在 NAFLD/NASH 的鼠模型中应用超声波和剪切波弹性成像

摘要

本协议描述了使用增强的超声波技术来无侵入性地观察和量化非酒精性脂肪肝病啮齿动物模型中的肝脏组织变化。

摘要

非酒精性脂肪性肝炎 （NASH） 是非酒精性脂肪肝病 （NAFLD） 谱系内的一种疾病，其特征是肝脂肪积累（脂肪积累）和炎症导致纤维化。临床前模型密切回顾人类NASH/NAFLD在药物开发中至关重要。虽然肝脏活检是目前测量 NAFLD/NASH 进展和诊断在临床上的黄金标准，但在临床前空间，在研究期间需要在多个时间点收集整个肝脏样本，或者需要肝脏活检进行组理分析来评估疾病阶段。

进行肝脏活检中期研究是一种侵入性和劳动密集型程序，收集肝脏样本以评估疾病水平会增加研究所需的研究动物数量。因此，需要一个可靠、可翻译、非侵入性的成像生物标志物来检测这些临床前模型中的 NASH/NAFLD。非侵入性超声波B模式图像和剪切波弹性扫描（SWE）可用于测量硬化和肝纤维化。为了评估SWE在NASH临床前啮齿动物模型中的效用，动物被置于支持NASH的饮食中，并进行了非侵入性超声B模式和剪切波弹性成像，以测量肝体（HR）指数和肝脏弹性，分别测量肝脏脂肪积累和组织僵硬的进展，在给定的NAFLD/NASH研究过程中的多个时间点。

人力资源指数和弹性数字与硬化和纤维化的组织学标记进行了比较。结果显示，HR指数与油红O（ORO）染色百分比之间以及肝脏的弹性和皮克罗-天狼星红（PSR）染色之间有很强的相关性。经典 前体内 方法与 体内 成像结果之间的强相关性提供了证据，证明剪切波弹性成像/超声波成像可用于评估 NAFLD/NASH 临床前模型中的疾病表型和进展。

引言

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一种代谢性疾病，其特征是肝脏中脂肪的过度积累，并迅速成为全球领先的肝病，最近报告的全球流行率为^25%。非酒精性脂肪炎 （NASH） 是 NAFLD 谱中进展较广的阶段，其特点是肝脂肪过多，细胞损伤、炎症和纤维化。这些疾病通常是沉默的，通过血液检查或常规检查没有被发现，直到病人的肝脏已经发生了相当大的损害。目前，患者诊断NASH的黄金标准是通过对患者肝脏活检样本的病理检查。同样，致力于了解NASH/NAFLD以及药物开发行业的临床前研究人员依靠肝脏样本的 活楔 活检或卫星组群的末期安乐死来测量病变、炎症和纤维化。

例如，肝楔活检一直是评估肌热和纤维化的标准技术，同时使用GUBRA NASH模型^2。肝楔活检方法在^小动物中具有侵入性和艰辛性。在研究中使用楔形肝脏活检代表了疾病模型中一个额外的实验变量，这通常会增加需要的动物数量。考虑到这些因素，可用于可靠评估NASH/NAFLD动物模型早期点的硬化和纤维化的非侵入性成像技术被证明是有价值的。剪切波弹性学 （SWE） 是一种基于超声波的方法，用于测量软组织的弹性。该技术测量超声波超声波对组织目标产生的剪切波的传播，然后计算一个称为E模态⁴的值。剪切波的速度与组织僵硬程度成正比。

图 1 和 图 2 显示成像区域设置和 SWE 仪器。SWE 仪器是一个单轮单元，配有两个屏幕和图 2A中显示的控制面板。上部监视器 （图 2B）充当计算机监视器，显示图像和患者目录。控制面板 （图 2C）是一系列按钮和表盘，可控制图像捕获的一般方面:冻结屏幕、保存图像、从一种模式更改为另一种模式。下屏幕 （图 2D） 是一个触摸屏，具有额外的控制来更改设置，并充当键盘，根据需要输入数据。如果需要，仪器配有手写笔，可在触摸屏上使用。超声波探头连接到设备的下前面板。对于啮齿动物的B模式和SWE成像，使用了超线性6至20兆赫传感器。这种非侵入性测量组织刚度的能力使SWE成为在NASH患者中识别和分期进行肝纤维化⁵ 的宝贵工具，减少了对更具侵入性的方法的需求。事实上，SWE已经用于测量患者的肝纤维化，是FDA批准的方法，在诊所⁶分纤维化评分。使用SWE监测该疾病动物模型中的NASH进展，将为治疗的发展提供一个转化工具，同时通过减少动物受试人数和改进 体内 程序来改善动物福利，以尽量减少疼痛和痛苦。

SWE成像在人类患者中使用低频超声波传感器^4，这是不理想的小动物。值得注意的是，高频SWE技术被用来评估乙酰-CoA卡盒酶抑制在大鼠^模型7中对NASH发病机制的疗效，该技术的实用性在肝纤维化碳四氯化物大鼠模型中得到了描述，与传统的METAVIR组理评分方法⁸相比，取得了成功的结果。然而，现有的文献缺乏关于SWE成像在NASH临床前模型中应用的详细技术和方法信息。如上所述，肝硬化是 NAFLD/NASH 状况的主要特征之一，也是考虑干预的重要阶段。因此，使用成像方式评估肝脂肪积累与在 NASH/NAFLD 临床前模型中评估肝纤维化同样重要。

一种被称为HR指数的超声波技术，肝脏组织亮度与肾皮质的比例，已被用作^9、10临床上硬化的代名词。然而，这种方法尚未在NAFLD/NASH的临床前动物模型中广泛使用。本文描述了一种测量弹性的方法以及HR指数作为肝纤维化和硬化的代名指标，分别在低血脂缺乏，高脂肪饮食（CDAHFD）大鼠模型的NAFLD/NASH。该模型诱发快速硬化，肝炎症和纤维化，这是可测量在6周内在小鼠^11。这种饮食中胆固醇的添加（1%）已被证明可以促进大鼠¹²的纤维生成，使该模型成为涉及剪切波成像的验证研究的合适候选者。总的来说，这种成像技术也可以应用于各种NASH模型/饮食，其中硬化和/或纤维化是感兴趣的终点。

研究方案

所有涉及动物的程序都经过辉瑞机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的审查和批准，并在 AAALAC（实验室动物护理评估和认证）国际认可机构中进行。

1. 疾病诱导

1. 使用雄性威斯特汉鼠（150-175克;+6-7周大;总共40只大鼠），这些大鼠没有已知的大鼠来临病原体。将大鼠与纸质床上用品单独通风（参见 材料表）成对存放，并将它们保持在 22 ± 1 °C，相对湿度为 40-70%，光黑周期为 12:12 h。
2. 根据研究设计，将体重为 150-175 克（+6-7 周大）的老鼠置于高胆固醇（n = 20）或标准实验室啮齿动物周（n = 20）的缺乏胆碱的高脂肪饮食中。
   注:在这项研究中，共有40只老鼠被登记，每组有20只动物。^在第 6周结束时，每组一半的组被坏死，用于肝脏样本的中期研究组织学分析。因此，样本量为每组10只动物，为第9^周 和第¹² 周的时间点。

2. 仪器设置

1. 设置成像区域如下:包括一个加热的表面，以保持动物在成像期间温暖（c在图1），和一个安全的麻醉鼻锥，以提供吸入麻醉，以保持整个过程麻醉平面（b在图1）。
2. 使用超声波探针支架，便于将超声波探头移到所需的位置，并防止探针落在动物身上。
   1. 在获得超声波图像的皮肤上使用加热超声波凝胶。
   2. 在整个过程中保持以下设置，可在触摸屏上进行调整:声学功率 0.0 dB:组织调谐器 1540 m/s;动态范围 60 dB;弹性范围（用于 SWE 模式）< 30 kPa。
3. 将超声波探头连接到专用支架的轨道系统（图1）。
4. 打开仪器并允许其启动。打开显示器后，请注意带有连接传感器详细信息的 B 模式 图像。

3. 学科准备

1. 确保动物在成像程序前至少 4 小时禁食，以防止肠道内容干扰图像采集。
   1. 禁食至少4小时后，将老鼠放在异黄酮麻醉诱导室，直到达到适当的麻醉水平，确认对脚趾捏没有反应。将动物暴露在3-5%异黄素下3-5分钟，诱导麻醉。
   2. 对于维护麻醉，在图像采集过程中将动物保持在 2-3% 异黄素以下。应用眼科软膏，保护眼睛在麻醉期间不干燥。
2. 麻醉完成后，将动物从感应室中取出，放在温热水循环毯子上。将麻醉鼻锥放在鼻子上，将动物剃在右侧，从肋骨到骨盆。使用化学脱毛霜去除此区域的所有剩余头发。
3. 一旦头发被去除，将动物放在左侧侧卧，上爪贴在头部上方的温暖成像平台上（图3A）。
4. 按仪器控制面板上的 患者 密钥，根据研究设计确定主题。
   1. 通过点击触摸屏上的图标打开仪表上的 键盘 功能。根据需要键入名称。
   2. 点击 "退出" 以退出患者姓名屏幕。观察显示器上的 B 模式重新打开。

4. 肝肾（HR）指数测量图像采集

1. 将少量加热的超声波凝胶涂抹在动物的脱皮皮肤区域。
2. 移动超声波探头以触摸受试者的凝胶覆盖区域（图3B）。一旦监视器上出现受试者内部器官的实时 B 模式图像，将超声波探头移到臀部稍高的区域，仅与腰椎（下垂平面）平行。
3. 使用显示器上的B模式显示，通过识别大肾动脉和皮层/美杜拉分离（图4A）定位右肾。此外，在图像的单平面中观察部分肝脏。
   1. 确保很少或根本没有图像文物，如阴影和气泡。
4. 测量 B 模式比率以获取人力资源指数。
   1. 确保肾皮层和肝皮质都在同一个焦点平面上。如果需要，调整对焦并获得控制以获得清晰的图像。
      1. 通过在控制面板上转动焦点旋钮来调整 对 焦。通过按下 自动 TGC 按钮一次来调整增益。
   2. 按控制面板上的 冻结 密钥。在冻结屏幕时，确保动物处于呼吸之间，以避免图像模糊。
   3. 冻结屏幕后，点击触摸屏上的 测量工具 。选择 B模式比率，一种内置工具，从选定的兴趣区域测量组织的相对亮度。创建一个 2 mm 圆圈来选择感兴趣的区域 （ROI）。通过沿控制面板上的轨道球外边缘移动手指来调整圆圈大小。
   4. 将 2 mm 圆放在肝脏图像 ROI 上，应位于肾脏右侧。根据其均匀的回波原性和光滑的轮廓识别肝脏组织。
   5. 圆圈到位后，按控制面板上的 "选择 "按钮，并观察出现的新圆。
   6. 将新圆的大小调整为 2 mm，并将其放置在肾脏皮层的图像上。一定要保持肝脏和肾脏皮层的圆的深度相同。一旦到位，请按控制面板上的 "选择 "按钮。观察内置系统工具，将人力资源指数显示为 B 模式比率。
   7. 按 "保存图像 "以保存图像，并观察显示器右侧作为缩略图显示的已保存图像。
   8. 按控制面板上的 冻结 按钮以解冻图像并返回到实时 B 模式图像。
5. 在组织不同深度和平面上重复 B 模式比率测量 3 次。计算每个动物和时间点这三个 B 模式比率的平均值。

5. 剪波弹性成像图像采集

1. 在右子宇宙区域横向移动探针，使用 B 模式定位肝脏。找到肝脏的区域，大部分是帕伦奇马和没有大血管，如门户静脉和肝动脉。一旦发现肝脏的清晰区域，通过按控制面板上的 SWE 按钮生成组织的剪切弹性图。
2. 调整肝脏胶囊下方的 SWE 盒的大小和位置，该区域没有阴影。将胶囊识别为靠近肝脏顶部的明亮回波线。
3. 观察 SWE 框在 5-10 s 内过渡到彩色地图。一旦盒子装满并稳定下来，当动物在呼吸之间时，按下控制面板上的 冻结 按钮。
   注:箱体覆盖率最低应为60-80%，以准确评估肝脏的弹性。
4. 在触摸屏上，点击 QBox，这是一个内置系统工具，从剪切波弹性图上的 ROI 计算弹性。观察显示器上显示的圆圈和数据框。通过点击触摸屏上的位置图标到所需的设置来调整 QBox 的位置。
5. 通过沿控制面板上的轨迹球外边缘移动手指，将圆的大小调整到 3 mm。使用轨迹球，将圆圈放置在无阴影、颜色均匀的区域（图 5A，B）。小心避免已知的僵硬区域，如血管或肝胶囊，以及从这些结构出血。
6. 找到足够的区域后，按控制面板上的 "保存图像 "以保存图像。在肝脏的不同区域重复此过程 3 次。将探针向上和向下移动或侧身移动，以收集来自肝脏不同区域的 SWE 映射图像。
7. 收集完所有图像后，按控制面板上的 "结束检查 "，并记录显示器上出现的患者信息屏幕。
8. 从动物的爪子上取下胶带，擦去多余的凝胶，并将动物从成像阶段移走。让它在温暖干燥的笼子里从麻醉中恢复过来，直到完全康复。监测每只动物，以确保从麻醉中完全恢复，这说明它有能力保持胸骨复发
9. 重复步骤在第 4-5 节中，以对队列中的每个动物进行成像。

6. 图像数据检索和分析

1. 收集所有动物的图像后，关闭麻醉。
2. 要从机器中拉取图像数据，按下控制面板上的 "查看" 按钮，并观察显示器上显示的仪器上的所有扫描。使用屏幕上角的搜索窗口搜索所需的扫描。
3. 通过跟踪球和 选择 按钮检查患者姓名旁边的框，选择数据分析所需的所有扫描。突出显示所有需要的扫描后，请在触摸屏上选择 "出口 JPEG"。 将数据导出到网络驱动器或便携式通用串行总线 （USB） 驱动器。定位仪器背面的 USB 端口。
4. 导出文件后，在工作站计算机上打开每次扫描的单个 jpg 文件。观察图像右侧的所有数据:B 模式比率收集 B 比率编号:Q 盒收集平均弹性 （kPa） 值。
5. 将所有数据输入电子表格或其他数据库管理软件，并执行所需的统计分析。

7. 肝脏样本的病理分析

1. ^在第6周结束时，对每组一半的组进行尸检，对肝脏样本进行中期组织学分析。同样，对其余动物实施安乐死，并^在第12周收集肝脏样本进行组织学分析。
2. 对于ORO染色，将肝脏部分固定在10%的中性缓冲形式素中，并用蔗糖冷冻保存，至少在一夜之间使用冷藏的30%蔗糖溶液。将部分冷冻在最佳切割温度化合物中，并将它们冷冻部分嵌入带电滑梯上，为 ORO 染色做好准备。
3. 将低温部分放在 100% 丙二醇中 2 分钟，然后在 0.5% ORO 溶液中过夜孵化。从 ORO 溶液中取出后，将 85% 丙二醇中的部分区分为 1 分钟，在去离子水中冲洗，并与迈尔的血氧林-莉莉的修改对立 1 分钟。
   1. 使用无声安装介质在滑梯上放置盖片，并在室温下干燥。
4. 对于 PSR，去帕拉菲化正式固定， 石蜡嵌入式肝脏部分滑梯，将其放置在 Bouin 流体中过夜，然后按照制造商的协议使用自动滑动染色器用一些优化步骤（1% 磷酸 5 分钟;0.1% 天狼星红在饱和皮脂中 90 分钟;2 x 30s 洗涤 0.5% 醋酸）。自动脱水滑梯，然后用永久安装介质安装滑梯。
5. 使用 20 倍放大倍的数字显微镜扫描仪捕获 ORO 和 PSR 染色幻灯片的图像，以 。svs 格式保存它们，并存储在幻灯片管理器图像数据库中。
6. 使用数字病理学软件中创建的自定义算法分析图像。统一应用具有阈值参数的数字病理学软件应用程序，以识别和量化肝节区域以及ORO和PSR染色区域。将测量结果导出到电子表格以进行区域百分比计算。

8. 统计分析

1. 使用 Sidak 的多重比较测试，使用双向 ANOVA 对成像数据进行统计分析，以评估不同时间点的组之间的差异。假设概率值 p ≤ 0.001 的组之间存在显著差异。此外，将成像读数与形态分析进行相关性分析。
2. 使用非参数统计来分析本研究的组理分析结果。将组值报告为半四分位数范围 （sIQR） ±中值。假设概率值 p ≤ 0.001 的组之间存在显著差异。使用曼-惠特尼测试来比较不同组之间的PSR和ORO组织化学污渍的数量。

结果

喂养 CDAHFD 的动物的一个标志是硬化。肝脏中脂肪的积累改变了组织的回波特性，通过测量肝脏的亮度并使其从同一平面拍摄的B模式图像正常化为肾皮质的亮度，可以量化组织。量化值表示为人力资源指数，这是一种间接的硬化度测量。在 图4A中，来自对照动物的代表性肝脏图像显示与肾脏皮层相比，亮度（回声原性）大致相同或更低。因此，正常动物的HR指数为<1。在这项...

讨论

超声波成像，包括SWE，可以成为在NAFLD/NASH临床前模型中纵向评估肝硬化和僵硬的宝贵工具。本文描述了如何获得高质量的B模式以及SWE肝脏图像的详细方法，以便使用CDAHFD饮食诱导的NASH大鼠模型测量HR指数和弹性。此外，结果表明，人力资源指标与弹性与肝组织评价组织评价的黄金标准具有极高的相关性。虽然程序本身似乎不复杂，但协议的某些关键方面将确保成功的结果。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aixplorer	Supersonic Imagine		Shear Wave Elastography Instrument
Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer	Supersonic Imagine		Transducer for Shear Wave Elastography
Alpha-dri bedding			rat cages
Aperio AT2 scanner	Leica Biosystems		Digital Pathology Brightfield Scanner
Compac 6 Anesthesia System	VetEquip		Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however.
Manage Imager Database	Leica Biosystems		Digital Pathology
Mayer's Hematoxilin	Dako/Agilent		H&E Staining/Histology
Nair	Church & Dwight		Hair remover
Oil Red O solution	Poly Scientific		Lipid Staining/Histology
Picrosirius Red Stain (PSR)	Rowley Biochemical	F-357-2	Collagen Stain/Histology
Puralube Opthalmic ointment	Dechra Veterinary Product		Lubrication to prevent eye dryness during anesthesia
Tissue-Tek Prisma Plus	Sakura Finetek USA		Automated slide stainer
VISIOPHARM software	Visiopharm		Digital pathology software
	Research Diets	A06071309i	NASH inducing diet
	Purina	5053	Control animal chow
Vevo imaging station	Fujifilm VisualSonics		The Vevo imaging station is used for holding the ultrasound transducer during imaging.
Wistar Han rats	Charles River Laboratories