ナチュラルキラーT細胞の精製と拡大

要約

我々は、マウス脾臓から不変ナチュラルキラーT(iNKT)細胞を濃縮し、インビトロおよびインビボ研究に適した数にそれらを拡大するための迅速かつ堅牢なプロトコルを記述する。

要約

不変ナチュラルキラーT(iNKT)細胞は、非多形性MHCクラスI関連分子CD1dによって提示される自己または微生物脂質抗原に特異的な保存された半不変T細胞受容体(TCR)を発現する先天性Tリンパ球である。iNKT細胞は種全体を通して非常に保存されており、CD1d欠乏またはiNKT欠損マウスを含むマウスモデルによって調査が容易に行われ、半変量TCRに特異的なCD1d四量体またはmAbsを有するマウスおよび男性で明確に検出する可能性がある。しかし、iNKT細胞はまれであり、研究のために管理可能な数に達するように拡張する必要があります。インビトロでの一次マウスiNKT細胞株の生成が困難であることが証明されているため、iNKT細胞が30倍の頻度で頻繁に行われるiVα14-Jα18トランスジェニックマウス(iVα14Tg)から脾臓iNKT細胞を精製および拡張するための堅牢なプロトコルを設定しました。ここでは、一次脾臓iVα14Tg iNKT細胞は、免疫磁気分離プロセスを通じて濃縮され、約95〜98%の純粋なiNKT細胞を生み出すことができることを示しています。精製されたiNKT細胞は、抗CD3/CD28ビーズとIL-2およびIL-7によって刺激され、85〜99%の純度で培養の14日目までに30倍の膨張を生じる。拡大されたiNKT細胞は、簡単に遺伝的に操作することができ、インビトロで活性化および機能のメカニズムを解剖し、さらに重要なことに、生体内での導入転送時にも貴重なツールを提供する。

概要

不変ナチュラルキラーT細胞(iNKT細胞)は、半不変量αβT細胞受容体(TCR)を発現する先天性Tリンパ球であり、不変Vα14-Jα18鎖と多様なVβ鎖¹の限定的なセットを組み合わせてマウスで形成される、MHCクラスI関連CD1d2によって提示される脂質抗原に特異的である。iNKT細胞は、いくつかの成熟段階^3、4を経て起こる胸腺に既に活性化/先天性エフェクター表現型を獲得するアゴニスト選択プログラムを受け、CD4+および^CD4-サブセットを産生する。このプログラムを通じて、iNKT細胞は、それぞれT-ベット、GATA3、PLZF、およびRORγtの発現によって識別可能な、異なるTヘルパー_(TH)エフェクター表現型、すなわちTH1(iNKT1)、TH2(iNKT2)および_TH17(iNKT17)を取得^する。iNKT細胞は微生物脂質の範囲を認識するが、癌や自己免疫などの細胞ストレスや組織損傷の病的状況の状況においてアップレギュレートされる内因性脂質に対しても自己反応性である^2。活性化すると、iNKT細胞は、直接接触およびサイトカイン産生²を介して他の先天性および適応免疫エフェクター細胞の機能を調節する。

iNKT細胞の研究は、CD1d欠損マウスやJα18欠損マウスを含むマウスモデル、および抗原搭載CD1d四量体の産生に加えて、ヒト半不変TCRに特異的なモノクローナル抗体(mAbs)の生成によって促進されている。しかし、一次マウスiNKT細胞株の生成は困難であることが判明した。iNKT細胞の抗腫瘍機能をより良く特徴付け、養子細胞療法に利用するために、iNKT細胞が野生型マウスの30倍の頻度でiNKT細胞を形成するiVα14-Jα18トランスジェニックマウス(iVα14Tg)6の脾臓iNKT細胞を精製・拡大するプロトコルを設定しました。

拡大したiNKT細胞は、インビトロアッセイに利用され、マウスに戻ると生体内で利用できます。この設定では、例えば、我々は、7の強力な抗腫瘍^効果を示している。さらに、インビトロでのiNKT細胞は、インビボ⁸での注射前に遺伝子導入や編集を介した機能修飾に適しており、分子経路の洞察に富んだ機能解析を可能にし、高度な細胞療法への道を開きます。

プロトコル

ここで説明する手順は、サン・ラファエレ科学研究所の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)(No. 1048)によって見直され、承認されました。

注:すべての手順は、無菌条件下で実行する必要があります。使用される試薬はすべて 、材料表にリストされています。

1. 脾臓処理

1. iVα14-Jα18マウスを制度方針に従って_CO2 を吸入することにより安楽死させる。
   注意:iVα14-Jα18マウスは8週齢以上でなければなりません。細胞のin vivo転移からの細胞の拒絶を避けるために、雌マウスから単離された細胞は男性と女性の両方のレシピエントで養子に移すことができるのに対し、雄マウスから単離された細胞は男性レシピエントでのみ移すことができると考えてください。インビトロ実験では、ジェンダーバイアスを考慮する必要はありません。より多くの細胞を得るためにより多くのマウスをプールすることができる。
2. マウス脾臓を解剖し、70 nmの細胞ストレーナーを介してそれを粉砕し、2%のウシ胎児血清(FBS)を有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の10mLで単細胞懸濁液を得る。
3. 5分間300×gで遠心分離機。
4. 反転によって上清を除去し、赤血球リシスバッファーで処理します。細胞ペレットを1 mLの無菌ACK(アンモニウム-塩化カリウム)ライシングバッファーで再懸濁し、室温で3分間インキュベートし、2%FBSで5mLのPBSでブロックします。5分間300×gで遠心分離機。
   注: ACK は市販されています。それは0.15 M NH₄Cl、10 mM KHCO_3、および0.1 mM_Na2EDTA(エチレンジアミントアセアセク酢酸)の溶液で構成され、変成されたH2O、pH 7.2-7.4に溶解した。自家製の場合は、0.22 μmフィルターで濾過して滅菌します。
5. 上清を反転して取り除く。2%FBSで3mLのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、ピペット処理により脂肪残渣を除去する。必要に応じて、異なるマウスから来る細胞をプールします。
6. FACS分析のために細胞を数え、50 μLを保持します。

2. T細胞の濃縮

注:濃縮ステップのために、速く働き、細胞を冷たく保ち、一晩4°Cで予冷した溶液を使用し、氷の上に保つ

1. 5分間300×gで遠心分離機。
2. 2%FBS(10⁷ セルの場合は500 μL)とFcブロッカー(2.5 μL x 10⁷ セル)を使用して、適切な量のPBS内のすべてのセルを再中断します。室温(RT)で15分間インキュベートする。
3. 10⁷ 細胞あたり1〜2mLのMACS分離バッファー(MB)、遠心分離機を300xgで10分間洗浄します。
   メモ:MACSバッファは市販されています。それはPBS pH 7.2、0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)、および2 mM EDTAから成っている。自家製の場合は、0.22 μmフィルターで濾過して滅菌します。
4. 上清を反転して除去し、CD19-FITCとH2(IA b)-FITCで細胞を染色します(5 μL x 10⁷細胞を100 μL MBで使用してください)。よく混ぜ、4-8 °Cで暗闇の中で15分間インキュベートします。
5. 10⁷ 個の細胞あたり1〜2mLのMBを加え、遠心分離機を300xgで10分間洗浄します。
6. 上清を完全に取り除き、合計¹⁰⁷ 個の細胞につき90μLのMBで細胞ペレットを再懸濁させる。10⁷ 細胞あたり10μLのアンチFITCマイクロビーズを加えます。よく混ぜ、4-8 °Cで暗闇の中で15分間インキュベートします。
7. 10⁷ 個の細胞あたり1〜2mLのMBを、遠心分離機を300xgで10分間加えて洗浄します。
8. 上清を完全に取り除き、500 μLのMBで最大1.25 x 10⁸ セルを再懸濁します。
9. MACSセパレータの磁場にLDカラムを配置して、枯渇に進みます。目詰まりを避けるには、LD 列に分離前フィルタを適用し、2 mL の MB でリンスします。
10. カラムリザーバが空の場合は、セルサスペンションをフィルターに塗布します。列を通過するラベルのないセルを収集します。
11. カラムリザーバーが空の場合のみ、1 mLのMBで3回洗浄してください。T細胞に富む総流出量を収集し、細胞を数えます。FACS 分析のために常に 50 μL を維持してください。

3. iNKT細胞の濃縮

1. 5分間300×gで遠心分離機を使用し、反転により上清を除去します。
2. CD1d-テトラマー-PE(マウスPBS57-CD1d-テトラマー)で細胞を染色し、10⁶ 細胞当たり50 μLのMBの抗体滴定に従う。よく混ぜ、氷の上の暗闇の中で30分間インキュベートします。
   注:この手順は、APCラベルのmCD1dテトラマーとアンチAPCビーズでも実行できます。以下の染色に用いるフルオロクロムを適宜調整する。本プロトコルでは、NIHが提供するマウスPBS-57-CD1d-テトラマーを使用しました。αgalactosylセラミド(αGal-Cer)は、iNKT細胞によって認識される原型抗原である。PBS-57は、αGal-Cerの類似体であり、溶解度が改善^された9;NIHテトラマー施設は、CD1dテトラマーに複合体化したPBS-57リガンドを提供します。しかし、他のCD1dダイマー/テトラマー/デキスタマーは市販されており、αGal-Cerとして脂質抗原を装填することができる。我々は、その使用のためのプロトコルを調整する可能性を想定しています。
3. 10⁷ 個の細胞あたり1〜2mLのMBを、遠心分離機を300xgで10分間加えて洗浄します。
4. 上清を完全に取り除き、合計¹⁰⁷ 個の細胞につき80μLのMBで細胞ペレットを再懸濁します。10⁷ 細胞あたり20μLのアンチPEマイクロビーズを加えます。よく混ぜ、4-8 °Cで暗闇の中で15分間インキュベートします。
5. 10⁷ 個の細胞あたり1〜2mLのMBを加え、遠心分離機を300xgで10分間洗浄します。
6. 上清を完全に取り除き、500 μLのMBで最大10^個の8 個の細胞を再懸濁します。それ以外の場合は、セルが 10⁸を超える場合は、それに応じて音量を調整します。
7. セル数に応じて、MACS セパレータの磁場に LS (最大 10⁸) または MS (最大 10⁷⁾列を配置します。カラムをMB(LSの場合は3 mL、MSの場合は500 μL)でリンスします。
8. セルのサスペンションを列に適用します。
9. 通過するラベルのないセルを収集します。カラムリザーバが空の場合にのみ、適切な量のMB(LSカラムの場合は3 x 3 mL、MSカラムの場合は3 x 500 μL)を加えてカラムを3回洗浄します。総流出量は負の 分数です。
10. 磁場からカラムを取り外し、新しい回収管に置きます。
11. カラムにピペットMB(LSカラムの場合は5 mL、MSカラムの場合は1 mL)。提供されたプランジャーをカラムに押し込み、 正の分数 (iNKT細胞で富む)を洗い流します。
12. iNKT細胞の回復をさらに高めるには、マイナスの分率を10分間300 x gで遠心し、新しいLSまたはMSカラムでステップ3.6-3.7を繰り返します。正の分数をプールし、セル数を決定します。FACS分析のために正と負の両方の分画の50 μLを保ちます。
13. FACS 分析による精製ステップを確認してください。サンプルには、脾臓ex-vivo、T細胞濃縮画分、iNKT正分数およびiNKT負分数が含まれる。CD19-FITC、IAb-FITC、CD1d-テトラマーPE、TCRβ-APCおよびDAPIで細胞を染色する。
    注意:iVα14-Jα18マウスからの期待される回復は2x10⁶ iNKT細胞です。

4. iNKT細胞の活性化と拡張

1. マウスTアクチベーター抗CD3/CD28磁気ビーズを1:1比で精製したiNKT細胞を活性化します。
   1. iNKT細胞正分を5分間300xgで遠心分離する。
   2. 一方、適切な量の抗CD3/CD28磁気ビーズをチューブに移し、等量のPBS、渦を5秒間追加します。チューブを磁石の上に1分間置き、上清を捨てます。
   3. マグネットからチューブを取り出し、洗浄した磁気ビーズを完全なRPMI(RPMI 1640培地、10%熱不活性化FCS、1mMナトリウムピルビン酸、1%非必須アミノ酸、10 U/mlペニシリンおよびストレプトマイシン、50μM βメルカプトエタノール)を5x50 m5Nkの細胞に適切な体積で再懸濁する。遠心分離されたiNKT陽性画分を再中断するには、この懸濁液を使用します。
2. 細胞懸濁液のプレート1 mL(5 x 10⁵ iNKT細胞)と抗CD3/CD28磁気ビーズを48ウェルプレートに20 U/mL IL-2とし、37°Cでインキュベートします。
3. 5日後、10 ng/mL IL-7を追加します。
4. 合流率が80~90%になったら細胞を1:2に分割し、常に20U/mL IL-2と10 ng/mL IL-7を追加します。これらの条件では、iNKT細胞は最大15日間拡張することができる。

結果

本稿に記載されたプロトコルは、図1Aに要約した免疫磁気分離プロセスを介してiVa14−Ja18トランスジェニックマウスの脾臓からiNKT細胞を濃縮することを可能にする。総脾臓T細胞は、まずB細胞および単球を枯渇させることによって負選択され、続いてiNKT細胞陽性免疫磁気選別がPBS-57脂質抗原を装填したCD1dテトラマーにより、iNKT細胞のみを特異的に染色することを可能?...

ディスカッション

ここでは、何百万ものすぐに使用できるiNKT細胞を得るための再現性と実現可能なプロトコルを示します。生体内ではこれらの細胞の貧弱性のために、それらを拡張する方法が非常に必要とされました。我々が提案するプロトコルは、特定の計装も多数のマウスも必要としない。iVα14-Jα18トランスジェニックマウスを意図的に利用し、処置に必要なマウスの数を減らした。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution	in house		0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4
anti-FITC Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Brefeldin A	Sigma	B6542
CD19 -FITC	Biolegend	115506	clone 6D5
CD1d-tetramer -PE	NIH tetramer core facility		mouse PBS57-Cd1d-tetramers
CD4 -PeCy7	Biolegend	100528	clone RM4-5
Fc blocker	BD Bioscience	553142
Fetal Bovine Serum (FBS)	Euroclone	ECS0186L	heat-inactivated and filtered .22 before use
FOXP3 Transcription factor staining buffer	eBioscience	00-5523-00
H2 (IAb) -FITC	Biolegend	114406	clone AF6-120.1
hrIL-2	Chiron Corp
Ionomycin	Sigma	I0634
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS buffer (MB)	in house		0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Non-essential amino acids	Gibco	11140-035
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep)	Lonza	15140-122
PermWash	BD Bioscience	51-2091KZ
PFA	Sigma	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	EuroClone	ECB4004L
PMA	Sigma	P1585
Pre-Separation Filters (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
Recombinat Mouse IL-7	R&D System	407-ML-025
RPMI 1640 with glutamax	Gibco	61870-010
sodium pyruvate	Gibco	11360-039
TCRβ -APC	Biolegend	109212	clone H57-597
αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads	Gibco	11452D
β-mercaptoethanol	Gibco	31350010