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요약

우리는 마우스 비장에서 불변 자연 킬러 T (iNKT) 세포를 풍부하게하고 체외 및 생체 내 연구에 적합한 숫자로 시험관 내에서 확장하기 위해 신속하고 강력한 프로토콜을 설명합니다.

초록

불변성 천연 킬러 T(iNKT) 세포는 비다형성 MHC 급 I 관련 분자 CD1d.전임상 및 임상 연구에서 암, 자가면역 및 감염성 질환에서 iNKT 세포에 대한 역할을 지원하는 자체 또는 미생물 지질 항원에 특이적인 반불변성 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 선천성 T 림프구체이다. iNKT 세포는 종 전체에 걸쳐 매우 보존되고 그들의 조사는 CD1d 결핍 또는 iNKT 결핍 마우스를 포함하여 마우스 모델에 의해 촉진되고, 반 불변 TCR에 특이적인 CD1d 테트라머 또는 mAbs를 가진 마우스와 남자에서 명백하게 검출할 가능성. 그러나 iNKT 세포는 드물며 모든 연구를 위해 관리 가능한 숫자에 도달하기 위해 확장되어야 합니다. 시험관 내의 1차 마우스 iNKT 세포주의 생성이 어렵다는 것이 입증되어 왔으니, iVα14-Jα18 트랜스제닉 마우스(iVα14Tg)로부터 비장 iNKT 세포를 정화하고 확장하기 위한 견고한 프로토콜을 설정하여 iNKT 세포가 30배 더 빈번하다. 우리는 여기에서 1 차적인 비장 iVα14Tg iNKT 세포가 면역자기 분리 과정을 통해 풍부해질 수 있다는 것을, 대략 95-98% 순수한 iNKT 세포를 산출한다는 것을 여기에서 보여줍니다. 정제된 iNKT 세포는 안티 CD3/CD28 구슬플러스 IL-2 및 IL-7에 의해 자극되며, 85-99%의 순도로 배양의 날 +14까지 30배 확장됩니다. 확장된 iNKT 세포는 쉽게 유전적으로 조작될 수 있으며, 생체 외에서 활성화 및 기능 메커니즘을 해부하고, 더 중요한 것은 생체 내에서의 입양 전달시에도 귀중한 도구를 제공합니다.

서문

불변성 천연 킬러 T 세포(iNKT 세포)는 반불변성 αβ T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 선천성 T 림프구체로, 비정체 Vα14-Jα18 사슬에 의해 마우스에서 형성된 다양한 Vβ 사슬1의한정된 세트와 결합되어 MHC 급 I-관련 분자CD1 CD에의해 제시된 지질 항원특이이다. iNKT 세포는 여러 성숙 단계3,4를통해 발생하는 흉선에서 이미 활성화 / 타고난 이펙터 표현형을 획득하는 결과 고뇌선별 프로그램을 거치며 CD4+ 및 CD4- 하위 세트를 생성합니다. 이 프로그램을 통해 iNKT 세포는 T-bet, GATA3, PLZF 및 RORγt의 발현에 의해 식별 가능한T-H(iNKT1),TH2(iNKT2) 및 TH17(iNKT17)과 같은 T 조머(TH)이펙터 표현형을 획득한다. iNKT 세포는 다양한 미생물 지질을 인식하지만 암 및 자가 면역2와같은 세포 스트레스 및 조직 손상의 병리학적 상황의 맥락에서 조절되는 내인성 지질에 대해 자가 반응성이다. 활성화시, iNKT 세포는 직접 접촉 및 사이토카인 생성2를통해 다른 선천적이고 적응형 면역 이펙터 세포의 기능을 조절한다.

iNKT 세포의 조사는 CD1d-결핍 또는 Jα18-결핍 마우스를 포함하는 마우스 모델, 및 항원적 로드 CD1d 테트라머의 생산에 의해 촉진되었으며, 인간 반투명 TCR에 특이적인 단일 클론 항체(mAbs)의 생성에 의해 촉진되었다. 그러나, 1차 마우스 iNKT 세포주의 생성은 어렵다는 것을 입증했습니다. iNKT 세포의 항종양 기능을 보다 잘 특성화하고 입양 세포 치료에 활용하기 위해 iVα14-Jα18 트랜스제닉 마우스(iVα14Tg)6의비장 iNKT 세포를 정화하고 확장하는 프로토콜을 설정하여 iNKT 세포가 야생형 마우스보다 30배 더 빈번합니다.

확장된 iNKT 세포는 시험관 내 분석, 그리고 생쥐로 다시 옮겨질 때 생체 내에서 악용될 수 있다. 이 설정에서, 예를 들어, 우리는 그들의 강력한 항 종양 효과 보여 주었다7. 더욱이, 시험관 내 확장된 iNKT 세포는 생체 내에서 그들의 주입 전에 유전자 전달 또는 편집을 통해 기능적 변형을 가능하게하며,분자 통로의 통찰력 있는 기능적 분석을 허용하고, 또한 진보된 세포 치료를 위한 길을 포장할 수 있다.

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프로토콜

여기에 설명 된 절차는 검토 및 샌 라파엘과학 연구소에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) (No. 1048)에 의해 승인되었다.

참고: 모든 절차는 멸균 조건에서 수행해야 합니다. 사용되는 모든 시약은 재료 표에나열됩니다.

1. 비장 가공

  1. 기관 정책에 따라 CO2의 흡입에 의한 iVα14-Jα18 마우스의 안락사.
    참고: iVα14-Jα18 마우스는 8주 이상이어야 한다. 세포의 생체 내 전달에서 세포의 거부를 피하기 위해, 여성 마우스로부터 분리 된 세포가 남성 및 여성 수신자 모두에서 입양적으로 전달 될 수 있음을 고려, 남성 마우스에서 분리 된 세포는 남성 받는 사람에서만 전송 될 수 있습니다. 시험관 내 실험의 경우 성 편견을 고려해야 합니다. 더 많은 마우스를 더 많은 세포를 얻기 위하여 풀로 만들 수 있습니다.
  2. 마우스 비장을 해부하고 70 nm 세포 스트레이너를 통해 분쇄하여 2%의 태아 소 혈청(FBS)을 가진 10mL의 인산완충식염수(PBS)에서 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
  3. 300 x g의 원심분리기는 5분 동안.
  4. 반전으로 상체를 제거하고 적혈구 용해 버퍼로 처리합니다. 멸균 ACK (암모늄 - 염화물 칼륨) 리싱 버퍼의 1 mL로 세포 펠릿을 다시 중단하고, 실온에서 3 분 동안 배양하고, 2 %의 FBS와 PBS의 5 mL로 차단합니다. 300 x g의 원심분리기는 5분 동안.
    참고: ACK는 시판됩니다. 0.15MNH4Cl,10mM KHCO3,0.1 mM Na2EDTA(에틸렌디아민트라아세트산)의 용액으로 구성되어 있으며, 비스티스틸H2O, pH 7.2-7.4에 용해된다. 수제 경우 0.22 μm 필터로 여과에 의해 살균하십시오.
  5. 반전으로 상체를 제거합니다. 2% FBS로 PBS의 3mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 파이펫팅하여 지방 잔류물을 제거합니다. 필요한 경우 다른 마우스에서 나오는 세포를 풀.
  6. 세포를 계산하고 FACS 분석을 위해 50 μL을 유지합니다.

2. T 세포 농축

참고: 농축 단계의 경우, 빠르게 작업하고, 세포를 차갑게 유지하고 밤새 4°C에서 미리 냉각된 다음 얼음 위에 보관하는 솔루션을 사용합니다.

  1. 300 x g의 원심분리기는 5분 동안.
  2. 2% FBS (107 셀에 대한 500 μL) 및 Fc 차단기 (2.5 μL x 107 셀)로 PBS의 적절한 양으로 모든 세포를 재중단; 실온(RT)에서 15분 동안 배양합니다.
  3. 107 총 세포 당 MACS 분리 버퍼 (MB)의 1-2 mL로 세척하고 10 분 동안 300 x g에서 원심분리기.
    참고: MACS 버퍼는 시판됩니다. PBS pH 7.2, 0.5% 소세럼 알부민(BSA), 2mM EDTA로 구성되어 있습니다. 수제 경우 0.22 μm 필터로 여과에 의해 살균하십시오.
  4. CD19-FITC 및 H2(IA b)-FITC(MB의 100 μL에서 5 μL x 107 셀 사용)로 셀을 반전하고 얼룩지게 하여 상체를 제거합니다. 잘 섞고 4-8°C에서 어둠 속에서 15분 동안 배양하십시오.
  5. 107 세포 당 MB의 1-2 mL을 추가하고 10 분 동안 300 x g의 원심분리기를 추가하여 세포를 씻으시면 셀을 씻으신다.
  6. 상체에서 완전히 피펫을 벗겨 내고 총107개의 세포당 MB의 90 μL에서 셀 펠릿을 재연한다. 총 셀10개당 10μL의 FITC 마이크로비드를 추가합니다. 잘 섞고 4-8°C에서 어둠 속에서 15분 동안 배양하십시오.
  7. 107 세포 당 MB의 1-2 mL을 추가하고 10 분 동안 300 x g에서 원심분리기를 추가하여 세포를 씻으시면 셀을 씻으시다.
  8. 상체에서 완전히 피펫을 벗겨 MB의 500 μL에서 최대 1.25 x 108 셀을 다시 일시 중지합니다.
  9. 고갈을 진행하기 위해 MACS 분리기의 자기장에 LD 컬럼을 배치합니다. 막힘을 피하려면 LD 열에 사전 분리 필터를 적용하고 MB의 2mL로 헹신다.
  10. 컬럼 저장소가 비어 있으면 셀 서스펜션을 필터에 적용합니다. 열을 통과하는 레이블이 없는 셀을 수집합니다.
  11. 컬럼 저장소가 비어있을 때만 MB1mL로 3번 씻으시다. T 세포에서 농축될 총 유출물을 수집하고 세포를 계산합니다. 항상 FACS 분석을 위해 50 μL을 유지하십시오.

3. iNKT 세포 농축

  1. 300 x g의 원심분리기는 5분 동안 반전으로 상판을 제거합니다.
  2. CD1d-테트라머-PE(마우스 PBS57-CD1d-테트라머)를 가진 세포를 염색하여106세포당 MB의 50μL의 항체 적정에 따라 염색한다. 잘 섞어서 얼음 의 어둠 속에서 30 분 동안 배양하십시오.
    참고: 절차는 APC 라벨이 부착된 mCD1d 테트라머 및 안티 APC 구슬로도 수행될 수 있습니다. 다음에 사용되는 불소크롬을 조정하여 그에 따라 염색한다. 본 프로토콜에서 우리는 NIH에서 제공하는 마우스 PBS-57-CD1d-테트라머를 사용했습니다. αgalactosylceramide (αGal-Cer)는 iNKT 세포에 의해 인식되는 전형적인 항원이다; PBS-57은 용해도가 향상된 αGal-Cer의유사체입니다9; NIH 테트라머 시설은 CD1d 테트라머에 PBS-57 리간드 복합체를 제공합니다. 그러나, 다른 CD1d 디머/테트라머/dextramers는 시판되고 αGal-Cer로서 리피딕 항원으로 적재될 수 있다. 우리는 그들의 사용에 대 한 프로토콜을 조정할 수 있는 가능성을 상상.
  3. 107 세포 당 MB의 1-2 mL을 추가하고 10 분 동안 300 x g에서 원심분리기를 추가하여 세포를 씻으시면 셀을 씻으시다.
  4. 피펫은 완전히 상체에서 피펫과 107 총 세포 당 MB의 80 μL에서 셀 펠릿을 다시 중단합니다. 총 세포10개당 20μL의 안티-PE MicroBeads를 추가합니다. 잘 섞고 4-8°C에서 어둠 속에서 15분 동안 배양하십시오.
  5. 107 세포 당 MB의 1-2 mL을 추가하고 10 분 동안 300 x g의 원심분리기를 추가하여 세포를 씻으시면 셀을 씻으신다.
  6. 상체에서 완전히 피펫을 벗겨 MB의 500 μL에서 최대 108셀을 재연합니다. 그렇지 않으면 셀이 108을초과하는 경우, 그에 따라 부피를 조정한다.
  7. 세포 수에 따라, LS(최대108)또는 MS(최대107)컬럼을 MACS 분리기의 자기장에 놓는다. MB(LS용 3mL, MS용 500 μL)로 컬럼을 헹구는다.
  8. 셀 서스펜션을 열에 적용합니다.
  9. 지나갈 레이블이 없는 셀을 수집합니다. 컬럼 저장소가 비어있을 때만 적절한 양의 MB(LS 열의 경우 3 x 3mL, MS 열의 경우 3 x 500 μL)를 추가하여 컬럼을 3회 세척합니다. 총 유출물은 음수 분획입니다.
  10. 자기장에서 컬럼을 제거하고 새 수집 튜브에 배치합니다.
  11. 열에 파이펫 MB (LS 열5 mL 또는 MS 열에 대한 1 mL); 제공된 플런저를 컬럼으로 밀어 넣고 양극분수(iNKT 셀에서 농축)를 플러시합니다.
  12. iNKT 세포 회수를 더욱 증가시키기 위해, 10분 동안 음극을 300 x g로 원심분리하고 새로운 LS 또는 MS 컬럼을 사용하여 3.6-3.7 단계를 반복한다. 양수 분수를 풀고 셀 수를 결정합니다. FACS 분석을 위해 양수 분수와 음수 50μL을 유지합니다.
  13. FACS 분석을 통해 정화 단계를 확인합니다. 샘플은 다음과 같습니다: 비장 전 비보, T 세포 농축 분수, iNKT 양성 분획 및 iNKT 음수 분획. 염색 세포: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-테트라머-PE, TCRβ-APC 및 DAPI.
    참고: iVα14-Jα18 마우스에서 예상되는 회복은 2x106 iNKT 셀이다.

4. iNKT 세포 활성화 및 확장

  1. 마우스 T 활성제 안티 CD3/CD28 자기 구슬을 1:1 비율로 정제된 iNKT 세포를 활성화합니다.
    1. 원심분리기 iNKT 셀 양성 분획은 300 x g에서 5분 동안.
    2. 한편 안티 CD3/CD28 마그네틱 구슬의 적절한 부피를 튜브로 옮기고 5초 동안 동일한 양의 PBS, 소용돌이를 추가합니다. 튜브를 자석에 1분간 놓고 상체를 폐기합니다.
    3. 자석에서 튜브를 제거하고 완전한 RPMI (RPMI 1640 매체, 10 % 열 비활성화 FCS, 1 mM 나트륨 피루바테, 1 % 비 필수 아미노산, 10 U /ml 페니실린 및 연쇄 상감,50M β μ-메르카포) 5NK의 적절한 부피에서 세척 된 자기 구슬을 재중단합니다. 원심 분리 된 iNKT 양수 분획을 다시 일시 중지하려면이 현탁액을 사용합니다.
  2. 플레이트 1 mL의 셀 서스펜션(5 x 105 iNKT 세포) 및 안티 CD3/CD28 자기 구슬은 20 U/mL IL-2를 장착한 48웰 플레이트에서 37°C에서 배양한다.
  3. 5일 후 10 ng/mL IL-7을 추가합니다.
  4. 80-90% 합류에 도달하면 세포를 1:2로 분할하고 항상 20U/mL IL-2 및 10 ng/mL IL-7을 추가합니다. 이러한 조건에서, iNKT 세포는 최대 15일 동안 확장될 수 있다.

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결과

본 원고에 기재된 프로토콜은 도 1A에요약된 면역자기 분리 과정을 통해 iVa14-Ja18 형질성 마우스의 비장으로부터 iNKT 세포를 풍부하게 할 수 있다. 총 비장 T 세포는 먼저 B 세포와 단세포를 고갈하여 부정적으로 선택되고, PBS-57 지질 항원로드 CD1d 테트라머를 사용하여 iNKT 세포 양성 면역자기 분류를 통해 iNKT 세포만 구체적으로 염색할 수 있게 된다. 이 프로토콜은 단일 iVa14-Ja...

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토론

여기에서 우리는 수백만 개의 즉시 사용할 수 있는 iNKT 셀을 얻기 위해 재현 가능하고 실행 가능한 프로토콜을 보여줍니다. 생체 내에서 이러한 세포의 빈약성으로 인해 이를 확장하는 방법이 매우 필요했습니다. 우리가 제안하는 프로토콜은 특정 계측이나 많은 수의 마우스를 필요로하지 않습니다. 당사는 절차에 필요한 마우스의 수를 줄이기 위해 iVα14-Jα18 형질전환 마우스를 의도적으로 이용?...

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공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

우리는 파올로 델라보나와 줄리아 카소라티에게 과학적 지원과 원고의 비판적 독서에 감사드립니다. 우리는 또한 마우스 CD1d 테트라머에 대한 NIH 테트라머 코어 시설에 감사드립니다. 이 연구는 폰다지오네 카리플로 그랜트 2018-0366 (M.F.) 및 이탈리아 암 연구 협회 (AIRC) 펠로우십 2019-22604 (G.D.에)에 의해 투자되었습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solutionin house0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4
anti-FITC MicrobeadsMiltenyi Biotec130-048-701
anti-PE MicrobeadsMiltenyi Biotec130-048-801
Brefeldin ASigmaB6542
CD19 -FITCBiolegend115506clone 6D5
CD1d-tetramer -PENIH tetramer core facilitymouse PBS57-Cd1d-tetramers
CD4 -PeCy7Biolegend100528clone RM4-5
Fc blockerBD Bioscience553142
Fetal Bovine Serum (FBS)EurocloneECS0186Lheat-inactivated and filtered .22 before use
FOXP3 Transcription factor staining buffereBioscience00-5523-00
H2 (IAb) -FITCBiolegend114406clone AF6-120.1
hrIL-2Chiron Corp
IonomycinSigmaI0634
LD ColumnsMiltenyi Biotec130-042-901
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
MACS buffer (MB)in house0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA
MS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-201
Non-essential amino acidsGibco11140-035
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep)Lonza15140-122
PermWashBD Bioscience51-2091KZ
PFASigmaP6148
Phosphate buffered saline (PBS)EuroCloneECB4004L
PMASigmaP1585
Pre-Separation Filters (30 µm)Miltenyi Biotec130-041-407
Recombinat Mouse IL-7R&D System407-ML-025
RPMI 1640 with glutamaxGibco61870-010
sodium pyruvateGibco11360-039
TCRβ -APCBiolegend109212clone H57-597
αCD3CD28 mouse T activator DynabeadsGibco11452D
β-mercaptoethanolGibco31350010

참고문헌

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