使用可编程自动纳升注射器在 黑色果蝇 中植入肿瘤异体

摘要

该方案为 果蝇 肿瘤的初始和持续世代同种异体移植到成年宿主的腹部提供了详细的指导，用于研究肿瘤的各个方面。使用自动注射器设备，与传统的手动方法相比，研究人员可以提高效率和肿瘤产量。

摘要

该协议描述了使用自动纳升注射装置在 黑色腹果蝇 中对肿瘤的同种异体移植。 通过使用自动注射器设备，与使用手动注射器获得的移植结果相比，经过培训的操作员可以获得更有效和一致的移植结果。在这里，我们按时间顺序涵盖了主题:从 果蝇 线的交叉，到原发肿瘤的诱导和解剖，原发性肿瘤移植到新的成年宿主中，以及肿瘤的持续代际移植以进行扩展研究。作为演示，这里我们使用Notch细胞内结构域（NICD）过表达诱导的唾液腺假想环肿瘤进行世代移植。这些肿瘤可以首先在弱小唾液腺假想环内的过渡区微环境中可靠地诱导，然后在体内同种异体移植和培养，以研究持续的肿瘤生长，进化和转移。这种同种异体移植方法可用于潜在的药物筛选计划，以及研究肿瘤 - 宿主相互作用。

引言

该方案为果 蝇 幼虫唾液腺（SG）假想环肿瘤的同种异体移植到使用自动纳升注射装置（例如，Nanoject）的成年宿主的腹部提供了分步指导。该方案还为随后将肿瘤重新同种异体移植到新一代成年宿主中提供了方向，这为继续纵向研究肿瘤特征提供了机会，例如肿瘤进化和肿瘤 - 宿主相互作用。该协议也可以应用于药物筛选实验。

该方法的开发是为了提高使用手动注射器¹在果蝇中进行肿瘤同种异体移植的疗效，其吸力和注射力通常不一致，导致肿瘤同种异体移植的次优结果。自动注射器装置提供更好的控制，并可降低同种异体移植物后的苍蝇死亡率。训练有素的操作员使用自动注射器可以实现超过90%的宿主存活率，而使用手动注射器时约为80%¹。同种异体移植后第8-12天的总肿瘤获得率为60%-80%。平均注射时间也从使用手动注射器的每只苍蝇30-40秒提高到使用自动注射器的每只苍蝇20-25秒。

该协议是在 果蝇 肿瘤同种异体移植中使用自动注射器装置的首批几个方案之一。最近的一项研究还使用自体注射器进行肿瘤神经干细胞的同种异体移植²。以前，在 果蝇 中使用自动注射器来研究细菌毒力³，寄生虫感染和宿主防御⁴，以及筛查不同化合物^{的生物活性5}。我们的方案使自动注射器装置适应肿瘤注射使用，并寻求为 果蝇 研究人员提供更高质量和更一致的结果，同时节省他们相当大的时间。该方案不仅可以用于肿瘤的同种异体移植，还可以针对类似口径的野生型和突变组织的同种异体移植^进行定制6。

该方案中使用的果蝇NICD肿瘤最初是由Yang等人引入的，SG假想环过渡区是一个"肿瘤热点"，表现出高水平的内源性Janus激酶/信号传感器和转录激活剂（JAK-STAT）和c-Jun N-末端激酶（JNK）活性。此外，过渡区具有高水平的基质金属蛋白酶-1（MMP1）⁷，这使得该区域特别有利于肿瘤发生。仅通过NICD过表达激活缺口通路就足以持续启动肿瘤形成。这些肿瘤随后可以进行同种异体移植，以允许研究广泛的主题，包括肿瘤细胞分裂，侵袭和肿瘤 - 宿主相互作用。

研究方案

1. SG假想环肿瘤的制备

1. 具有 UAS-NICD 基因型（雄性:10-15只苍蝇）和 阿克特-加仑4，UAS-GFP / CyO;浴缸 -Gal80^ts （处女雌性:10-15只苍蝇）的杂交成蝇，并允许它们在18°C下繁殖1天。 选定的成年苍蝇应为5-9天大，以确保高生育能力。
2. 让成蝇在18°C下在小瓶中含有的苍蝇食物中产卵24小时，然后除去成蝇。
   注意:苍蝇食物是使用 果蝇 库存中心8的标准玉米粉食物配方准备^的。每个小瓶应包含约10mL的苍蝇食物。
3. 让鸡蛋在18°C下孵育6天。 在此期间，幼虫将孵化。
4. 将含有幼虫的小瓶转移到29°C培养箱中并再孵育7天。
   注意:根据具体的实验设计，此孵育步骤是可选的。

2. 用于同种异体移植的成年野生型 果蝇 的制备

1. 用100%CO₂麻醉野生型或适当的突变成年苍蝇，并根据性别对苍蝇进行分类。雄性和雌性苍蝇都可以用作肿瘤宿主。
2. 将一块5厘米长的飞带固定在显微镜载玻片上，粘性面朝上，方法是用两块较小的胶带固定，每端一条。
3. 通过将苍蝇的翅膀粘在胶带上来固定苍蝇。在操纵苍蝇时使用镊子。
   1. 对60-80只用作同种异体移植物受体的成年苍蝇重复上述步骤。
      注意:最好将苍蝇组织成整齐的行，其身体轴彼此平行对齐，以便以后进行更省时的注射过程。 图 1 显示了以这种方式录制的宿主苍蝇行。

3. 自动注射器的组装

1. 将自动注射器设备和电源线连接到控制器盒。
   1. 将注射体积设置为 59.8 nL。这将有助于在同种异体移植期间保持适量的吸力和注射力。
2. 将控制器盒和自动注射器放在光学显微镜的相对侧。
   注意:对于右撇子操作员，控制盒应放置在显微镜的左侧，注射器应放在右侧。对于左撇子操作员，反之亦然。
3. 准备3.5英寸玻璃毛细管，用镊子夹住封闭端来使用。
   1. 使用四步式微量移液器拉拔器处理玻璃毛细管的一端，并使用以下规格将热量加热到狭窄的封闭端:热量 = 650，力 = 200，距离 = 8。将毛细管整齐地放入拉拔器装置中，并在输入上述设置后运行程序。
   2. 使用镊子以大约60°的角度夹住毛细管，使末端更锋利，以便轻松进入成年苍蝇腹部¹。参见 图2 ，了解毛细管夹持良好的示例。
4. 轻轻拧下喷油器的盖子。按住" 空 "按钮以推进注射器针头，直到显示其总长度的70%-80%。要加速毛细管推进，请按一次" 填充 "按钮，同时按住" 清空 "按钮。
5. 使用注射器在玻璃毛细管中填充矿物油。然后，小心地将玻璃毛细管插入注射器针头上，直到前者牢固地连接到注射器的橡胶塞上。现在拧紧喷油器盖。
   1. 擦去玻璃毛细管盖外表面的矿物油残留物，以避免在同种异体移植过程中污染介质。

4. SG假想环肿瘤的解剖

1. 选择其中一种幼虫并将其转移到装有100μL施耐德培养基的解剖板中，以制备SG假想环肿瘤解剖。
   注意:只有携带肿瘤的标本才会保持幼虫状态。这是因为肿瘤生长会延缓幼虫的发育和进展⁹.三分之二的标本不会携带肿瘤，因此会进展到蛹/成虫。
   1. 对于解剖和同种异体移植，请使用放大倍率范围为10x-20x的立体显微镜。
2. 使用一对镊子固定幼体中段，用另一对镊子捏住幼虫头部，并纵向施加拉伸力。
3. 找到幼虫的Y形SG，并将其与其余的幼虫组织¹⁰分离。
4. 通过切除邻近组织来解剖和分离SG假想环肿瘤。参见 图3 ，了解这种解剖过程的描述。
5. 根据研究需要，重复步骤4.1-4.4，对另外10至20个SG假想环肿瘤。

5. 原发性SG假想环肿瘤的同种异体移植

1. 将毛细血管浸入含有原发性SG假想环肿瘤的施耐德培养基中。按住" 填充 "按钮，用施耐德培养基填充玻璃毛细管，一直到顶部的 0.5 cm 段。这个顶部部分应该继续充满矿物油。
   注意:通过按一次" 空 "按钮，同时按住" 填充 "按钮来加速此过程。
2. 找到原发性肿瘤，然后按" 填充 "按钮，直到肿瘤被吸入毛细血管。
   1. 确保肿瘤位于毛细血管的尖端或距离毛细血管尖端几毫米。这有助于避免肿瘤漂移并在毛细管内所含的溶液中丢失。参见 图4A ，以演示位于毛细血管中的适当肿瘤位置。
3. 在显微镜载玻片上找到固定在胶带上的成年苍蝇。使用镊子，轻轻按住下腹部。然后，用毛细血管刺穿腹部的下侧角质层。按" 空 "按钮，直到肿瘤进入新的宿主腹部。有关此技术的演示，请参见 图 4B 。
4. 使用镊子，轻轻捏住主机的翅膀，将其从胶带上取下。将宿主放入装有新鲜食物的新小瓶中。最好在注射后的初始24小时内将小瓶侧向放置。每个小瓶最多只能包含20只苍蝇。
   注意:一些寄主苍蝇在注射后会失去翅膀和身体上的其他伤口，如果小瓶直立放置，可能会粘在苍蝇食物上。
5. 重复步骤5.2至5.4，将剩余的原发性肿瘤移植到新的成年宿主中。
6. 将毛细管放入尖锐物品的容器中，并清除自动注射器外部的矿物油残留物，然后再将设备装回盒子中。
7. 将宿主的小瓶在室温下储存1天，然后将小瓶转移到29°C的孵育室中。每2-3天将飞行主机转移到新小瓶。
8. 每天监控飞行主机并计算存活率。一周后，肿瘤应在带有荧光适配器的立体显微镜下可见，并且可以连续监测其大小和进展。

6. 移植肿瘤的再同种异体移植

1. 同种异体移植后约10-14天，使用荧光显微镜筛查在宿主腹部生长的肿瘤。
2. 用CO₂ 麻醉宿主，并将其置于装有100μL施耐德培养基的解剖板中。使用两对镊子将生长的同种异体移植肿瘤从宿主中解剖出来。
   1. 使用一对镊子压住腹部，另一对镊子切开腹部角质层，暴露同种异体移植的肿瘤¹。
   2. 使用荧光标记物作为指导，尽可能小心地从附着的宿主组织中分离肿瘤。
3. 重复步骤6.2以制备两到三个额外的同种异体移植肿瘤。
4. 将含有收获的肿瘤的解剖板转移到光学显微镜的载物台上。
5. 使用无菌针头将肿瘤解剖成适合毛细血管大小的小块。
6. 重复步骤4.1-4.5以制备新一代成人宿主，并重复步骤5.1-5.7以完成肿瘤的同种异体移植。
   注意:与原发性肿瘤相比，非原发性肿瘤的成功率通常更高。
7. 对研究中使用的每一代后续苍蝇重复步骤6.1-6.6。
   注意:选择适合实验需求的 果蝇 宿主系。

结果

在这里，我们使用纳升注射自动注射装置对SG假想环肿瘤进行了世代同位异体移植，并用共聚焦激光扫描显微镜进行了随后的肿瘤活体成像，从而更深入地研究了肿瘤生长，肿瘤细胞迁移和肿瘤 - 宿主相互作用等主题。安装苍蝇时，将它们粘在显微镜载玻片上，并通过聚二甲基硅氧烷（PDMS）块¹¹约束它们。

图5A 具有^第 1代（G1）...

讨论

肿瘤同种异体移植可以帮助研究人员解决果蝇肿瘤生长和进展过程中出现的某些问题。其中一个挑战是规避在原发性肿瘤培养期间携带肿瘤的幼虫或成虫的过早死亡¹²。在这种情况下，持续的肿瘤同种异体移植允许肿瘤无限生长，这有助于肿瘤生长，转移和进化的纵向研究。肿瘤同种异体移植也可用于评估宿主肿瘤相互作用的各个方面^7，

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal Laser Scanning Microscope	Zeiss	LSM 980	Also known as "Zeiss LSM 980"
Cornmeal Fly Food	Bloomington Drosophila Stock Center	N/A	Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food"
Dissection Needle (30Gx1/2)	BD PrecisionGlide	305106
Dissection Plate	Fisher Scientific	12-565B
Fly Tape	Fisherbrand	159015A
Fluoresence Adapter for Stero Microscope	Electron Microscopy Sciences	SFA-UV	Also known as "NightSea Fluorescence Adapter"
Fluoresence Microscope	Zeiss	495015-0001-000	Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8"
Forceps	Fine Science Tools	11251-10	Also known as "Dumont #5 Forceps"
Glass Capillary (3.5'')	Drummond	3-000-203-G/X
Glue	Elmer	E305	Also known as "Elmer Washabale Clear Glue"
Light Microscope	Zeiss	435063-9010-100	Also known as "Zeiss Stemi 305"
Micropipette Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Also known as "Four Step Micropipette Puller"
Nanoject Apparatus	Drummond	3-000-204	Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector"
Schneider's Medium	ThermoFisher	21720001
Syringe (27G x1/2)	BD PrecisionGlide	305109
Vial	Fisherbrand	AS507