טיהור והתרחבות של עכבר Invariant טבעי רוצח תאי T עבור במבחנה ו in vivo מחקרים

Summary

אנו מתארים פרוטוקול מהיר וחזק להעשרת תאי T (iNKT) של הרוצח הטבעי invariant מטחול העכבר ולהרחיב אותם במבחנה למספרים מתאימים למחקרי מבחנה ומחקרי ויוו.

Abstract

תאי T (iNKT) Invariant Natural Killer הם לימפוציטים דמויי T מולדים המבטאים קולטן תאי T חצי-אינבראנטים שמורים (TCR) הספציפי לאנטיגנים שומנים עצמיים או מיקרוביאליים המוצגים על ידי המולקולה הלא פולימורפית מסוג MHC I הקשורה למולקולה CD1d. מחקרים פרה-קליניים וקליניים תומכים בתפקיד לתאי iNKT בסרטן, אוטואימוניות ומחלות זיהומיות. תאי iNKT נשמרים מאוד בכל המינים והחקירה שלהם התאפשרה על ידי מודלים של עכברים, כולל עכברים לקויי CD1D או iNKT לקויים, ואת האפשרות לזהות אותם באופן חד משמעי בעכברים וגברים עם tetramers CD1d או mAbs ספציפי עבור TCR חצי invariant. עם זאת, תאי iNKT הם נדירים ויש להרחיב אותם כדי להגיע למספרים הניתנים לניהול עבור כל מחקר. מכיוון שהדור של קו תאי iNKT הראשי של העכבר במבחנה הוכח כקשה, הקמנו פרוטוקול חזק לטיהור והרחבת תאי iNKT טחול מהעכברים מהונדסים iVα14-Jα18 (iVα14Tg), שבו תאי iNKT שכיחים פי 30. אנו מראים כאן כי תאי iNKT iVα14Tg הטחול העיקריים יכולים להיות מועשרים באמצעות תהליך הפרדה אימונומגנטי, המניב כ 95-98% תאי iNKT טהורים. תאי iNKT המטוהרים מגורים על ידי חרוזי אנטי CD3/CD28 בתוספת IL-2 ו- IL-7, וכתוצאה מכך התרחבות פי 30 ביום +14 של התרבות עם טוהר של 85-99%. תאי iNKT המורחבים ניתנים למניפולציה גנטית בקלות, ומספקים כלי רב ערך לנתח מנגנוני הפעלה ותפקוד במבחנה, וחשוב מכך, גם עם העברה מאמצת ב- vivo.

Introduction

תאי T קטלניים טבעיים Invariant (תאי iNKT) הם לימפוציטים דמויי T מולדים המבטאים קולטן תאי T חצי אינבריאנט (TCR), שנוצר בעכברים על ידי שרשרת Vα14-Jα18 בשילוב עם קבוצה מוגבלת של שרשראות Vβ מגוונות¹, אשר ספציפי עבור אנטיגנים שומנים המוצגים על ידי סוג MHC מולקולה הקשורה I CD1d². תאי iNKT עוברים תוכנית בחירה אגוניסטית וכתוצאה מכך רכישת פנוטיפ מפעיל מופעל / מולד כבר התימוס, אשר מתרחשת דרך מספר שלבי^{התבגרות 3,4}, הפקת CD4⁺ ו CD4^- קבוצת משנה. באמצעות תוכנית זו, תאי iNKT לרכוש פנוטיפים מחולל T מובחנים (T_H),כלומר T_H1 (iNKT1), T_H2 (iNKT2) ו T_H17 (iNKT17), לזיהוי על ידי הביטוי של גורמי שעתוק T-bet, GATA3, PLZF, ו RORγt, בהתאמה⁵. תאי iNKT מזהים מגוון של שומנים מיקרוביאליים אך הם גם מגיבים בעצמם נגד שומנים אנדוגניים כי הם upregulated בהקשר של מצבים פתולוגיים של מתח התא ונזק לרקמות, כגון סרטן ו autoimunity². עם ההפעלה, תאי iNKT לווסת את הפונקציות של תאים אחרים מחוללי מערכת החיסון המולדת והסתגלותית באמצעות מגע ישיר וייצור ציטוקינים².

החקירות של תאי iNKT כבר הקלו על ידי דגמי עכבר, כולל CD1d-לקוי או עכברים Jα18-לקוי, ועל ידי ייצור של tetramers CD1D טעון אנטיגן בתוספת הדור של נוגדנים חד שבטיים (mAbs) ספציפי עבור TCR חצי invariant האנושי. עם זאת, הדור של קו תא iNKT עכבר ראשי הוכיח קשה. כדי לאפיין טוב יותר את פונקציות האנטיטומור של תאי iNKT ולהשתמש בהם לטיפול תאי מאמץ, הקמנו פרוטוקול לטיהור והרחבת תאי iNKT טחול של iVα14-Jα18 עכברים מהונדסים (iVα14Tg)⁶, שבו תאי iNKT שכיחים פי 30 מאשר בעכברים מסוג בר.

תאי iNKT מורחבים ניתנים לניצול לבדיקות במבחנה, וב-vivo עם המעבר חזרה לעכברים. בהגדרה זו, למשל, הראינו את ההשפעות החזקות שלהם נגד הגידול⁷. יתר על כן, אין ויטרו מורחב iNKT תאים נוחים לשינוי פונקציונלי באמצעות העברת^גניםאו עריכה לפני הזרקתם ב vivo 8 , המאפשר ניתוח פונקציונלי תובנה של מסלולים מולקולריים, כמו גם לסלול את הדרך לטיפולים תאים מתקדמים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הנהלים המתוארים כאן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) (מס '1048) במכון המדעי סן רפאלה.

הערה: כל ההליכים חייבים להתבצע בתנאים סטריליים. כל הריאגנטים המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. עיבוד טחול

1. המתת חסד iVα14-Jα18 עכברים על ידי שאיפת CO₂ על פי המדיניות המוסדית.
   הערה: עכברי iVα14-Jα18 חייבים להיות בני 8 שבועות ומעלה. כדי למנוע דחייה של התאים מהעברת in vivo של התאים, שקול כי תאים מבודדים מעכברים נקבות ניתן להעביר באופן מאמץ הן אצל נמענים זכריים והן נקבות, בעוד תאים מבודדים מעכברים זכרים ניתן להעביר רק אצל נמענים זכרים. לניסויים במבחנה, אין לקחת בחשבון הטיה מגדרית. ניתן לאגד עכברים נוספים על מנת להשיג תאים נוספים.
2. לנתח את טחול העכבר ולרסק אותו דרך מסננת תא 70 ננומטר כדי לקבל השעיה של תא יחיד ב 10 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) עם 2% סרום בקר עוברי (FBS).
3. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
4. הסר את supernatant על ידי היפוך ולעבד עם מאגר תמיסת אריתרוציטים. Resuspend את גלולה התא עם 1 מ"ל של ACK סטרילי (אמוניום-כלוריד-אשלגן) חוצץ ליסינג, דגירה במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, ולחסום עם 5 מ"ל של PBS עם 2% FBS. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
   הערה: ACK זמין מסחרית; הוא מורכב מפתרון של 0.15 M NH₄Cl, 10 מ"מ KHCO₃, ו 0.1 מ"מ Na₂EDTA (חומצה אתילנדימינטראצטית) מומס H₂O דו-ליסטיל, pH 7.2-7.4. אם תוצרת בית, לעקר על ידי סינון עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
5. הסר את סופר-טבעי על ידי היפוך. resuspend גלולה התא ב 3 מ"ל של PBS עם 2% FBS ולהסיר שאריות שומן על ידי pipetting. במידת הצורך, מאגר התאים המגיעים מעכברים שונים.
6. ספר את התאים ולשמור 50 μL לניתוח FACS.

2. העשרת תאי T

הערה: עבור שלבי העשרה, לעבוד מהר, לשמור על התאים קרים ולהשתמש פתרונות מקוררים מראש ב 4 °C (4 °F) לילה ולאחר מכן המשיך על קרח

1. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
2. resuspend כל התאים בכמות המתאימה של PBS עם 2% FBS (500 μL עבור 10⁷ תאים) וחוסם Fc (2.5 μL x 10⁷ תאים); דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
3. יש לשטוף עם 1-2 מ"ל של מאגר הפרדת MACS (MB) לכל 10⁷ תאים וצנטריפוגה בסך הכל ב-300 x גרם למשך 10 דקות.
   הערה: מאגר MACS זמין מסחרית. הוא מורכב PBS pH 7.2, 0.5% אלבומין סרום בקר (BSA), ו 2 mM EDTA. אם תוצרת בית, לעקר על ידי סינון עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
4. הסר את supernatant על ידי היפוך ולהכתים את התאים עם CD19-FITC ו H2(IA^b)-FITC (להשתמש 5 μL x 10⁷ תאים ב 100 μL של MB). מערבבים היטב ודגרה במשך 15 דקות בחושך ב 4 -8 מעלות צלזיוס.
5. לשטוף תאים על ידי הוספת 1−2 מ"ל של MB לכל 10⁷ תאים וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות.
6. פיפטה את supernatant לחלוטין resuspend גלולה התא ב 90 μL של MB לכל 10⁷ תאים סה"כ. הוסף 10 μL של מיקרו-אבקסיסים נגד FITC לכל 10⁷ תאים בסך הכל. מערבבים היטב ודגרה במשך 15 דקות בחושך ב 4 -8 מעלות צלזיוס.
7. לשטוף את התאים על ידי הוספת 1−2 מ"ל של MB לכל 10⁷ תאים וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות.
8. פיפטה את supernatant לחלוטין resuspened עד 1.25 x 10⁸ תא ב 500 μL של MB.
9. מקם עמודת LD בשדה המגנטי של מפריד MACS כדי להמשיך לדלדול. כדי להימנע מסתימה, החל מסנן לפני הפרדה על עמודת LD ושטוף ב- 2 מ"ל של MB.
10. כאשר מאגר העמודות ריק, החל את ההשעיה של התא על המסנן. אסוף את התאים הלא עם תווית שעוברים דרך העמודה.
11. לשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של MB, רק כאשר מאגר העמודות ריק. לאסוף את השפכים הכוללים, אשר יועשר בתאי T, ולספור את התאים. שמור תמיד 50 μL לניתוח FACS.

3. העשרת תאי iNKT

1. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant על ידי היפוך.
2. להכתים את התאים עם CD1d-tetramer-PE (עכבר PBS57-CD1d-טטרמר), על פי טיטציה נוגדן ב 50 μL של MB לכל 10⁶ תאים. מערבבים היטב ודגרה במשך 30 דקות בחושך על קרח.
   הערה: ההליך יכול להתבצע גם עם tetramers mCD1d עם תווית APC וחרוזים נגד APC; התאמת הפלואורכרום המשמש את הכתמים הבאים בהתאם. בפרוטוקול הנוכחי השתמשנו בעכבר PBS-57-CD1d-tetramers שסופקו על ידי NIH. αgalactosylceramide (αGal-Cer) הוא אנטיגן טיפוסי המוכר על ידי תאי iNKT; PBS-57 הוא אנלוגי של αGal-Cer עם מסיסות משופרת⁹; מתקן NIH Tetramer מספק ליגנד PBS-57 המורכב מטטרמה CD1D. עם זאת, דימרים CD1d אחרים / tetramers / dextramers זמינים מסחרית והוא יכול להיות טעון עם אנטיגן שומנים כמו αGal-Cer. אנו מדמיינים את האפשרות להתאים את הפרוטוקול לשימושם.
3. לשטוף את התאים על ידי הוספת 1−2 מ"ל של MB לכל 10⁷ תאים וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות.
4. Pipette את supernatant לחלוטין resuspend גלולה התא ב 80 μL של MB לכל 10⁷ תאים כוללים. הוסף 20 μL של מיקרואורגניזמים נגד PE לכל 10⁷ תאים בסך הכל. מערבבים היטב ודגרה במשך 15 דקות בחושך ב 4 -8 מעלות צלזיוס.
5. לשטוף תאים על ידי הוספת 1−2 מ"ל של MB לכל 10⁷ תאים וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות.
6. פיפטה את supernatant לחלוטין resuspened עד 10⁸ תאים ב 500 μL של MB. אחרת אם תאים עולים על 10⁸, להתאים את עוצמת הקול בהתאם.
7. על פי ספירת התאים, מקם עמודת LS (עד 10⁸) או MS (עד 10⁷) בשדה המגנטי של מפריד MACS. לשטוף את העמודה עם MB (3 מ"ל עבור LS, 500 μL עבור MS).
8. החל את ההשעיה של התא על העמודה.
9. לאסוף תאים ללא תווית שעוברים. לשטוף את העמודה 3 פעמים על-ידי הוספת הכמות המתאימה של MB (3 x 3 מ"ל עבור עמודת LS, 3 x 500 μL עבור עמודת MS) רק כאשר מאגר העמודות ריק. הקולחים הכוללים הוא השבר השלילי.
10. הסר את העמודה מהשדה המגנטי והצב אותה על צינור אוסף חדש.
11. Pipette MB בעמודה (5 מ"ל עבור עמודת LS או 1 מ"ל עבור עמודת MS); לדחוף את הבוכנה שסופקה לתוך העמודה לשטוף את השבר החיובי (מועשר בתאי iNKT).
12. כדי להגדיל עוד יותר את התאוששות תאי iNKT, צנטריפוגה השבר השלילי ב 300 x g במשך 10 דקות ולחזור על שלבים 3.6-3.7 עם עמודה חדשה LS או MS. איחד את השברים החיוביים וקבע את ספירת התאים. שמור 50 μL של שברים חיוביים ושליליים לניתוח FACS.
13. בדוק את שלבי הטיהור על-ידי ניתוח FACS. הדגימות כוללות: טחול ex-vivo, שבר מועשר בתא T, שבר חיובי iNKT ושבר שלילי iNKT. להכתים את התאים עם: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC ו- DAPI.
    הערה: ההתאוששות הצפויה מעכבר iVα14-Jα18 הוא 2x10⁶ תאי iNKT .

4. הפעלה והרחבה של תאים iNKT

1. הפעל תאי iNKT מטוהרים עם עכבר T activator נגד CD3/ CD28 חרוזים מגנטיים ביחס של 1:1.
   1. צנטריפוגה שבר חיובי תא iNKT ב 300 x g במשך 5 דקות.
   2. בינתיים להעביר את הנפח המתאים של חרוזים מגנטיים נגד CD3 /CD28 לצינור ולהוסיף נפח שווה של PBS, מערבולת במשך 5 שניות. מניחים את הצינור על מגנט במשך דקה אחת ומשליכים את supernatant.
   3. הסר את הצינור מן המגנט ו resuspend החרוזים המגנטיים שטף בנפח הנכון של RPMI מלא (RPMI 1640 בינוני, 10% FCS מומת בחום, 1 mM נתרן pyruvate, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, 10 פניציללין U /ml וסטרפטומיצין, 50 μM β-Mercaptoethanol) כדי לקבל 5 x 10⁵ תאי iNKT ב 1 מ"ל. השתמש במתלה זה כדי resuspend שבר חיובי iNKT צנטריפוגה.
2. צלחת 1 מ"ל של השעיית התא (5 x 10⁵ תאי iNKT) וחרוזים מגנטיים נגד CD3/CD28 בלוח 48 טוב עם 20 U /mL IL-2 ודגרה ב 37 °C (5 °F).
3. לאחר 5 ימים, להוסיף 10 ננוגרם / מ"ל IL-7.
4. לפצל את התאים 1:2 כאשר הם מגיעים 80-90% מפגש, תמיד להוסיף 20U / מ"ל IL-2 ו 10 ng / mL IL-7. בתנאים אלה, תאי iNKT ניתן להרחיב עד 15 ימים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מאפשר להעשיר תאי iNKT מהטחול של עכברים מהונדסים iVa14-Ja18 באמצעות תהליך הפרדה אימונומגנטי המסוכם באיור 1A. תאי T הטחול הכולל נבחרים לראשונה באופן שלילי על ידי דלדול תאי B ומונוציטים, ואחריו מיון אימונומגנטי חיובי של תאי iNKT עם Tetramers CD1d טעון של אנטיגן אנט?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן אנו מראים פרוטוקול לשחזור וישים כדי להשיג מיליוני תאי iNKT מוכנים לשימוש. בשל המחסור של תאים אלה ב vivo, שיטה להרחיב אותם היה נחוץ מאוד. הפרוטוקול שאנו מציעים אינו דורש מכשור מסוים ולא מספר גבוה של עכברים. ניצלנו עכברים מהונדסים iVα14-Jα18 בכוונה כדי להפחית את מספר העכברים הדרושים להליך.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution	in house		0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4
anti-FITC Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Brefeldin A	Sigma	B6542
CD19 -FITC	Biolegend	115506	clone 6D5
CD1d-tetramer -PE	NIH tetramer core facility		mouse PBS57-Cd1d-tetramers
CD4 -PeCy7	Biolegend	100528	clone RM4-5
Fc blocker	BD Bioscience	553142
Fetal Bovine Serum (FBS)	Euroclone	ECS0186L	heat-inactivated and filtered .22 before use
FOXP3 Transcription factor staining buffer	eBioscience	00-5523-00
H2 (IAb) -FITC	Biolegend	114406	clone AF6-120.1
hrIL-2	Chiron Corp
Ionomycin	Sigma	I0634
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS buffer (MB)	in house		0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Non-essential amino acids	Gibco	11140-035
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep)	Lonza	15140-122
PermWash	BD Bioscience	51-2091KZ
PFA	Sigma	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	EuroClone	ECB4004L
PMA	Sigma	P1585
Pre-Separation Filters (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
Recombinat Mouse IL-7	R&D System	407-ML-025
RPMI 1640 with glutamax	Gibco	61870-010
sodium pyruvate	Gibco	11360-039
TCRβ -APC	Biolegend	109212	clone H57-597
αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads	Gibco	11452D
β-mercaptoethanol	Gibco	31350010