Аллотрансплантация опухоли у Drosophila melanogaster с программируемым авто-нанолитрным инъектором

Резюме

Этот протокол предоставляет подробное руководство для начальной и продолжающейся аллотрансплантации опухолей дрозофилы в брюшную полость взрослых хозяев для изучения различных аспектов неоплазии. Используя аутоинжекторный аппарат, исследователи могут достичь улучшенной эффективности и выхода опухоли по сравнению с теми, которые достигаются традиционными, ручными методами.

Аннотация

Этот протокол описывает аллотрансплантацию опухолей у Drosophila melanogaster с использованием автомата нанолитра инъекционного аппарата. С помощью автоинжекторного аппарата обученные операторы могут достичь более эффективных и последовательных результатов трансплантации по сравнению с теми, которые получены с использованием ручного инъектора. Здесь мы освещаем темы в хронологическом порядке: от пересечения линий дрозофилы до индукции и рассечения первичной опухоли, трансплантации первичной опухоли новому взрослому хозяину и продолжающейся трансплантации опухоли для расширенных исследований. В качестве демонстрации здесь мы используем внутриклеточный домен Notch (NICD), индуцированную сверхэкспрессией слюнных желез имагинальных кольцевых опухолей для трансплантации поколений. Эти опухоли могут быть сначала надежно индуцированы в микроокружении переходной зоны в воображаемых кольцах личиночной слюнной железы, а затем аллотрансплантированы и культивированы in vivo для изучения продолжающегося роста, эволюции и метастазирования опухоли. Этот метод аллотрансплантации может быть полезен в потенциальных программах скрининга лекарств, а также для изучения взаимодействий опухоли и хозяина.

Введение

Этот протокол обеспечивает пошаговое руководство по аллотрансплантации опухолей имагинального кольца личиночной слюнной железы Drosophila (SG) в брюшную полость взрослых хозяев с использованием аппарата для инъекции автонанолитров (например, Nanoject). Этот протокол также предоставляет направления для последующей реаллотрансплантации опухолей в новые поколения взрослых хозяев, что обеспечивает возможности для продолжения продольного изучения характеристик опухоли, таких как эволюция опухоли и взаимодействия опухоли с хозяином. Протокол также может быть применен к экспериментам по скринингу лекарств.

Этот метод был разработан для повышения эффективности выполнения аллотрансплантации опухоли при дрозофиле с использованием ручных инъекторов¹, которые часто непоследовательны в своих силах всасывания и инъекции, что приводит к неоптимальным результатам для аллотрансплантации опухоли. Автоинжекторный аппарат обеспечивает лучший контроль и может привести к более низким показателям смертности мух после аллотрансплантата. Обученный оператор мог достичь выживаемости хозяина более 90% с автоинжектором, по сравнению с примерно 80%, когда использовался ручной инжектор¹. Общая скорость приобретения опухоли составляет 60%-80% на 8-12 день после аллотрансплантата. Среднее время впрыска также было улучшено с 30-40 с на муху при использовании ручного инжектора до 20-25 с на муху с использованием автоинжектора.

Этот протокол является одним из первых нескольких протоколов для использования аутоинъекторного аппарата при аллотрансплантации опухоли дрозофилы . В недавнем исследовании также использовался аутоинъектор для аллотрансплантации опухолевых нервных стволовых клеток². Ранее аутоинжекторный аппарат применялся у дрозофилы для изучения бактериальной вирулентности³, паразитарных инфекций и защиты хозяина⁴, а также скрининга на биоактивность различных соединений⁵. Наш протокол адаптирует аутоинжекторный аппарат для инъекций опухоли и стремится предоставить исследователям дрозофилы более высокое качество и более последовательные результаты, экономя при этом их значительное время. Этот протокол может быть не только использован для аллотрансплантации опухолей, но также может быть адаптирован к аллотрансплантации диких типов и мутантных тканей аналогичного калибра⁶.

Опухоль Drosophila NICD, используемая в этом протоколе, была впервые введена Yang et ^al.7 в переходную зону имагинального кольца SG, «опухолевую горячую точку», которая демонстрирует высокие уровни эндогенной янус-киназы / сигнального преобразователя и активаторов транскрипции (JAK-STAT) и активности c-Jun N-терминальной киназы (JNK). Кроме того, переходная зона имеет высокие уровни матриксной металлопротеиназы-1 (MMP1)⁷, что делает эту область особенно благоприятной для опухолевого генеза. Активация пути Notch только через сверхэкспрессию NICD достаточна для последовательного инициирования образования опухоли. Эти опухоли могут быть впоследствии аллотрансплантированы, чтобы позволить исследовать широкий спектр тем, включая деление опухолевых клеток, инвазию и взаимодействие опухоли с хозяином.

протокол

1. Препарат опухоли имагинального кольца SG

1. Скрещивайте взрослых мух с генотипами UAS-NICD (самец: 10-15 мух) и Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80^ts (девственная самка: 10-15 мух) и позволяйте им размножаться в течение 1 дня при 18 °C. Отобранным взрослым мухам должно быть 5-9 дней для обеспечения высокой фертильности.
2. Дайте взрослым мухам отложить яйца в корм мух, содержащийся во флаконах, в течение 24 ч при 18 °C, затем удалите взрослых мух.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Корм для мух готовится по стандартному рецепту кукурузной муки от Drosophila Stock Center⁸. Каждый флакон должен содержать около 10 мл пищи для мух.
3. Дайте яйцам инкубироваться в течение 6 дней при 18 °C. В этот период личинки будут вылупляться.
4. Перенесите флаконы, содержащие личинки, в инкубатор при температуре 29 °C и инкубируйте еще 7 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап инкубации является необязательным в зависимости от конкретной экспериментальной конструкции.

2. Подготовка взрослой особи дикого типа дрозофилы к аллотрансплантации

1. Обезболивают диких или соответствующих взрослых мух-мутантов со 100% CO₂ и сортируют мух по половому признаку. Как самцы, так и самки мух могут быть использованы в качестве хозяев опухоли.
2. Закрепите кусок ленты длиной 5 см к предметной доске микроскопа липкой стороной вверх, закрепив его двумя меньшими кусками ленты, по одному на каждом конце.
3. Обездвиживайте мух, приклеивая их крылья к ленте. Используйте щипцы во время маневрирования мух.
   1. Повторите описанный выше шаг для 60-80 взрослых мух, используемых в качестве акцепторов аллотрансплантата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего организовать мух в аккуратные ряды, с осью их тела, выровненной параллельно друг другу для более эффективного по времени процесса впрыска позже. На рисунке 1 показаны ряды мух-хозяев, заклеенных таким образом.

3. Сборка автоинжекторного аппарата

1. Подключите устройство автоинжектора и шнур питания к блоку управления.
   1. Установите объем впрыска на 59,8 нЛ. Это поможет поддерживать соответствующее количество сил всасывания и впрыска во время аллотрансплантации.
2. Поместите блок контроллера и автоинжектор на противоположные стороны светового микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для операторов-правшей блок управления должен быть размещен на левой стороне микроскопа, а инжектор - на правой. Наоборот для операторов-левшей.
3. Подготовьте 3,5-дюймовый стеклянный капилляр для использования, отрезав закрытый конец щипцами.
   1. Обработайте один конец стеклянного капилляра с помощью четырехступенчатого съемника микропипетки и нагрейте до узкого закрытого конца, используя следующие спецификации прибора: Тепло = 650, Сила = 200 и Расстояние = 8. Аккуратно поместите капилляры в съемный аппарат и запустите программу после ввода вышеуказанных настроек.
   2. Используйте щипцы, чтобы обрезать капилляр под углом примерно 60°, чтобы сделать более острый конец для легкого проникновения в брюшко взрослой мухи¹. См. рисунок 2 для примера хорошо обрезанного капилляра.
4. Слегка открутите колпачок инжектора. Удерживайте кнопку Empty , чтобы продвинуть иглу инжектора до 70-80% от ее общей длины. Чтобы ускорить продвижение капилляров, нажмите кнопку Fill один раз, одновременно удерживая кнопку Empty .
5. Используйте шприц, чтобы заполнить стеклянный капилляр минеральным маслом. Затем осторожно вставьте стеклянный капилляр на иглу инжектора до тех пор, пока первый не будет прочно прикреплен к резиновой пробке инжектора. Теперь прикрутите крышку инжектора плотно.
   1. Протрите остатки минерального масла на внешней поверхности стеклянной капиллярной крышки, чтобы избежать загрязнения среды во время аллотрансплантации.

4. Рассечение опухоли имагинального кольца SG

1. Выберите одну из личинок и перенесите ее на рассеченную пластину, заполненную 100 мкл среды Шнайдера, чтобы подготовиться к рассечению опухоли имагинального кольца SG.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Только образцы, содержащие опухоль, останутся в качестве личинок. Это связано с тем, что рост опухоли задерживает развитие и прогрессирование личинок⁹. Две трети образцов не будут содержать опухоль и, таким образом, прогрессируют до куколок / взрослых.
   1. Для рассечения и аллотрансплантации используйте стереомикроскоп с диапазоном увеличения 10x-20x.
2. Используя одну пару щипцов, чтобы удержать среднюю часть тела личинки, зажмите головку личинки с помощью другой пары щипцов и приложите силу растяжения вдоль.
3. Найдите Y-образный SG личинок и изолируйте его от остальной части личиночной ткани¹⁰.
4. Рассекните и изолируйте опухоль воображаемого кольца SG путем удаления прилегающей ткани. См. рисунок 3 для описания этого процесса рассечения.
5. Повторите шаги 4.1-4.4 для дополнительных опухолей с имагинальным кольцом от 10 до 20 SG на основе потребностей в исследованиях.

5. Аллотрансплантат первичной опухоли имагинального кольца SG

1. Погрузите капилляр в среду Шнайдера, содержащую первичные опухоли Имагинального кольца SG. Удерживайте кнопку «Заполнить », чтобы заполнить стеклянный капилляр средней частью Schneider до верхнего сегмента 0,5 см. Этот верхний сегмент должен оставаться заполненным минеральным маслом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ускорьте этот процесс, нажав кнопку Empty один раз, одновременно удерживая кнопку Fill .
2. Найдите первичную опухоль и нажмите кнопку Fill , пока опухоль не будет отсасываться в капилляр.
   1. Убедитесь, что опухоль находится на кончике капилляра или в нескольких миллиметрах от кончика капилляра. Это помогает избежать дрейфа опухоли и потери в растворе, содержащемся в капилляре. См. Рисунок 4А для демонстрации соответствующего расположения опухоли, когда она находится в капилляре.
3. Найдите взрослую муху, иммобилизованную к ленте на предметном стекле микроскопа. Используя щипцы, осторожно удерживайте нижнюю часть живота. Затем проколоть нижнюю боковую кутикулу брюшка капилляром. Нажимайте кнопку Empty до тех пор, пока опухоль не войдет в живот нового хозяина. См. рисунок 4B для демонстрации этой техники.
4. Используя щипцы, аккуратно зажмите крылья хозяина вверх, чтобы снять его с ленты. Поместите хозяина в новый флакон со свежими продуктами. Лучше всего размещать флакон боком в течение первых 24 ч после инъекции. Каждый флакон должен содержать не более 20 мух.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые мухи-хозяева будут иметь отсутствующие крылья и другие раны на своих телах после инъекции и могут прилипать к пище мухи, если флакон размещен вертикально.
5. Повторите шаги с 5.2 по 5.4, чтобы пересадить оставшиеся первичные опухоли в их новых взрослыххозяев.
6. Утилизируйте капилляры в контейнер для острых предметов и очистите остатки минерального масла с внешней стороны автоинжектора, прежде чем заменить аппарат обратно в его коробку.
7. Храните флакон хозяев при комнатной температуре в течение 1 дня, затем перенесите флакон в инкубационную камеру при 29 °C. Переводите хозяев на новые флаконы каждые 2-3 дня.
8. Ежедневно контролируйте хозяев мух и рассчитывайте выживаемость. Через неделю опухоли должны быть видны под стереомикроскопом с флуоресцентным адаптером и могут постоянно контролироваться на предмет их размера и прогрессирования.

6. Реаллотрансплантат трансплантированных опухолей

1. Примерно через 10-14 дней после аллотрансплантата скрининг на опухоли, которые выросли в брюшной полости хозяина, с помощью флуоресцентного микроскопа.
2. Обезболить хозяина CO₂ и поместить его в рассеченную пластину, заполненную 100 мкл средой Шнайдера. Рассекните выращенную аллотрансплантированную опухоль из хозяина с помощью двух пар щипцов.
   1. Используйте одну пару щипцов, чтобы удерживать живот, а другую пару, чтобы разрезать брюшную кутикулу, обнажая аллотрансплантированную опухоль¹.
   2. Тщательно изолируйте опухоль от прикрепленных тканей хозяина как можно больше, используя маркеры флуоресценции в качестве ориентира.
3. Повторите шаг 6.2, чтобы подготовиться к двум-трем дополнительным аллотрансплантированным опухолям.
4. Перенесите рассеченную пластину, содержащую собранные опухоли, на стадию светового микроскопа.
5. Используйте стерильные иглы и рассекайте опухоли на более мелкие кусочки, которые подходят для размера капилляров.
6. Повторите шаги 4.1-4.5 для подготовки нового поколения взрослых хозяев и повторите шаги 5.1-5.7, чтобы завершить аллотрансплантацию опухолей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Показатели успеха, как правило, выше для непервичных опухолей по сравнению с первичными опухолями.
7. Повторите шаги 6.1-6.6 для каждого последующего поколения мух, используемых в исследовании.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите линии для размещения Drosophila , соответствующие экспериментальным потребностям.

Результаты

Здесь мы провели поколенческую аллотрансплантацию опухолей имагинального кольца SG с использованием нанолитрового инъекционного аутоинжекторного аппарата и провели последующую визуализацию опухоли в реальном времени с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, что ?...

Обсуждение

Аллотрансплантация опухоли может помочь исследователям решить определенные проблемы, возникающие во время роста и прогрессирования опухоли дрозофилы. Одной из таких проблем является обход преждевременной смерти опухоленосных личинок или взрослых особей во время первичной опу?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal Laser Scanning Microscope	Zeiss	LSM 980	Also known as "Zeiss LSM 980"
Cornmeal Fly Food	Bloomington Drosophila Stock Center	N/A	Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food"
Dissection Needle (30Gx1/2)	BD PrecisionGlide	305106
Dissection Plate	Fisher Scientific	12-565B
Fly Tape	Fisherbrand	159015A
Fluoresence Adapter for Stero Microscope	Electron Microscopy Sciences	SFA-UV	Also known as "NightSea Fluorescence Adapter"
Fluoresence Microscope	Zeiss	495015-0001-000	Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8"
Forceps	Fine Science Tools	11251-10	Also known as "Dumont #5 Forceps"
Glass Capillary (3.5'')	Drummond	3-000-203-G/X
Glue	Elmer	E305	Also known as "Elmer Washabale Clear Glue"
Light Microscope	Zeiss	435063-9010-100	Also known as "Zeiss Stemi 305"
Micropipette Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Also known as "Four Step Micropipette Puller"
Nanoject Apparatus	Drummond	3-000-204	Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector"
Schneider's Medium	ThermoFisher	21720001
Syringe (27G x1/2)	BD PrecisionGlide	305109
Vial	Fisherbrand	AS507