Purification et expansion de cellules T tueuses naturelles invariantes de souris pour des études in vitro et in vivo

Résumé

Nous décrivons un protocole rapide et robuste pour enrichir les cellules T tueuses naturelles invariantes (iNKT) de la rate de souris et les étendre in vitro à des nombres appropriés pour des études in vitro et in vivo.

Résumé

Les cellules T tueuses naturelles invariantes (iNKT) sont des lymphocytes T de type inné exprimant un récepteur de lymphocytes T semi-invariants (TCR) conservé spécifique aux antigènes lipidiques auto-microbiens ou microbiens présentés par la molécule non polymorphe CD1d liée au CMH de classe I. Des études précliniques et cliniques soutiennent un rôle pour les cellules iNKT dans le cancer, l’auto-immunité et les maladies infectieuses. Les cellules iNKT sont très conservées dans toutes les espèces et leur étude a été facilitée par des modèles murins, y compris des souris déficientes en CD1d ou déficientes en iNKT, et la possibilité de les détecter sans équivoque chez les souris et les hommes atteints de tétramères CD1d ou de mAbs spécifiques du TCR semi-invariant. Cependant, les cellules iNKT sont rares et elles doivent être étendues pour atteindre des nombres gérables pour toute étude. Parce que la génération de lignée cellulaire iNKT primaire de souris in vitro s’est avérée difficile, nous avons mis en place un protocole robuste pour purifier et développer les cellules iNKT spléniques des souris transgéniques iVα14-Jα18 (iVα14Tg), dans lesquelles les cellules iNKT sont 30 fois plus fréquentes. Nous montrons ici que les cellules iNKT spléniques primaires iVα14Tg peuvent être enrichies par un processus de séparation immunomagnétique, produisant environ 95 à 98% de cellules iNKT pures. Les cellules iNKT purifiées sont stimulées par des billes anti-CD3/CD28 plus IL-2 et IL-7, ce qui entraîne une expansion de 30 fois par jour +14 de la culture avec une pureté de 85-99%. Les cellules iNKT élargies peuvent être facilement manipulées génétiquement, fournissant un outil inestimable pour disséquer les mécanismes d’activation et de fonctionnement in vitro et, plus important encore, également lors du transfert adoptif in vivo.

Introduction

Les lymphocytes T tueurs naturels invariants (cellules iNKT) sont des lymphocytes T innés qui expriment un récepteur semi-invariant des lymphocytes T αβ (TCR), formé chez la souris par une chaîne Vα14-Jα18 invariante associée à un ensemble limité de chaînes Vβ diverses¹, ce qui est spécifique aux antigènes lipidiques présentés par la molécule CD1d²liée au CMH de classe I. Les cellules iNKT subissent un programme de sélection des agonistes entraînant l’acquisition d’un phénotype effecteur activé/inné déjà dans le thymus, qui se produit à travers plusieurs étapes de maturation^3,4, produisant un sous-ensemble CD4⁺ et un CD4^- . Grâce à ce programme, les cellules iNKT acquièrent des phénotypes effecteurs T auxiliaires (T_H)distincts, à savoir T_H1 (iNKT1), T_H2 (iNKT2) et T_H17 (iNKT17), identifiables par l’expression des facteurs de transcription T-bet, GATA3, PLZF et RORγt, respectivement⁵. Les cellules iNKT reconnaissent une gamme de lipides microbiens mais sont également auto-réactives contre les lipides endogènes qui sont régulés à la hausse dans le contexte de situations pathologiques de stress cellulaire et de lésions tissulaires, telles que le cancer et l’auto-immunité². Lors de l’activation, les cellules iNKT modulent les fonctions d’autres cellules effectrices immunitaires innées et adaptatives par contact direct et production de cytokines².

Les recherches sur les cellules iNKT ont été facilitées par des modèles murins, y compris des souris déficientes en CD1d ou en Jα18, et par la production de tétramères CD1d chargés d’antigènes ainsi que par la génération d’anticorps monoclonaux (mAbs) spécifiques au TCR semi-invariant humain. Cependant, la génération de la lignée cellulaire iNKT de souris primaire s’est avérée difficile. Pour mieux caractériser les fonctions antitumorales des cellules iNKT et les utiliser pour la thérapie cellulaire adoptive, nous avons mis en place un protocole pour purifier et étendre les cellules iNKT spléniques de souris transgéniques iVα14-Jα18 (iVα14Tg)⁶, dans lequel les cellules iNKT sont 30 fois plus fréquentes que chez les souris de type sauvage.

Les cellules iNKT expansées peuvent être exploitées pour des essais in vitro et in vivo lors du transfert chez la souris. Dans ce contexte, par exemple, nous avons montré leurs puissants effets anti-tumoraux⁷. De plus, les cellules iNKT étendues in vitro se prêtent à une modification fonctionnelle via le transfert ou l’édition de gènes avant leur injection in vivo^8,ce qui permet une analyse fonctionnelle perspicace des voies moléculaires et ouvre la voie à des thérapies cellulaires avancées.

Protocole

Les procédures décrites ici ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) (n° 1048) de l’Institut scientifique de San Raffaele.

REMARQUE: Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles. Tous les réactifs utilisés sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Traitement de la rate

1. Euthanasier les souris iVα14-Jα18 par inhalation de CO₂ selon la politique institutionnelle.
   REMARQUE: Les souris iVα14-Jα18 doivent être âgées de 8 semaines ou plus. Pour éviter le rejet des cellules du transfert in vivo des cellules, considérez que les cellules isolées de souris femelles peuvent être transférées de manière adoptive à la fois chez des receveurs mâles et femelles, tandis que les cellules isolées de souris mâles ne peuvent être transférées que chez des receveurs mâles. Pour les expériences in vitro, aucun préjugé sexiste ne doit être pris en compte. Plus de souris peuvent être regroupées afin d’obtenir plus de cellules.
2. Disséquez la rate de la souris et écrasez-la à travers une passoire cellulaire de 70 nm pour obtenir une suspension unicellulaire dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 2% de sérum bovin fœtal (FBS).
3. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
4. Retirer le surnageant par inversion et traiter avec un tampon de lyse érythrocytaire. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de tampon de lysage stérile ACK (ammonium-chlorure-potassium), incuber pendant 3 min à température ambiante et bloquer avec 5 mL de PBS avec 2% de FBS. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
   REMARQUE: ACK est disponible dans le commerce; il se compose d’une solution de 0,15 M_NH4Cl, 10 mM de_KHCO3et 0,1 mM_na2EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) dissous dans du_H2Obidistillé, pH 7,2-7,4. S’il est fait maison, stériliser par filtration avec un filtre de 0,22 μm.
5. Retirez le surnageant par inversion. Remettre en suspension la pastille de cellule dans 3 mL de PBS avec 2% de FBS et éliminer les résidus de graisse par pipetage. Si nécessaire, mettez en commun les cellules provenant de différentes souris.
6. Comptez les cellules et conservez 50 μL pour l’analyse FACS.

2. Enrichissement des lymphocytes T

REMARQUE: Pour les étapes d’enrichissement, travaillez rapidement, gardez les cellules froides et utilisez des solutions pré-refroidies à 4 ° C pendant la nuit, puis conservées sur de la glace

1. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
2. Remettre en suspension toutes les cellules dans la quantité appropriée de PBS avec 2% FBS (500 μL pour 10⁷ cellules) et un bloqueur Fc (2,5 μL x 10⁷ cellules); incuber pendant 15 min à température ambiante (RT).
3. Laver avec 1-2 mL de tampon de séparation MACS (MB) par 10⁷ cellules totales et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.
   REMARQUE: Le tampon MACS est disponible dans le commerce. Il se compose de PBS pH 7,2, 0,5% d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM EDTA. S’il est fait maison, stériliser par filtration avec un filtre de 0,22 μm.
4. Retirer le surnageant par inversion et colorer les cellules avecCD19-FITC et H2(IA b)-FITC (utiliser 5 μL x 10⁷ cellules dans 100 μL de MB). Bien mélanger et incuber pendant 15 min dans l’obscurité à 4-8 °C.
5. Laver les cellules en ajoutant 1−2 mL de MB pour 10⁷ cellules et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.
6. Pipette complètement le surnageant et remise en suspension de la pastille de cellule dans 90 μL de MB pour 10⁷ cellules au total. Ajouter 10 μL de microbilles anti-FITC pour 10⁷ cellules au total. Bien mélanger et incuber pendant 15 min dans l’obscurité à 4-8 °C.
7. Lavez les cellules en ajoutant 1−2 mL de MB pour 10⁷ cellules et centrifugez à 300 x g pendant 10 min.
8. Pipette complètement le surnageant et remise en suspension jusqu’à 1,25 x 10⁸ cellules dans 500 μL de MB.
9. Placez une colonne LD dans le champ magnétique du séparateur MACS pour procéder à l’épuisement. Pour éviter le colmatage, appliquez un filtre de pré-séparation sur la colonne LD et rincez avec 2 mL de MB.
10. Lorsque le réservoir de colonne est vide, appliquez la suspension cellulaire sur le filtre. Collectez les cellules non étiquetées qui traversent la colonne.
11. Laver 3 fois avec 1 mL de Mb, uniquement lorsque le réservoir de colonne est vide. Recueillir l’effluent total, qui sera enrichi en lymphocytes T, et compter les cellules. Gardez toujours 50 μL pour l’analyse FACS.

3. Enrichissement des cellules iNKT

1. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min et retirer le surnageant par inversion.
2. Colorez les cellules avec CD1d-tétramère-PE (souris PBS57-CD1d-tétramère), selon le titrage des anticorps dans 50 μL de MB pour 10⁶ cellules. Bien mélanger et incuber pendant 30 min dans l’obscurité sur de la glace.
   REMARQUE: La procédure peut également être effectuée avec des tétramères mCD1d marqués APC et des billes anti-APC; ajuster les fluorochromes utilisés dans la coloration suivante en conséquence. Dans le protocole actuel, nous avons utilisé des tétramères PBS-57-CD1d de souris fournis par les NIH. L’αgalactosylcéramide (αGal-Cer) est l’antigène prototypique reconnu par les cellules iNKT ; PBS-57 est un analogue de l’αGal-Cer avec une solubilité améliorée⁹; l’installation de tétramères des NIH fournit un ligand PBS-57 complexé à des tétramères CD1d. Cependant, d’autres dimères/tétramères/dextramères CD1d sont disponibles dans le commerce et peuvent être chargés d’un antigène lipidique comme αGal-Cer. Nous envisageons la possibilité d’ajuster le protocole pour leur utilisation.
3. Lavez les cellules en ajoutant 1−2 mL de MB pour 10⁷ cellules et centrifugez à 300 x g pendant 10 min.
4. Pipette complètement le surnageant et remise en suspension de la pastille de cellule dans 80 μL de MB pour 10⁷ cellules au total. Ajouter 20 μL de microbilles anti-PE pour 10⁷ cellules au total. Bien mélanger et incuber pendant 15 min dans l’obscurité à 4-8 °C.
5. Laver les cellules en ajoutant 1−2 mL de MB pour 10⁷ cellules et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.
6. Pipette complètement le surnageant et remise en suspension jusqu’à 10⁸ cellules dans 500 μL de MB. Sinon, si les cellules dépassent 10⁸, ajustez le volume en conséquence.
7. Selon le nombre de cellules, placez une colonne LS (jusqu’à 10⁸⁾ou MS (jusqu’à^{10 7)}dans le champ magnétique du séparateur MACS. Rincer la colonne avec MB (3 mL pour LS, 500 μL pour MS).
8. Appliquez la suspension de cellule sur la colonne.
9. Collectez les cellules non marquées qui passent à travers. Lavez la colonne 3 fois en ajoutant la quantité appropriée de Mo (3 x 3 mL pour la colonne LS, 3 x 500 μL pour la colonne MS) uniquement lorsque le réservoir de colonne est vide. L’effluent total est la fraction négative.
10. Retirez la colonne du champ magnétique et placez-la sur un nouveau tube collecteur.
11. Pipette MB sur la colonne (5 mL pour la colonne LS ou 1 mL pour la colonne MS); poussez le piston fourni dans la colonne et débusquez la fraction positive (enrichie en cellules iNKT).
12. Pour augmenter encore la récupération de la cellule iNKT, centrifugez la fraction négative à 300 x g pendant 10 minutes et répétez les étapes 3.6-3.7 avec une nouvelle colonne LS ou MS. Regroupez les fractions positives et déterminez le nombre de cellules. Conservez 50 μL de fractions positives et négatives pour l’analyse FACS.
13. Vérifiez les étapes de purification par analyse FACS. Les échantillons comprennent: la rate ex vivo, la fraction enrichie en lymphocytes T, la fraction positive iNKT et la fraction négative iNKT. Colorez les cellules avec : CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC et DAPI.
    REMARQUE: La récupération attendue d’une souris iVα14-Jα18 est de 2x10⁶ cellules iNKT .

4. Activation et expansion des cellules iNKT

1. Activez les cellules iNKT purifiées avec des billes magnétiques anti-CD3/CD28 de l’activateur T de souris dans un rapport de 1:1.
   1. Centrifuger la fraction positive de la cellule iNKT à 300 x g pendant 5 min.
   2. Pendant ce temps, transférez le volume approprié de billes magnétiques anti-CD3 / CD28 dans un tube et ajoutez un volume égal de PBS, vortex pendant 5 secondes. Placez le tube sur un aimant pendant 1 minute et jetez le surnageant.
   3. Retirez le tube de l’aimant et remettez en suspension les billes magnétiques lavées dans le volume approprié de RPMI complet (milieu RPMI 1640, FCS inactivé à la chaleur à 10%, pyruvate de sodium 1 mM, 1% d’acides aminés non essentiels, 10 U / ml de pénicylline et de streptomycine, 50 μM β-mercaptoéthanol) pour avoir 5 x 10⁵ cellules iNKT dans 1 mL. Utilisez cette suspension pour remettre en suspension la fraction positive iNKT centrifuge.
2. Plaque 1 mL de la suspension cellulaire (5 x 10⁵ cellules iNKT) et perles magnétiques anti-CD3/CD28 dans une plaque de 48 puits avec 20 U/mL IL-2 et incuber à 37 °C.
3. Après 5 jours, ajouter 10 ng/mL IL-7.
4. Divisez les cellules 1:2 lorsqu’elles atteignent 80-90% de confluence, ajoutez toujours 20U/mL IL-2 et 10 ng/mL IL-7. Dans ces conditions, les cellules iNKT peuvent être étendues jusqu’à 15 jours.

Résultats

Le protocole décrit dans ce manuscrit permet d’enrichir les cellules iNKT de la rate de souris transgéniques iVa14-Ja18 grâce à un processus de séparation immunomagnétique résumé à la figure 1A. Les lymphocytes T de la rate totale sont d’abord sélectionnés négativement en épuisant les cellules B et les monocytes, suivis par le tri immunomagnétique positif des cellules iNKT avec des tétramères CD1d chargés d’antigène lipidique PBS-57, qui permettent de colorer spécifi...

Discussion

Nous montrons ici un protocole reproductible et réalisable pour obtenir des millions de cellules iNKT prêtes à l’emploi. En raison de la rareté de ces cellules in vivo, une méthode pour les étendre était fortement nécessaire. Le protocole que nous proposons ne nécessite ni une instrumentation particulière ni un nombre élevé de souris. Nous avons exploité des souris transgéniques iVα14-Jα18 à dessein pour réduire le nombre de souris nécessaires à la procédure.

Un autre pr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution	in house		0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4
anti-FITC Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Brefeldin A	Sigma	B6542
CD19 -FITC	Biolegend	115506	clone 6D5
CD1d-tetramer -PE	NIH tetramer core facility		mouse PBS57-Cd1d-tetramers
CD4 -PeCy7	Biolegend	100528	clone RM4-5
Fc blocker	BD Bioscience	553142
Fetal Bovine Serum (FBS)	Euroclone	ECS0186L	heat-inactivated and filtered .22 before use
FOXP3 Transcription factor staining buffer	eBioscience	00-5523-00
H2 (IAb) -FITC	Biolegend	114406	clone AF6-120.1
hrIL-2	Chiron Corp
Ionomycin	Sigma	I0634
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS buffer (MB)	in house		0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Non-essential amino acids	Gibco	11140-035
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep)	Lonza	15140-122
PermWash	BD Bioscience	51-2091KZ
PFA	Sigma	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	EuroClone	ECB4004L
PMA	Sigma	P1585
Pre-Separation Filters (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
Recombinat Mouse IL-7	R&D System	407-ML-025
RPMI 1640 with glutamax	Gibco	61870-010
sodium pyruvate	Gibco	11360-039
TCRβ -APC	Biolegend	109212	clone H57-597
αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads	Gibco	11452D
β-mercaptoethanol	Gibco	31350010