Tumorallotransplantation in Drosophila melanogaster mit einem programmierbaren Auto-Nanoliter-Injektor

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet detaillierte Anleitungen für die anfängliche und fortgesetzte Allotransplantation von Drosophila-Tumoren in den Bauch erwachsener Wirte zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Neoplasie. Mit einem Autoinjektor-Gerät können Forscher eine verbesserte Effizienz und Tumorausbeute im Vergleich zu herkömmlichen, manuellen Methoden erzielen.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Allotransplantation von Tumoren in Drosophila melanogaster unter Verwendung eines Auto-Nanoliter-Injektionsapparates. Mit dem Einsatz eines Autoinjektor-Geräts können geschulte Bediener effizientere und konsistentere Transplantationsergebnisse erzielen als mit einem manuellen Injektor. Hier behandeln wir Themen in chronologischer Weise: von der Kreuzung der Drosophila-Linien über die Induktion und Dissektion des Primärtumors, die Transplantation des Primärtumors in einen neuen erwachsenen Wirt bis hin zur fortgesetzten Generationentransplantation des Tumors für erweiterte Studien. Als Demonstration verwenden wir hier Notch intracellular domain (NICD) overexpression induced salivary doil imaginal ring tumors for generational transplantation. Diese Tumoren können zunächst zuverlässig in einer Übergangszonen-Mikroumgebung innerhalb von Larven-Speicheldrüsen-imaginären Ringen induziert und dann in vivo allotransplantiert und kultiviert werden, um das kontinuierliche Tumorwachstum, die Evolution und die Metastasierung zu untersuchen. Diese Allotransplantationsmethode kann in potenziellen Arzneimittel-Screening-Programmen sowie zur Untersuchung von Tumor-Wirt-Wechselwirkungen nützlich sein.

Einleitung

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Allotransplantation von imaginären Ringtumoren der Drosophila-Larvenspeicheldrüse (SG) in den Bauch erwachsener Wirte unter Verwendung eines Auto-Nanoliter-Injektionsapparats (z. B. Nanoject). Dieses Protokoll liefert auch Anweisungen für die anschließende Reallograftierung von Tumoren in neue Generationen von erwachsenen Wirten, was Möglichkeiten für eine fortgesetzte Längsschnittuntersuchung von Tumormerkmalen wie Tumorevolution und Tumor-Wirt-Interaktionen bietet. Das Protokoll kann auch auf Arzneimittel-Screening-Experimente angewendet werden.

Diese Methode wurde entwickelt, um die Wirksamkeit der Durchführung einer Tumorallotransplantation bei Drosophila unter Verwendung manueller Injektoren¹ zu verbessern, die in ihren Saug- und Injektionskräften oft inkonsistent sind, was zu suboptimalen Ergebnissen für die Tumorallotransplantation führt. Ein Autoinjektor-Apparat bietet eine bessere Kontrolle und kann zu niedrigeren Raten der Fliegensterblichkeit nach dem Allotransplantat führen. Ein geschulter Bediener konnte mit dem Autoinjektor eine Wirtsüberlebensrate von über 90% erreichen, verglichen mit etwa 80%, wenn der manuelle Injektor verwendet^{wurde 1}. Die Gesamttumorakquisitionsrate beträgt 60% -80% am Tag 8-12 nach dem Allotransplantat. Die durchschnittliche Injektionszeit wurde ebenfalls von 30-40 s pro Fliege mit einem manuellen Injektor auf 20-25 s pro Fliege mit dem Autoinjektor verbessert.

Dieses Protokoll gehört zu den ersten Protokollen, die den Autoinjektorapparat bei der Drosophila-Tumorallotransplantation verwenden. Eine kürzlich durchgeführte Studie verwendete den Autoinjektor auch für die Allotransplantation von tumorösen neuralen Stammzellen². Zuvor wurde der Autoinjektorapparat in Drosophila verwendet, um die bakterielle Virulenz³, parasitäre Infektionen und die Wirtsabwehr⁴ sowie das Screening auf Bioaktivität verschiedener Verbindungen⁵ zu untersuchen. Unser Protokoll passt den Autoinjektorapparat für die Verwendung von Tumorinjektionen an und versucht, Drosophila-Forschern eine höhere Qualität und konsistentere Ergebnisse zu liefern und ihnen gleichzeitig viel Zeit zu sparen. Dieses Protokoll kann nicht nur für die Allotransplantation von Tumoren verwendet werden, sondern kann auch auf die Allotransplantation von Wildtyp- und mutiertem Gewebe ähnlichen Kalibers⁶ zugeschnitten werden.

Der in diesem Protokoll verwendete Drosophila NICD-Tumor wurde erstmals von Yang et ^al.7 in der SG-Übergangszone des imaginären Rings eingeführt, einem "Tumor-Hotspot", der hohe Konzentrationen an endogener Januskinase / Signalwandler und Aktivatoren der Transkription (JAK-STAT) und c-Jun N-terminaler Kinase (JNK) -Aktivität aufweist. Darüber hinaus weist die Übergangszone einen hohen Gehalt an Matrix-Metalloproteinase-1 (MMP1)⁷ auf, was diese Region besonders förderlich für die Tumorgenese macht. Die Aktivierung des Notch-Signalwegs durch NICD-Überexpression allein reicht aus, um die Tumorbildung konsequent einzuleiten. Diese Tumoren können anschließend allotransplantiert werden, um eine breite Palette von Themen zu untersuchen, einschließlich Tumorzellteilung, Invasion und Tumor-Wirt-Interaktionen.

Protokoll

1. Vorbereitung des SG-imaginären Ringtumors

1. Kreuzen Sie erwachsene Fliegen mit Genotypen von UAS-NICD (männlich: 10-15 Fliegen) und Act-Gal4, UAS-GFP / CyO; tub-Gal80 ts (Virgin female: 10-15^Fliegen ) und erlauben Sie ihnen, 1 Tag bei 18 ° C zu brüten. Die ausgewählten erwachsenen Fliegen sollten 5-9 Tage alt sein, um eine hohe Fruchtbarkeit zu gewährleisten.
2. Lassen Sie die erwachsenen Fliegen 24 h bei 18 ° C Eier in das in Fläschchen enthaltene Fliegenfutter legen, und entfernen Sie dann die erwachsenen Fliegen.
   HINWEIS: Fliegenfutter wird mit dem Standardrezept für Maismehl von Drosophila Stock Center⁸ zubereitet. Jede Durchstechflasche sollte etwa 10 ml Fliegenfutter enthalten.
3. Lassen Sie die Eier 6 Tage bei 18 ° C inkubieren. Während dieser Zeit schlüpfen die Larven.
4. Die Fläschchen mit Larven in einen 29 °C Inkubator überführen und weitere 7 Tage inkubieren.
   HINWEIS: Dieser Inkubationsschritt ist je nach spezifischem Versuchsdesign optional.

2. Präparation von adulten Wildtyp-Drosophila für die Allotransplantation

1. Anästhesieren Sie Wildtyp- oder geeignete mutierte erwachsene Fliegen mit 100% CO 2 und sortieren Sie Fliegen nach Geschlecht_. Sowohl männliche als auch weibliche Fliegen können als Tumorwirte verwendet werden.
2. Befestigen Sie ein 5 cm langes Stück Fliegenband an einem Objektträger mit der klebrigen Seite nach oben, indem Sie es mit zwei kleineren Stück Klebeband befestigen, eines an jedem Ende.
3. Immobilisieren Sie die Fliegen, indem Sie ihre Flügel an das Band kleben. Verwenden Sie eine Pinzette, während Sie die Fliegen manövrieren.
   1. Wiederholen Sie den obigen Schritt für 60-80 erwachsene Fliegen, die als Allotransplantat-Akzeptoren verwendet werden.
      HINWEIS: Es ist am besten, Fliegen in ordentlichen Reihen zu organisieren, wobei ihre Körperachse parallel zueinander ausgerichtet ist, um später einen zeiteffizienteren Injektionsprozess zu ermöglichen. Abbildung 1 zeigt Reihen von Wirtsfliegen, die auf diese Weise abgeklebt sind.

3. Montage der Autoinjektorvorrichtung

1. Schließen Sie sowohl das Autoinjektorgerät als auch das Netzkabel an die Controller-Box an.
   1. Stellen Sie das Einspritzvolumen auf 59,8 nL ein. Dies wird dazu beitragen, die angemessene Menge an Saug- und Injektionskräften während der Allotransplantation aufrechtzuerhalten.
2. Platzieren Sie die Reglerbox und den Autoinjektor auf gegenüberliegenden Seiten des Lichtmikroskops.
   HINWEIS: Für Rechtshänder sollte die Steuerbox auf der linken Seite des Mikroskops mit dem Injektor auf der rechten Seite platziert werden. Umgekehrt für Linkshänder.
3. Bereiten Sie die 3,5-Zoll-Glaskapillare für den Gebrauch vor, indem Sie das geschlossene Ende mit einer Pinzette abschneiden.
   1. Verarbeiten Sie ein Ende der Glaskapillare mit einem vierstufigen Mikropipettenabzieher und erhitzen Sie es zu einem schmalen, geschlossenen Ende unter Verwendung der folgenden Spezifikationen im Gerät: Wärme = 650, Kraft = 200 und Entfernung = 8. Platzieren Sie die Kapillaren ordentlich in der Puller-Vorrichtung und führen Sie das Programm aus, nachdem Sie die obigen Einstellungen eingegeben haben.
   2. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Kapillare in einem Winkel von etwa 60 ° zu beschneiden, um ein schärferes Ende für einen einfachen Eintritt in den Bauch der erwachsenen Fliege^{zu schaffen 1}. In Abbildung 2 finden Sie ein Beispiel für eine gut beschnittene Kapillare.
4. Schrauben Sie die Kappe des Injektors leicht ab. Halten Sie die Leertaste gedrückt, um die Injektornadel so lange zu bewegen, bis 70% -80% ihrer Gesamtlänge angezeigt werden. Um den Fortschritt der Kapillare zu beschleunigen, drücken Sie einmal die Fill-Taste , während Sie gleichzeitig die Leertaste gedrückt halten.
5. Verwenden Sie eine Spritze, um die Glaskapillare mit Mineralöl zu füllen. Führen Sie dann vorsichtig die Glaskapillare auf die Injektornadel ein, bis erstere fest am Gummistopfen des Injektors befestigt ist. Schrauben Sie nun die Injektorkappe fest.
   1. Wischen Sie die Mineralölrückstände auf der Außenfläche der Glaskapillarabdeckung ab, um eine Kontamination des Mediums während der Allotransplantation zu vermeiden.

4. Dissektion des SG-imaginären Ringtumors

1. Wählen Sie eine der Larven aus und übertragen Sie sie auf eine Dissektionsplatte, die mit 100 μL Schneiders Medium gefüllt ist, um sich auf die SG-Ringtumordissektion vorzubereiten.
   HINWEIS: Nur die Proben, die den Tumor beherbergen, bleiben als Larven erhalten. Dies liegt daran, dass das Tumorwachstum die Larvenentwicklung und das Fortschreiten verzögert⁹. Zwei Drittel der Proben beherbergen den Tumor nicht und sind somit zu Puppen/Erwachsenen fortgeschritten.
   1. Verwenden Sie für Dissektions- und Allotransplantationszwecke ein Stereomikroskop mit einem 10x-20-fachen Vergrößerungsbereich.
2. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Mittelteil des Larvenkörpers zu halten, klemmen Sie den Larvenkopf mit einer anderen Pinzette ein und üben Sie eine Dehnungskraft in Längsrichtung aus.
3. Suchen Sie das Y-förmige SG der Larven und isolieren Sie es vom Rest des Larvengewebes¹⁰.
4. Sezieren und isolieren Sie den SG-imaginären Ringtumor, indem Sie das angrenzende Gewebe entfernen. Eine Darstellung dieses Seziervorgangs finden Sie in Abbildung 3.
5. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.4 für weitere 10 bis 20 SG imaginäre Ringtumoren basierend auf dem Forschungsbedarf.

5. Allotransplantat des primären SG-imaginären Ringtumors

1. Tauchen Sie die Kapillare in das Schneider'sche Medium, das die primären SG-imaginären Ringtumoren enthält. Halten Sie die Fill-Taste gedrückt, um die Glaskapillare mit Schneiders Medium bis zum oberen 0,5-cm-Segment zu füllen. Dieses obere Segment sollte mit Mineralöl gefüllt bleiben.
   HINWEIS: Beschleunigen Sie diesen Vorgang, indem Sie einmal die Leere Taste drücken und gleichzeitig die Fill-Taste gedrückt halten.
2. Suchen Sie einen Primärtumor und drücken Sie die Fill-Taste , bis der Tumor in die Kapillare abgesaugt wird.
   1. Stellen Sie sicher, dass der Tumor an der Spitze der Kapillare oder mehrere Millimeter von der Spitze der Kapillare entfernt sitzt. Dies hilft, zu vermeiden, dass der Tumor driftet und in der in der Kapillare enthaltenen Lösung verloren geht. Siehe Abbildung 4A für eine Demonstration der geeigneten Tumorstelle, wie sie in der Kapillare sitzt.
3. Suchen Sie eine erwachsene Fliege, die am Klebeband auf dem Objektträger immobilisiert ist. Halten Sie den Unterbauch mit einer Pinzette vorsichtig fest. Durchstechen Sie dann die untere laterale Kutikula des Abdomens mit der Kapillare. Drücken Sie die Leertaste , bis der Tumor in den neuen Wirtsbauch gelangt. Eine Demonstration dieser Technik finden Sie in Abbildung 4B .
4. Drücken Sie die Flügel des Hosts mit einer Pinzette vorsichtig nach oben, um sie vom Band zu entfernen. Legen Sie den Gastgeber in ein neues Fläschchen mit frischen Lebensmitteln. Es ist am besten, die Durchstechflasche für die ersten 24 Stunden nach der Injektion seitlich zu platzieren. Jede Durchstechflasche sollte nur bis zu maximal 20 Fliegen enthalten.
   HINWEIS: Einige Wirtsfliegen haben nach der Injektion fehlende Flügel und andere Wunden am Körper und können am Fliegenfutter haften, wenn die Durchstechflasche aufrecht platziert wird.
5. Wiederholen Sie die Schritte 5.2 bis 5.4, um die verbleibenden Primärtumoren in ihre neuenerwachsenen Wirte zu transplantieren.
6. Entsorgen Sie die Kapillaren in den Behälter der scharfen Gegenstände und reinigen Sie die Mineralölrückstände von der Außenseite des Autoinjektors, bevor Sie das Gerät wieder in seine Box ersetzen.
7. Lagern Sie die Durchstechflasche mit den Wirten 1 Tag lang bei Raumtemperatur und geben Sie die Durchstechflasche dann bei 29 °C in eine Inkubationskammer. Bringen Sie alle 2-3 Tage Fliegenwirte zu neuen Fläschchen.
8. Überwachen Sie die Fliegenwirte täglich und berechnen Sie die Überlebensraten. Nach einer Woche sollten Tumore unter einem Stereomikroskop mit Fluoreszenzadapter sichtbar sein und können kontinuierlich auf ihre Größe und Progression überwacht werden.

6. Reallotransplantat von transplantierten Tumoren

1. Etwa 10-14 Tage nach dem Allotransplantat suchen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop nach Tumoren, die im Wirtsbauch gewachsen sind.
2. Betäuben Sie einen Wirt mit CO₂ und legen Sie ihn in eine mit 100 μL Schneider's Medium gefüllte Sezierplatte. Sezieren Sie den gewachsenen allotransplantierten Tumor mit zwei Pinzettenpaaren aus dem Wirt.
   1. Verwenden Sie ein Paar Pinzetten, um den Bauch festzuhalten, und das andere Paar, um die Bauchkutikula aufzuschneiden und den allotransplantierten Tumor¹ freizulegen.
   2. Isolieren Sie den Tumor vorsichtig so weit wie möglich von den angeschlossenen Wirtsgeweben und verwenden Sie Fluoreszenzmarker als Leitfaden.
3. Wiederholen Sie Schritt 6.2, um sich auf zwei bis drei weitere allotransplantierte Tumoren vorzubereiten.
4. Übertragen Sie die Dissektionsplatte mit den entnommenen Tumoren auf die Bühne eines Lichtmikroskops.
5. Verwenden Sie sterile Nadeln und zerlegen Sie die Tumore in kleinere Stücke, die für die Kapillargröße geeignet sind.
6. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.5, um die neue Generation erwachsener Wirte vorzubereiten, und wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.7, um die Allotransplantation der Tumore abzuschließen.
   HINWEIS: Die Erfolgsraten sind bei nicht-primären Tumoren im Allgemeinen höher als bei Primärtumoren.
7. Wiederholen Sie die Schritte 6.1-6.6 für jede nachfolgende Generation von Fliegen, die in der Studie verwendet wurden.
   HINWEIS: Wählen Sie Drosophila-Hostlinien , die für die experimentellen Bedürfnisse geeignet sind.

Ergebnisse

Hier führten wir eine generationenübergreifende Allotransplantation von SG-imaginären Ringtumoren mit dem Nanoliter-Injektions-Autoinjektorapparat durch und führten eine anschließende Tumor-Live-Bildgebung mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durch, die ein tieferes Eintauchen in Themen wie Tumorwachstum, Tumorzellmigration und Tumor-Wirt-Interaktionen ermöglichte. Wenn Sie Fliegen montieren, kleben Sie sie auf einen Objektträger und halten Sie sie über einen Polydimethylsiloxan (PDMS) -Block

Diskussion

Die Tumorallotransplantation kann Forschern helfen, bestimmte Probleme anzugehen, die während des Wachstums und der Progression von Drosophila-Tumoren auftreten. Eine dieser Herausforderungen ist die Umgehung des vorzeitigen Todes von tumortragenden Larven oder Erwachsenen während der primären Tumorkultur¹². In diesem Zusammenhang ermöglicht die fortgesetzte Tumorallotransplantation das unbegrenzte Wachstum von Tumoren, was Längsschnittstudien des Tumorwachstums, der Metastasierung u...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal Laser Scanning Microscope	Zeiss	LSM 980	Also known as "Zeiss LSM 980"
Cornmeal Fly Food	Bloomington Drosophila Stock Center	N/A	Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food"
Dissection Needle (30Gx1/2)	BD PrecisionGlide	305106
Dissection Plate	Fisher Scientific	12-565B
Fly Tape	Fisherbrand	159015A
Fluoresence Adapter for Stero Microscope	Electron Microscopy Sciences	SFA-UV	Also known as "NightSea Fluorescence Adapter"
Fluoresence Microscope	Zeiss	495015-0001-000	Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8"
Forceps	Fine Science Tools	11251-10	Also known as "Dumont #5 Forceps"
Glass Capillary (3.5'')	Drummond	3-000-203-G/X
Glue	Elmer	E305	Also known as "Elmer Washabale Clear Glue"
Light Microscope	Zeiss	435063-9010-100	Also known as "Zeiss Stemi 305"
Micropipette Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Also known as "Four Step Micropipette Puller"
Nanoject Apparatus	Drummond	3-000-204	Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector"
Schneider's Medium	ThermoFisher	21720001
Syringe (27G x1/2)	BD PrecisionGlide	305109
Vial	Fisherbrand	AS507