In vitro ve in vivo Çalışmalar için Fare Değişmez Doğal Öldürücü T Hücrelerinin Saflaştırılması ve Genişlemesi

Özet

Değişmez doğal öldürücü T (iNKT) hücrelerini fare dalağını zenginleştirmek ve in vitro ve in vivo çalışmalar için uygun sayılara genişletmek için hızlı ve sağlam bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Değişmez Doğal Öldürücü T (iNKT) hücreleri, polimorfik olmayan MHC sınıfı I ile ilişkili molekül CD1d. Preklinik ve klinik çalışmalar kanser, otoimmünite ve bulaşıcı hastalıklarda iNKT hücreleri için bir rolü desteklemektedir. iNKT hücreleri türler boyunca çok korunmuş ve cd1d eksikliği veya iNKT eksikliği olan fareler de dahil olmak üzere fare modelleri tarafından araştırılmıştır ve yarı sabit TCR'ye özgü CD1d tetramerleri veya mAb'leri olan farelerde ve erkeklerde bunları kesin olarak tespit etme imkanı. Bununla birlikte, iNKT hücreleri nadirdir ve herhangi bir çalışma için yönetilebilir sayılara ulaşmak için genişletilmeleri gerekir. Birincil fare iNKT hücre hattı in vitro'nun üretimi zor olduğu kanıtlandığı için, iNKT hücrelerinin 30 kat daha sık olduğu iVα14-Jα18 transgenik farelerden (iVα14Tg) dalak iNKT hücrelerini arındırmak ve genişletmek için sağlam bir protokol kurduk. Burada birincil dalak iVα14Tg iNKT hücrelerinin immünomanyetik bir ayırma işlemi ile zenginleştirilerek yaklaşık% 95-98 saf iNKT hücresi elde edilebileceğini gösteriyoruz. Saflaştırılmış iNKT hücreleri anti-CD3/CD28 boncuklar artı IL-2 ve IL-7 ile uyarılır ve bu da kültürün %85-99 saflığı ile +14 gün boyunca 30 kat genişlemeye neden olur. Genişletilmiş iNKT hücreleri kolayca genetik olarak manipüle edilebilir, aktivasyon ve fonksiyon in vitro mekanizmalarını parçalamak için paha biçilmez bir araç sağlar ve daha da önemlisi, in vivo olarak benimsenen transfer üzerine.

Giriş

Değişmez Doğal öldürücü T hücreleri (iNKT hücreleri), MHC sınıfı I ile ilgili molekül CD1d²tarafından sunulan lipid antijenleri için özel olan sınırlı bir dizi farklı Vβ zinciri¹ile eşleştirilmiş, farelerde yarı sabit bir αβ T hücre reseptörü (TCR) ifade eden doğuştan gelen T lenfositlerdir. iNKT hücreleri, bir CD4⁺ ve bir CD4^- alt kümesi üreten birkaç olgunlaşma aşaması^3,4, ile meydana gelen timusta zaten aktif / doğuştan gelen bir efektör fenotipinin alınmasıyla sonuçlanan bir agonist seçim programına tabidir. Bu program sayesinde, iNKT hü....

Protokol

Burada açıklanan prosedürler San Raffaele Bilim Enstitüsü'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) (no. 1048) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

NOT: Tüm işlemler steril koşullarda yapılmalıdır. Kullanılan tüm reaktifler Malzeme Tablosundalistelenmiştir.

1. Dalak işleme

1. Kurumsal politikaya göre CO_2'yi soluma yoluyla iVα14-Jα18 farelerini ötenazi edin.
   NOT: iVα14-Jα18 fareler 8 haftalık veya daha büyük olmalıdır. Hücrelerin in vivo transferinden reddedilmesini önlemek için, dişi farelerden izole edilen hücrelerin hem erkek hem de dişi alıcılarda be....

Sonuçlar

Bu yazıda açıklanan protokol, iVa14-Ja18 transgenik farelerin dalağının iNKT hücrelerini Şekil 1A'daözetlenen bir immünmanyetik ayırma işlemi ile zenginleştirmeyi sağlar. Toplam dalak T hücreleri önce B hücreleri ve monositler tükenerek negatif olarak seçilir, ardından PBS-57 lipid antijen yüklü CD1d tetramerler ile iNKT hücre pozitif immünomanyetik sıralama, özellikle sadece iNKT hücrelerini lekelemeyi sağlar. Bu protokol, tek bir iVa14-Ja18 Tg farenin dalağın?.......

Tartışmalar

Burada milyonlarca kullanıma hazır iNKT hücresi elde etmek için tekrarlanabilir ve uygulanabilir bir protokol gösteriyoruz. Bu hücrelerin vivo'nun azlığı nedeniyle, onları genişletmek için bir yönteme çok ihtiyaç vardı. Önerdiğimiz protokol ne belirli bir enstrümantasyon ne de yüksek sayıda fare gerektiriyor. İşlem için gerekli fare sayısını azaltmak için iVα14-Jα18 transgenik farelerden bilerek yararlandık.

iVα14-Jα18 transgenik farelerden iNKT hücre genişle.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution	in house		0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4
anti-FITC Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Brefeldin A	Sigma	B6542
CD19 -FITC	Biolegend	115506	clone 6D5
CD1d-tetramer -PE	NIH tetramer core facility		mouse PBS57-Cd1d-tetramers
CD4 -PeCy7	Biolegend	100528	clone RM4-5
Fc blocker	BD Bioscience	553142
Fetal Bovine Serum (FBS)	Euroclone	ECS0186L	heat-inactivated and filtered .22 before use
FOXP3 Transcription factor staining buffer	eBioscience	00-5523-00
H2 (IAb) -FITC	Biolegend	114406	clone AF6-120.1
hrIL-2	Chiron Corp
Ionomycin	Sigma	I0634
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS buffer (MB)	in house		0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Non-essential amino acids	Gibco	11140-035
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep)	Lonza	15140-122
PermWash	BD Bioscience	51-2091KZ
PFA	Sigma	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	EuroClone	ECB4004L
PMA	Sigma	P1585
Pre-Separation Filters (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
Recombinat Mouse IL-7	R&D System	407-ML-025
RPMI 1640 with glutamax	Gibco	61870-010
sodium pyruvate	Gibco	11360-039
TCRβ -APC	Biolegend	109212	clone H57-597
αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads	Gibco	11452D
β-mercaptoethanol	Gibco	31350010