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摘要

本文提供了使用开源、廉价的 smfBox 对单个、自由扩散的生物分子进行完全校正的准确 FRET 测量的分步说明，从打开、通过对准和聚焦，再到数据收集和分析。

摘要

smfBox是最近开发的一种具有成本效益的开源仪器，用于单分子Förster共振能量转移（smFRET），它使自由扩散生物分子的测量更容易获得。本概述包括使用此仪器测量双链DNA样品中精确FRET效率的分步方案，包括样品制备，仪器设置和校准，数据采集和完整分析程序的详细信息。所提出的方法包括如何确定精确FRET派生的距离测量所需的所有校正因素，建立在FRET社区最近的大量协作工作的基础上，旨在建立标准协议和分析方法。该协议易于适应一系列生物分子系统，为更广泛的科学界的smFRET民主化努力做出了贡献。

引言

单分子Förster共振能量转移（smFRET）是一种在单个分子水平上测量两种染料（供体和受体）之间的FRET效率的技术。FRET是由两种染料的重叠能谱引起的光物理过程:供体被特定波长的光激发，并将能量非辐射地传递给受体，导致受体发射。这种转移的效率与两种染料之间距离的六次方成反比，因此转移效率随距离而变化1。因此，这种FRET效率可用于确定染料附着在3-10nm范围内的分子2 的空间信息。这种尺度，以及FRET效率的变化对埃分子运动敏感的事实3，使得该技术非常适合研究有关生物分子的结构信息-如核酸和蛋白质-而没有集合平均的并发症4，5，6。虽然相对FRET效率的变化可用于监测生物分子相互作用和构象动力学，揭示关键的细胞过程，如蛋白质（未）折叠，转录以及DNA复制和修复，但绝对的FRET效率已用于确定生物分子结构测定的精确距离7，8，9，10，11，克服了其他一些结构方法所需的结晶或冷冻需求4，12。

smFRET实验通常采用两种形式，共聚焦或全内反射荧光（TIRF）显微镜。在这两种方法之间，生物分子的分子动力学通常可以在从皮克到毫秒（共聚焦，自由扩散分子）到毫秒到几小时（TIRF，表面固定分子）的时间尺度上进行研究。这是由于每种技术涉及不同的设置。在TIRF显微镜下，分子固定在载玻片表面并被倏逝波激发（图1A）。然而，这里的重点是共聚焦显微镜，因为这是smfBox的格式。在共聚焦显微镜中，分子不是固定的，而是通过共聚焦体积（〜1 fL）的布朗运动自由扩散，通过将激光束通过高数值孔径透镜聚焦到溶液内某个指定深度的点而形成（图1B）。产生的发射通过相同的孔径聚焦，并通过二向色镜过滤（图1C 为完整原理图）。然后通过针孔聚焦，以消除任何失焦光并进入雪崩光电二极管（APD）。当APD检测到光子时，它会输出一个TTL脉冲，其时序可以以高达皮秒的分辨率记录下来。这些自由扩散的分子在共聚焦体积附近的观察时间通常在毫秒级以内。

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图1:显示显微镜原理和smfBox设置的示意图。 （A）全内反射荧光（TIRF）显微镜原理:激发光被引导到物镜（Obj.）的边缘，并在盖玻片 - 缓冲液界面处经历全内反射，产生指数衰减的消失场以激发表面附着的分子。（B）共聚焦显微镜:自由扩散的分子被聚焦到样品中的近衍射极限点激发。（C）该协议中使用的smfBox设置，显示所有关键组件:雪崩光电二极管（APD），分束器（BS），二向色镜（DM），滤光片（F），反射镜（M），物镜（O）和针孔（P）。 请点击此处查看此图的放大版本。

最近，smFRET技术结合了两种颜色激发，其中与供体和受体激发波长匹配的激光器交替5。这可以通过两种方式之一完成，第一种是通过在KHz时间尺度上调制连续波激光器，这被称为交替激光激发（ALEX）13，14。第二种方法在MHz时间尺度上交错快速脉冲;这是纳秒-ALEX15 或脉冲交错激励（PIE）16。在所有这些方法中，来自受体激光的信息导致所谓的化学计量学的计算，该化学计量学可以区分具有低FRET效率的分子和那些缺乏受体的分子（通过不完全标记或光漂白）。使用PIE/ns-ALEX还可以在单分子水平上获得荧光寿命，并且当与偏振光学器件结合使用时，可以测量各向异性。这种测量组合称为多参数荧光检测（MFD）9。

尽管smFRET具有许多优点，但由于商业仪器的高成本以及缺乏简单的自建替代品，它并没有在专业实验室之外广泛使用。低成本开源显微镜的发展趋势正在增长，最近出现了其他平台，包括Planktonscope17，OpenFlexure Microscope18，Flexiscope19，miCube20，liteTIRF21和Squid22。本文描述了使用smfBox的方案，smfBox是一种最近开发的具有成本效益的共聚焦设置，能够测量自由扩散的单分子上两种染料之间的FRET效率。详细的构建说明和所有必要的操作软件可在以下网址免费获得:https://craggslab.github.io/smfBox/ 23。smfBox的光学配置由从价格合理且易于访问的制造商处购买的现成组件组装而成，而显微镜主体（在标准共聚焦设置中负责大部分费用）已被定制的光密阳极氧化铝盒取代（允许在环境光条件下进行测量）。该盒子包含关键的光学元件，包括激发二向色性、物镜和针孔，以及机械激光互锁，使其能够作为I类激光产品安全运行（完整原理图见图1C）。smfBox使用ALEX来验证染料化学计量学并确定准确的FRET校正因子。它使用定制编写的开源软件（smOTTER）进行操作，该软件控制数据采集的各个方面，并以开源photon-HDF5格式24输出数据，与许多第三方分析工具兼容。smfBox以及采集和数据分析协议最近在一项多实验室盲研究中针对>20其他仪器（共聚焦和TIRF）进行了测试25。所获得的FRET效率与所有其他仪器非常一致，尽管smfBox的成本仅为商用设置价格的一小部分。

本文概述了一个分步方案，用于获取和分析使用 smfBox 自由扩散 DNA 双链体的准确、绝对 FRET 效率，从打开、通过对准和聚焦，一直到数据收集和分析。这里使用的样品是三种双工DNA（表现出高，中和低FRET效率，见 表1），它们在世界范围的盲研究中进行了评估25;然而，该方法适用于许多分子系统，包括蛋白质和其他核酸。希望如此详细的协议，以及已经存在的smfBox23构建说明，将有助于使这种强大的技术更容易被广泛的实验室所接受。

研究方案

1. 上电组件

  1. 打开六个插头的电源（顺序不分先后）:压电概念（z 轴焦）、APD0、APD1、绿色激光、红色激光和光电探测器。

2. 软件 1-实验设置

  1. 启动激光控制中心。
    1. 确保选择 连续波 - 交流恒流 （CW-ACC） 模式。
    2. 打开两个激光器的电源。
    3. 检查/设置激光功率。
      注意:激光功率需要在激发二向色性之前测量，因为激发路径中的ND滤光片和分束器会根据激光控制面板上给出的数字降低激光功率。这里给出的数字是激发二向色性下的功率，但需要计算出与此相对应的激光控制上的功率。
      1. 220 μW 绿色激光器 （515 nm， 40 mW）
      2. μ70 W 用于红色激光器 （638 nm， 10 mW）
  2. smOTTER 采集软件
    1. 连接激光器、探测器、z 级和相机。正确 配置 它们 （可能 因特定 NI 卡 设置的设置而异）。

3. 发射路径的对齐（不是常规要求的）

  1. 设置对齐方式
    1. 将10μL游离Cy3B染料（〜100nM）移液到显微镜上，并按照下面的步骤4.3-4.5所述进行聚焦。
      注意:另一种供体染料在受体通道中泄漏一些也会起作用。
    2. 在 smOTTER 中打开" 对齐 "选项卡，降低激光功率，然后改变 Y 轴刻度，直到从检测器中看出读数。
      注意:这里的目标是增加信号，因此在信号增加后可能需要再次更改刻度。
    3. 拧下 smfBox 前面的四个螺钉，然后卸下前面板。
  2. 针孔对准
    1. 转动针孔定位器上的 x 旋钮，同时在"对齐"选项卡上观察信号，尝试以绿色和红色增加信号。
    2. 现在转动y旋钮以将针孔对准另一个方向。
    3. 返回 x 旋钮以检查信号是否有任何进一步增加。
  3. 针孔透镜对准
    1. 将镜头x旋钮向一个方向转动，这将减少信号。
    2. 将针孔 x 旋钮朝同一方向转动以再次增加信号。
    3. 如果新的最大信号高于以前，请继续沿该方向迭代移动针孔和透镜。如果它比以前低，则迭代地向相反的方向移动。
    4. 对 y 重复上述步骤。
  4. APD 镜头对准
    1. 从绿色 APD 开始，移动 x 旋钮，直到绿色信号达到最大值。
    2. 对 y 旋钮重复上述步骤。
    3. 返回到 x 旋钮，来回移动以查找信号开始下降的阈值点，并将其保持在这两点之间的中间位置。
    4. 对 x 旋钮重复上述步骤。
    5. 对红色APD镜头重复上述步骤，观察红色信号。
  5. 将前面板放回 smfBox 上并更换螺钉。
    注意:执行上述对准月度，如果怀疑显微镜在测量之间出现对准故障，则作为预防措施。

4. 测量数据采集

  1. 对于第一个样品，用浸泡在甲醇中的透镜清洁组织清洁载物台;在物镜上从一端到另一端轻轻擦拭。
  2. 将3-4滴浸入油用于显微镜检查，放在物镜的中心;在样品之间根据需要补充。
  3. 样品制备
    1. 将10μL样品（首先使用I型超纯水）移液到干净的盖玻片的中心。
    2. 小心地将盖玻片放在物镜上，使其与油成一定角度，以防止盖玻片和物镜之间产生气泡。
      注意:如有必要，请滑动盖玻片，将油中的气泡推离焦点。
  4. 要执行交变激光激发（ALEX）实验，请在激光占空比面板中配置激光器，如下所示。
    1. 供体（绿色激光） 0 关闭， 45 打开， 55 关闭
    2. 受体（红色激光） 50 关闭， 45 打开， 5 关闭
    3. 亚历克斯周期（μs）: 100
  5. 点击 Z焦点 选项卡在功能区;在采集面板中，将激光切换到 实时 并启动相机;调整曝光，使亮点出现在黑色中央。
    注:照相机捕获盖玻片和样品之间的玻璃/水界面反射的光，当焦点位于该界面时，可见光圈处于最小直径。因此，有必要从该界面下方开始，增加界面的z高度，然后稍微进一步聚焦在盖玻片上方和被测样品中。
    1. 从低Z位置开始，增加高度，直到亮点达到其最小尺寸，然后将高度进一步提高20μm，以使激光聚焦在油和盖玻片上方以及样品中。
    2. 对焦后停止相机。
  6. 为了确认设置是否已正确执行，请监测I型超纯水的痕量，以没有看到荧光信号;重复确认制备样品的缓冲液的纯度。
  7. 用橡胶端镊子小心地取下盖玻片，以避免损坏物镜，然后将如上所述制备的感兴趣样品放在物镜上。根据需要补充浸油，以保持盖玻片与物镜之间的均匀接触面积（特别注意样品在盖玻片上的接触面积和物镜的焦点区域）
  8. 集中宾果游戏
    1. 为了确保获得单分子数据，样品需要处于在smoTTER的实时痕量面板中每秒观察到1-5个突发的浓度（这最大限度地减少了同时存在于检测体积中多个分子的机会）。在确定适当的浓度后进行测量。
    2. 为了防止长时间实验过程中的蒸发，请准备一个气密的样品室。将硅胶隔离器（直径为 8-9 mm 的孔）向下压在盖玻片的中心（用移液器吸头着色）。然后，小心地将样品移入中心，避免与硅胶接触。然后，将第二个盖玻片放在顶部并按压以形成密封。
    3. 检查实时化学计量与FRET效率（ES）直方图，以查看样品的行为是否符合预期，即预期的FRET效率和合理的化学计量（~0.5）。
  9. 示例准备就绪后，在保存设置面板中输入实验的详细信息。通过单击保存设置面板中的省略号图标（以 hdf5/h5 格式保存的文件）来选择适当的目录和文件名。
    1. 输入样品名称、样品详细信息、供体和受体标签、缓冲液、供体和受体激发波长、检测波长和激光功率以及用户和用户从属关系的信息。
  10. 返回到功能区中的实时跟踪选项卡，然后在采集面板中输入实验长度（以分钟为单位），选择适当的保存间隔，以在发生错误时减少潜在的数据丢失。如果需要，请选择 "保存激光功率"。
  11. 按 "开始" 获取数据。
    注意:为了能够准确测定FRET，至少需要测量两个样品，其中包含相同的供体和受体染料，但FRET效率完全不同。

5. 分析/软件 2

  1. 使用FRETBursts python包启动Jupyter notebook（设置说明可以在这里找到:https://craggslab.github.io/smfBox/anasoftware.html）
  2. 如果不需要校正绝对 FRET 效率（即，只有 FRET 的相对变化才足以进行测量），则启动 Jupyter notebook FRET Analysis 1.4 Uncorrected.ipynb。使用此功能可将图形或数据导出为 csv 文件，以便在其他软件中进行进一步分析或绘图。
    注意:每个笔记本都包含详细的说明，以指导用户完成分析过程。有关分析过程的更详细讨论，包括突发搜索算法、背景校正和所有校正参数，请参阅23，25。
  3. 如果需要校正绝对的FRET效率，首先计算串扰参数α（供体发射泄漏到受体通道中）和δ（供体激发下受体直接激发的比例）。
    1. 首先启动Jupyter笔记本 校正因子查找器Alpha-Delta.ipynb 并确定alpha和delta参数。
      注意:如果样品之间的这些不一致，则显微镜可能在测量之间产生了对准问题，或者样品之间的染料光谱不同。
    2. 如果 alpha 和 delta 参数一致，请启动 Jupyter 笔记本 校正因子查找器 Gamma-Beta.ipynb 以确定 gamma 和 beta 参数（这解释了染料之间激发和检测效率的差异）。
      注意:如果γ和β图不太合适，显微镜可能在测量之间产生了对准问题，或者量子产率，或者样品之间染料的消光系数不同。
    3. 确定四个串扰参数后，可以在 FRET Analysis 1.4 Corrected.ipynb Jupyter 笔记本中使用这些因素来确定绝对 FRET 效率。

6. 故障排除

  1. 如果所有信号都很低或每个突发的计数低于预期（这与染料有关-但对于SmfBox上的ATTO-550和ATTO-647N，在单分子突发期间，典型值在每毫秒50到100个计数之间），请重新对齐smfBox。
  2. 在ES直方图上双重和单独标记的种群之间架起桥梁。
    注意:这可能是由于浓度过高（通过稀释样品来补救这一点）或光漂白引起的，这可能是由于使用过高的激光功率引起的（通过降低激光功率来补救）。
  3. 如果在整个实验过程中爆破率下降（荧光标记的分子可能粘附在玻璃盖玻片上），请使用增加浓度的BSA进行校正。
  4. 如果爆破率在整个实验过程中增加（样品可能蒸发），如上所述准备气密样品室。
  5. 如果信号在对准过程中崩溃为零（软件可能被来自探测器的信号淹没），请降低激光功率或使用更稀释的对准样品。
  6. 如果 Z 焦点显示同心环（如果将多个盖玻片放置在物镜上，则可能会发生这种情况），请检查物镜上是否有多个盖玻片。
  7. 如果样品含有明亮、长的中间化学计量（由聚集分子引起），请使用去垢剂或修改样品纯化方案。
    注意:获得干净的缓冲液可能是一个问题，因为某些缓冲液组分通常含有非常少量的中等荧光污染物，这些污染物足以在时间迹线上以单色脉冲的形式呈现。如果缓冲液中含有过多的这种物质，则可能与样品爆破重合，并改变所测量的FRET效率或化学计量。特别是BSA在这方面经常存在问题，因此将库存BSA溶液暴露于强光源中以光漂白污染物是有帮助的。

结果

该协议需要在设置过程中对实验条件进行关键评估（参见协议步骤4.8）。在此阶段获得决定实验成功或失败的第一个结果。一个积极的结果是每秒有五到一个突发（见 图2B，C）。负面结果将是该时间范围内的突发次数过多（图2A）或突发次数太少（图2D）。在这个阶段，仍然有可能纠正这些错误:浓度过高的样品只需要稀释;但是，如果浓度太低，则可能需要制备新的样品（决定因素是在这种低浓度下是否仍有可能在合理的时间范围内收集数据）。

figure-results-433
图2:实验设置期间来自实时痕量的屏幕截图，显示不同浓度的双标记DNA样品 。（A）过高，（B）可接受上限，（C）靶标浓度，（D）太低。光子计数（1 ms bins）显示在三个检测通道中;供体激发（DD）后的供体发射，供体激发（DA）后的受体发射和受体激发（AA）后的受体发射。 请点击此处查看此图的放大版本。

静态单物种系统通常需要30到60分钟的测量才能获得强大的数据分析所需的约1，000次突发。所需的时间长度和爆发次数将随着多个物种或动态系统而增加。使用协议图进行数据收集和分析后，将从Jupyter笔记本中导出。交替图（图3A）应与实验装置的ALEX周期相匹配。时间迹线（图3B）用于定性评估样品浓度是否合理。背景图（图3C）显示了光子间延迟周期的分布，其线性拟合与估计背景速率的较长时间26。背景迹线（图3D）可以识别样品在实验过程中是否有变化;这主要是由于在较长的采集时间内蒸发。为所有光子（图3E）和双重标记的物种（图3F）生成ES直方图。最后，使用突发数据的高斯拟合生成一维E直方图（图3G）。

figure-results-1539
图 3:Jupyter Notebooks 生成的分析数据的示例图输出。 （A） 交替图，（B） 时间迹线，（C） 背景确定，（D） 背景率，（E） 所有光子 ES 直方图，（F） 双通道 ES 直方图和 （G） 1D E 直方图。 请点击此处查看此图的放大版本。

名字序列
1a5'- 嘎嘎 CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3'
3'- CTC 广汽 TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5'
1b5'- 嘎嘎 CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3'
3'- CTC 广汽 TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5'
1c5'- 嘎嘎 CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3'
3'- CTC 广汽 TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5'

表1:方案中使用的DNA序列。核苷酸以蓝色和红色突出显示，分别代表用Atto-550和Atto-647N标记的C2氨基修饰胸腺嘧啶残基。

校正因子查找器 Alpha-Delta:请点击此处下载此文件。

校正因子查找器 Gamma-Beta: 请点击此处下载此文件。

FRET分析 1.4 已更正: 请点击这里下载此文件。

FRET分析 1.4 未更正: 请点击这里下载此文件。

讨论

方案中最关键的步骤是显微镜的对准和将样品浓度调整到正确的稀释度。如果对准关闭，则可能没有足够的信号来识别突发和绘制直方图，如果样品之间发生不对准，则由于泄漏和检测/激发效率的变化，准确的FRET校正可能会失败。使用适当的浓度也很重要，浓度过高会产生重合的爆发，包含具有潜在不同FRET效率或标记化学计量的多个分子。浓度过低将导致爆发太少，无法进行可靠的数据分析。

此处描述的协议用于测量静态单个FRET物种的距离。如果样品在FRET效率直方图中具有多个峰，或者峰看起来很宽（动态物种可能会发生这种情况），则可能需要更多的脉冲才能将直方图拟合到相同的精度。对于两个分离良好的峰值，则需要大约两倍的数据，但如果总体略有重叠，则需要更多的数据。

如果两个群体在实验的时间尺度上相互转换，则可以潜在地确定系统的动力学和动力学。BVA27和2CDE28等测试可以证实中间爆发本质上是动态的，而包括dPDA29，30或H2MM31在内的分析可以确定相互转换的速率。用于BVA和2CDE的Jupyter笔记本可在FRETBursts26网站上找到，基于MATLab的软件PAM32可以运行BVA，2CDE和PDA分析。

共聚焦单分子FRET可以很容易地观察到比TIRF寿命短得多（~1 ms）的状态;然而，受扩散限制的短观察时间没有给出分子历史，因此不能像表面固定实验那样确定更长的停留时间或复杂的过渡网络。

由于该协议以非常低的浓度测量自由扩散的分子，因此在测量同一分子上的分子内距离时效果最佳。可以测量瞬态结合分子之间的分子间距离，前提是两个分子的Kd 足够低，使得配合物在实验所需的低工作浓度（〜100 pM）下以显着的数量存在。如果Kd 远高于此值，则只能看到单独标记的分子。这个问题可以通过使用微流体以高浓度将两种标记的组分混合在一起，然后在复合物解离之前快速稀释并流过物镜来克服33，34。

与集合技术相比，在单分子水平上测量FRET效率具有显着优势，因为它可以告知异质亚群，在集合实验中，异质亚群将被平均。此外，带有ALEX的单分子FRET可以获得精确的FRET效率，这可以转换为精确的距离。这样可以确定更详细的结构信息，而不是简单地探测相对距离变化。smfBox具有所有这些优点和功能，但可以比能够共聚焦smFRET23的同类商用显微镜在低得多的预算下构建。

smfBox代表了smFRET技术的进入门槛要低得多，使研究人员能够测量构象变化，以及蛋白质和核酸内部和之间的精确距离7，8，9，10，11，35。

披露声明

作者声明没有竞争利益。

致谢

作者感谢以下资金来源:BBSRC（BB/T008032/1）;EPSRC（B.A.的助学金）和MRC（A.R.-T.的学生奖学金）。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Amino modified oligonucleotideEurogentecN/AMay be ordered from various suppliers or synthesised; amino modification enables labeling with NHS-ester modified dyes
Avalanche photodiode (APD)ExcelitasSPCM-AQRH-14Two APDs are required for the smfBox setup
Bovine Serum Albumin (BSA)MerckA2153System dependant; imaging buffer component (0.1 mg/mL in buffer)
Compact Laser CombinerOMICRONLightHUB-2515 nm (80 mW) and 638 nm (100 mW) lasers
CoverglassVWR630-2742Thickness: 0.17 ± 0.01 mm, LxW: 22x22 mm
Cy3BCytivaPA631011 mg, PA63100 (5 mg), PA96106 (25 mg)
FRETBursts Python PackageN/AN/AOpen-source python package for burst analysis of freely-diffusing single-molecule FRET data: https://fretbursts.readthedocs.io
Imaging BufferN/ASystem dependant; 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM Tris pH 7.5 and 0.1 mg/mL BSA
Immersion OilOlympusIMMOIL-F30CC
Jupyter notebooksProject JupyterN/AOpen-source web application to create and share documents that contain live code, equations, visualizations and text; data analysis notebooks for smfBox can be found in the SI
Lens TissueThorLabsMC-5MC-50E is same item in bulk
Magnesium ChlorideMerckM2670System dependant; imaging buffer component (20 mM in buffer)
MilliQ/Ultrapure waterN/A
NanopoistionerPiezoconceptFOC300Nanopositioner for accurate positioning of microscope objective
NHS-ester modified ATTO-550ATTO-TECAD 550-311 mg, AD 550-35 (5 mg)
NHS-ester modified ATTO-647NATTO-TECAD 647N-311 mg, AD 647N-35 (5 mg)
Objective lensOlympusN1480700Olympus objective series from orignal smfBox discontinued; replaced by N5702300
OMICRON Control Center (OCC)- laser control centerOMICRONN/Av3.5.34 - OMICRON laser driver software
Press-To-Seal silicone isolatorGrace Bio-Labs664201 8-9 mm Diameter x 1.7 mm Depth
smOTTERN/AN/AOpen-source acquisition software for the Craggs Lab smfBox: https://github.com/craggslab/smOTTER
Sodium ChlorideMerckS7653System dependant; imaging buffer component (5 mM in buffer)
Tris baseMerck93362System dependant; imaging buffer component (5 mM, pH 7.5 in buffer)
Type I ultrapure waterMerckZIQ7000T0Milli-Q® IQ 7000 Ultrapure Water System

参考文献

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