אלוטרנספלנטציה של גידול בדרוזופילה מלנוגסטר עם מזרק אוטו-ננולטר הניתן לתכנות

Summary

פרוטוקול זה מספק הדרכה מפורטת להקצאה הדורית הראשונית והמתמשכת של גידולי דרוזופילה לתוך בטנם של מארחים בוגרים לחקר היבטים שונים של ניאופלזיה. באמצעות מנגנון autoinjector, חוקרים יכולים להשיג יעילות משופרת ותפוקת הגידול בהשוואה לאלה שהושגו על ידי שיטות מסורתיות, ידניות.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר את ההקצאה של גידולים ב - Drosophila melanogaster באמצעות מנגנון הזרקה אוטו-ננוליטי. עם השימוש במנגנון autoinjector, מפעילים מיומנים יכולים להשיג תוצאות השתלה יעילות ועקביות יותר בהשוואה לאלה המתקבלות באמצעות מזרק ידני. כאן אנו מכסים נושאים בצורה כרונולוגית: החל מחציית קווי דרוזופילה , דרך אינדוקציה ונתיחה של הגידול הראשוני, השתלת הגידול הראשוני לפונדקאי בוגר חדש והמשך השתלה דורית של הגידול למחקרים ממושכים. כהדגמה, כאן אנו משתמשים בתחום התוך-תאי של Notch (NICD) בביטוי יתר המושרה על ידי גידולי טבעת הרוק המושרים על ידי בלוטת הרוק לצורך השתלה דורית. גידולים אלה יכולים תחילה להיות מושרים באופן אמין במיקרו-סביבה של אזור מעבר בתוך טבעות דמיוניות של בלוטת הרוק הזחלית, ולאחר מכן להשתיל אותם ולתרבת אותם in vivo כדי לחקור את המשך גדילת הגידול, האבולוציה והגרורות. שיטת ההקצאה הזו יכולה להיות שימושית בתוכניות בדיקת תרופות פוטנציאליות, כמו גם לחקר אינטראקציות בין גידול למארח.

Introduction

פרוטוקול זה מספק הנחיה שלב אחר שלב להקצאה של גידולים דמיוניים של בלוטת הרוק הזחלית של דרוזופילה (SG) לתוך הבטן של מארחים בוגרים באמצעות מנגנון הזרקה אוטו-ננוליטי (למשל, Nanoject). פרוטוקול זה מספק גם כיוונים להשתלה מחדש של גידולים לדורות חדשים של מארחים בוגרים, מה שמספק הזדמנויות להמשך מחקר אורך של מאפייני הגידול, כגון אבולוציה של גידולים ואינטראקציות בין גידולים לפונדקאים. ניתן ליישם את הפרוטוקול גם על ניסויים בסינון תרופות.

שיטה זו פותחה כדי לשפר את היעילות של ביצוע allotransplantation הגידול ב Drosophila באמצעות מזרקים ידניים¹, אשר לעתים קרובות אינם עקביים בכוחות היניקה וההזרקה שלהם, מה שמוביל לתוצאות לא אופטימליות עבור allotransplantation הגידול. מנגנון אוטו-איניג'קטור מספק שליטה טובה יותר ויכול לגרום לשיעורים נמוכים יותר של תמותת זבובים לאחר אלוגרפט. מפעיל מיומן יכול להשיג שיעור הישרדות של יותר מ-90% עם המזרק האוטומטי, לעומת כ-80% כאשר נעשה שימוש במזרק הידני¹. שיעור רכישת הגידול הכולל הוא 60%-80% ביום 8-12 לאחר הלידה. זמן ההזרקה הממוצע השתפר גם הוא מ-30-40 שניות לטוס באמצעות מזרק ידני ל-20-25 שניות לטוס באמצעות האוטו-איניג'קטור.

פרוטוקול זה הוא בין הפרוטוקולים הראשונים שהשתמשו במנגנון האוטו-איניג'קטור באלוטרנספלנטציה של גידול דרוזופילה . מחקר שנערך לאחרונה השתמש גם ב-autoinjector עבור ההקצאה של תאי גזע עצביים סרטניים². בעבר, מנגנון autoinjector שימש Drosophila כדי לחקור ויראליות חיידקית³, זיהומים טפיליים והגנה המארח⁴, כמו גם הקרנה עבור פעילות ביולוגית של תרכובות שונות⁵. הפרוטוקול שלנו מתאים את מנגנון ה-autoinjector לשימוש בהזרקת גידולים ומבקש לספק לחוקרי Drosophila תוצאות איכותיות ועקביות יותר תוך חיסכון בזמן רב. פרוטוקול זה יכול לשמש לא רק עבור allotransplantation של גידולים, אלא יכול להיות מותאם גם אלוטרנספלנטציה של wildtype ורקמות מוטנטיות של קליבר דומה⁶.

גידול ה-Drosophila NICD המשמש בפרוטוקול זה הוצג לראשונה על ידי Yang et ^al.7 באזור המעבר של הטבעת הדמיונית SG, "נקודה חמה של גידול" המציג רמות גבוהות של מתמר ג'אנוס קינאז/אותות אנדוגניים ומפעילי שעתוק (JAK-STAT), ופעילות c-Jun N-terminal Kinase (JNK). בנוסף, באזור המעבר יש רמות גבוהות של מטריצה metalloproteinase-1 (MMP1)⁷, מה שהופך את האזור הזה לתרום במיוחד לגידולים סרטניים. הפעלת מסלול חריץ באמצעות ביטוי יתר של NICD בלבד מספיקה כדי ליזום באופן עקבי היווצרות גידולים. לאחר מכן ניתן להקצות גידולים אלה כדי לאפשר חקירה של מגוון רחב של נושאים, כולל חלוקת תאי גידול, פלישה ואינטראקציות בין גידול לפונדקאי.

Protocol

1. הכנת גידול טבעת דמיוני SG

1. צלב זבובים בוגרים עם גנוטיפים של UAS-NICD (זכר: 10-15 זבובים) ו - Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80^ts (נקבה בתולה: 10-15 זבובים) ומאפשר להם להתרבות במשך יום אחד ב -18 מעלות צלזיוס. הזבובים הבוגרים שנבחרו צריכים להיות בני 5-9 ימים כדי להבטיח פוריות גבוהה.
2. אפשרו לזבובים הבוגרים להטיל ביצים במזון הזבובים הכלול בבקבוקונים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס, ואז הסירו את הזבובים הבוגרים.
   הערה: מזון זבובים מוכן באמצעות מתכון מזון קמח תירס סטנדרטי ממרכז Drosophila ^{Stock 8}. כל בקבוקון צריך להכיל כ-10 מ"ל של מזון זבובים.
3. אפשרו לביצים לדגור במשך 6 ימים בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס. במהלך תקופה זו, הזחלים יבקעו.
4. מעבירים את הבקבוקונים המכילים זחלים לחממה של 29 מעלות צלזיוס ואינקובציה למשך 7 ימים נוספים.
   הערה: שלב דגירה זה הוא אופציונלי בהתאם לתכנון הניסוי הספציפי.

2. הכנת דרוזופילה מסוג בר בוגר להקצאת אלוטרנספלנטציה

1. מרדימים זבובים בוגרים מסוג פראי או מוטנטיים מתאימים עם 100% CO₂ וממיינים זבובים על בסיס מינים. זבובים זכריים ונקביים כאחד יכולים לשמש כמארחי גידול.
2. הצמידו פיסת סרט דבק באורך 5 ס"מ לשקופית מיקרוסקופ עם הצד הדביק למעלה על ידי תיקון שלה עם שתי חתיכות קטנות יותר של סרט הדבקה, אחת בכל קצה.
3. שתקו את הזבובים על ידי הצמדת כנפיהם לקלטת. השתמש במלקחיים תוך כדי תמרון הזבובים.
   1. חזור על השלב הנ"ל עבור 60-80 זבובים בוגרים המשמשים כמקבלי allograft.
      הערה: עדיף לארגן זבובים בשורות מסודרות, כאשר ציר הגוף שלהם מיושר במקביל זה לזה לתהליך הזרקה יעיל יותר בזמן מאוחר יותר. איור 1 מציג שורות של זבובים מארחים מודבקים כלפי מטה באופן זה.

3. הרכבת מנגנון האוטו-איניג'קטור

1. חברו גם את מנגנון ההתקן האוטומטי וגם את כבל החשמל לתיבת הבקר.
   1. הגדר את נפח ההזרקה ל- 59.8 nL. זה יעזור לשמור על הכמות המתאימה של כוחות יניקה והזרקה במהלך allotransplantation.
2. מקם את תיבת הבקר ואת ה- autoinjector בצדדים מנוגדים של מיקרוסקופ האור.
   הערה: עבור מפעילים ימניים, יש למקם את תיבת הבקרה בצד שמאל של המיקרוסקופ עם המזרק בצד ימין. להיפך עבור מפעילים שמאליים.
3. הכינו את נימי הזכוכית בגודל 3.5 אינץ' לשימוש על ידי חיתוך הקצה הסגור עם מלקחיים.
   1. לעבד קצה אחד של נימי הזכוכית באמצעות מושך מיקרופיפט בן ארבעה שלבים וחום לקצה צר וסגור באמצעות המפרטים הבאים במכשיר: חום = 650, כוח = 200, ומרחק = 8. מקם בצורה מסודרת את הנימים במנגנון המושך והפעל את התוכנית לאחר הזנת ההגדרות לעיל.
   2. השתמש במלקחיים כדי לחתוך את הנימים בזווית של כ-60° כדי ליצור קצה חד יותר לכניסה קלה לבטן הזבוב הבוגר¹. ראו איור 2 דוגמה לנימי נכים חתוכים היטב.
4. שחררו קלות את הכובע של המזרק. הצמידו את כפתור ה-Empty כדי לקדם את מחט המזרק עד שיראו 70%-80% מאורכו הכולל. כדי להאיץ את התקדמות הנימים, לחץ על לחצן מילוי פעם אחת תוך לחיצה בו-זמנית על הלחצן 'ריק '.
5. השתמש במזרק כדי למלא את נימי הזכוכית בשמן מינרלי. לאחר מכן, הכנס בזהירות את נימי הזכוכית על מחט המזרק עד שהראשון מחובר בחוזקה לפקק הגומי של המזרק. עכשיו תברגו את מכסה המזרק חזק.
   1. נגבו את שאריות השמן המינרלי על פני השטח החיצוניים של כיסוי נימי הזכוכית כדי למנוע זיהום של המדיום במהלך ההקצאה.

4. דיסקציה של גידול הטבעת הדמיונית SG

1. בחר אחד מהזחלים והעביר אותו לצלחת דיסקציה מלאה ב-100 מיקרול'ס מדיום של שניידר כדי להתכונן לנתיחה של גידול טבעתי דמיוני של SG.
   הערה: רק הדגימות המכילות את הגידול יישארו כזחלים. הסיבה לכך היא שצמיחת הגידול מעכבת את התפתחות הזחל ואת^{התקדמותו 9}. שני שלישים מהדגימות לא יאכלו את הגידול ולכן יתקדמו לגלמים/מבוגרים.
   1. למטרות כריתה והקצאה, השתמש בסטריאומיקרוסקופ עם טווח הגדלה של 10x-20x.
2. באמצעות זוג מלקחיים אחד כדי להחזיק את החלק האמצעי של גוף הזחל, צובטים את ראש הזחל באמצעות זוג מלקחיים נוספים ומפעילים כוח מתיחה לאורך.
3. אתרו את ה-SG בצורת Y של הזחלים ובודדו אותו משאר רקמת הזחל¹⁰.
4. לנתח ולבודד את הגידול הטבעתי הדמיוני SG על ידי הסרת הרקמה הסמוכה. ראו איור 3 לתיאור של תהליך הנתיחה הזה.
5. חזור על שלבים 4.1-4.4 עבור 10 עד 20 גידולי טבעת דמיוניים נוספים של SG המבוססים על צרכי מחקר.

5. Allograft של גידול טבעת דמיוני SG ראשוני

1. טבלו את הנימים לתוך המדיום של שניידר המכיל את גידולי הטבעת הדמיוניים העיקריים של SG. הקישו לחיצה על כפתור המילוי כדי למלא את נימי הזכוכית ב-Schneider's Medium עד לקטע העליון של 0.5 ס"מ. קטע עליון זה צריך להישאר מלא בשמן מינרלי.
   הערה: האץ תהליך זה על-ידי לחיצה על לחצן 'ריק ' פעם אחת תוך לחיצה בו-זמנית על לחצן 'מילוי '.
2. אתרו גידול ראשוני ולחצו על כפתור המילוי עד שהגידול נשאב לתוך הנימים.
   1. ודא שהגידול יושב בקצה הנימים או במרחק של כמה מילימטרים מקצה הנימים. זה עוזר למנוע את הגידול להיסחף וללכת לאיבוד בתמיסה הכלולה בתוך הנימים. ראו איור 4A להדגמה של מיקום הגידול המתאים כשהוא יושב בנימילים.
3. אתר זבוב מבוגר משותק לקלטת על שקופית המיקרוסקופ. באמצעות מלקחיים, החזק בעדינות את הבטן התחתונה. לאחר מכן, לנקב את הציפורן הלטרלית התחתונה של הבטן עם הנימים. לחץ על כפתור ריק עד שהגידול נכנס לבטן המארחת החדשה. ראו איור 4B להדגמה של טכניקה זו.
4. באמצעות מלקחיים, צובטים בעדינות את כנפיו של המארח כלפי מעלה כדי להסיר אותו מהסרט. מכניסים את המארח לבקבוקון חדש עם אוכל טרי. עדיף למקם את הבקבוקון לצדדים במשך 24 השעות הראשונות לאחר ההזרקה. כל בקבוקון צריך להכיל רק עד 20 זבובים לכל היותר.
   הערה: לחלק מהזבובים המארחים יהיו כנפיים חסרות ופצעים אחרים על גופם לאחר ההזרקה והם עלולים להידבק למזון הזבובים אם הבקבוקון מונח זקוף.
5. חזור על שלבים 5.2 עד 5.4 כדי להשתיל את הגידולים הראשוניים הנותריםבמארחים הבוגרים החדשים שלהם.
6. השליכו נימים למיכל של שארפ ונקו את שאריות השמן המינרלי מהחלק החיצוני של האוטו-איניג'קטור לפני שהחליפו את המנגנון בחזרה לתוך הקופסה שלו.
7. אחסנו את בקבוקון המארחים בטמפרטורת החדר למשך יום אחד, ולאחר מכן העבירו את הבקבוקון לתא דגירה בטמפרטורה של 29 מעלות צלזיוס. העברת מארחי זבובים לבקבוקונים חדשים כל 2-3 ימים.
8. עקוב אחר מארחי הזבובים מדי יום וחשב את שיעורי ההישרדות. לאחר שבוע, גידולים צריכים להיות גלויים תחת מיקרוסקופ סטריאו עם מתאם פלואורסצנטי וניתן לעקוב אחריהם באופן רציף אחר גודלם והתקדמותם.

6. השתלה מחדש של גידולים מושתלים

1. בסביבות 10-14 ימים לאחר ה-allograft, יש לסנן גידולים שגדלו בבטן המארחת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
2. הרדימו פונדקאי עם CO₂ והניחו אותו בצלחת דיסקציה מלאה במדיום של שניידר של 100 μL. נתחו את הגידול הגדל מתוך הפונדקאי באמצעות שני זוגות מלקחיים.
   1. השתמשו בזוג אחד של מלקחיים כדי להחזיק את הבטן ובזוג השני כדי לפתוח את קוטיקת הבטן, וחשפו את הגידול המושתל¹.
   2. יש לבודד בזהירות את הגידול מהרקמות המארחות המחוברות ככל האפשר באמצעות סמני פלואורסצנציה כהנחיה.
3. חזור על שלב 6.2 כדי להתכונן לשניים עד שלושה גידולים נוספים.
4. מעבירים את לוחית הנתיחה המכילה את הגידולים שנקטפו על הבמה של מיקרוסקופ אור.
5. השתמש במחטים סטריליות ונתח את הגידולים לחתיכות קטנות יותר המתאימות לגודל הנימים.
6. חזור על שלבים 4.1-4.5 כדי להכין את הדור החדש של המארחים הבוגרים ולחזור על שלבים 5.1-5.7 כדי להשלים את ההקצאה של הגידולים.
   הערה: שיעורי ההצלחה בדרך כלל גבוהים יותר עבור גידולים שאינם ראשוניים בהשוואה לאלה של גידולים ראשוניים.
7. חזור על שלבים 6.1-6.6 עבור כל דור הבא של זבובים המשמשים במחקר.
   הערה: בחר קווי מארח של Drosophila המתאימים לצרכים הניסוייים.

תוצאות

כאן, ביצענו הקצאה דורית של גידולי טבעת דמיוניים של SG באמצעות מנגנון ההזרקה האוטומטית של הזרקת ננוליט וביצענו הדמיה חיה של הגידול לאחר מכן עם מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, שאיפשר צלילה עמוקה יותר לנושאים של צמיחת גידול, נדידת תאי גידול ואינטראקציות בין גידול למארח. בעת הרכבת זבובים, הדבי...

Discussion

אלוטרנסנטציה של גידולים יכולה לסייע לחוקרים לטפל בבעיות מסוימות המתעוררות במהלך גדילת הגידול בהתקדמותו של דרוזופילה. אתגר אחד כזה הוא עקיפת מקרי מוות בטרם עת של זחלים נושאי גידול או מבוגרים במהלך תרבית גידול ראשונית¹². בהקשר זה, המשך ההקצאה של הגידול מאפשר לגידולים לגדו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal Laser Scanning Microscope	Zeiss	LSM 980	Also known as "Zeiss LSM 980"
Cornmeal Fly Food	Bloomington Drosophila Stock Center	N/A	Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food"
Dissection Needle (30Gx1/2)	BD PrecisionGlide	305106
Dissection Plate	Fisher Scientific	12-565B
Fly Tape	Fisherbrand	159015A
Fluoresence Adapter for Stero Microscope	Electron Microscopy Sciences	SFA-UV	Also known as "NightSea Fluorescence Adapter"
Fluoresence Microscope	Zeiss	495015-0001-000	Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8"
Forceps	Fine Science Tools	11251-10	Also known as "Dumont #5 Forceps"
Glass Capillary (3.5'')	Drummond	3-000-203-G/X
Glue	Elmer	E305	Also known as "Elmer Washabale Clear Glue"
Light Microscope	Zeiss	435063-9010-100	Also known as "Zeiss Stemi 305"
Micropipette Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Also known as "Four Step Micropipette Puller"
Nanoject Apparatus	Drummond	3-000-204	Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector"
Schneider's Medium	ThermoFisher	21720001
Syringe (27G x1/2)	BD PrecisionGlide	305109
Vial	Fisherbrand	AS507