Aplicação de Ultrassom e Elastografia de Ondas de Cisalhamento em um modelo de rato de NAFLD/NASH

Resumo

Este protocolo descreve o uso de uma técnica de ultrassom aprimorada para observar e quantificar invasivamente as alterações nos tecidos hepáticos em modelos de roedores de doença hepática gordurosa não alcoólica.

Resumo

Esteatohepatite não alcoólica (NASH) é uma condição dentro do espectro da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica (NAFLD), que é caracterizada pelo acúmulo de gordura hepática (esteatose) e inflamação que leva à fibrose. Modelos pré-clínicos que recapitulam de perto nash/NAFLD humano são essenciais no desenvolvimento de medicamentos. Embora a biópsia hepática seja atualmente o padrão-ouro para medir a progressão e o diagnóstico de NAFLD/NASH na clínica, no espaço pré-clínico, seja a coleta de amostras de fígado inteiros em vários momentos durante um estudo ou biópsia do fígado é necessária para análise histológica para avaliar o estágio da doença.

A realização de uma biópsia hepática no meio do estudo é um procedimento invasivo e intensivo em mão-de-obra, e coletar amostras hepáticas para avaliar o nível da doença aumenta o número de animais de pesquisa necessários para um estudo. Assim, há a necessidade de um biomarcador de imagem confiável, traduzível e não invasivo para detectar NASH/NAFLD nesses modelos pré-clínicos. Imagens não invasivas do modo B baseadas em ultrassom e shear wave elastography (SWE) podem ser usadas para medir esteatose, bem como fibrose hepática. Para avaliar a utilidade da SWE em modelos de roedores pré-clínicos de NASH, os animais foram colocados em uma dieta pró-NASH e foram submetidos ao modo B de ultrassom não invasivo e à imagem de elastografia de ondas de cisalhamento para medir o índice hepato-feminino (HR) e a elasticidade hepática, medindo a progressão tanto do acúmulo de gordura hepática quanto da rigidez tecidual, respectivamente, em vários pontos de tempo ao longo de um determinado estudo NAFLD/NASH.

O índice de RH e os números de elasticidade foram comparados aos marcadores histológicos de esteatose e fibrose. Os resultados mostraram forte correlação entre o índice de RH e o percentual de manchas de O Vermelho Óleo (ORO), bem como entre a elasticidade e a coloração picro-sirius vermelha (RSE) dos fígados. A forte correlação entre métodos clássicos ex vivo e resultados de imagem in vivo fornece evidências de que a elastografia de ondas de cisalhamento/imagem baseada em ultrassom pode ser usada para avaliar o fenótipo da doença e a progressão em um modelo pré-clínico de NAFLD/NASH.

Introdução

A doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) é uma condição metabólica caracterizada por um acúmulo excessivo de gordura no fígado e está rapidamente se tornando uma doença hepática líder em todo o mundo com uma prevalência global recentemente relatada de 25%¹. Esteatohepatite não alcoólica (NASH) é um estágio mais progressivo do espectro de NAFLD, caracterizado pelo excesso de gordura hepática com dano celular progressivo, inflamação e fibrose. Essas doenças são muitas vezes silenciosas, não detectadas através de exames de sangue ou exames de rotina, até que danos consideráveis já tenham ocorrido ao fígado de um paciente. Atualmente, o padrão-ouro para diagnosticar NASH em pacientes é através de exame histológico de amostras de biópsia hepática derivadas do paciente. Da mesma forma, pesquisadores pré-clínicos que trabalham para entender a patogênese de NASH/NAFLD, bem como a indústria de desenvolvimento de medicamentos, dependem da biópsia in vivo de amostras de fígado ou eutanásia terminal de coortes de satélite para histologia para medir esteatose, inflamação e fibrose.

Por exemplo, a biópsia da cunha hepática tem sido uma técnica padrão para avaliar esteatohepatite e fibrose durante o uso do modelo GUBRA NASH². O método de biópsia da cunha hepática é invasivo e trabalhoso em animais pequenos³. O uso de biópsia hepática cunhada no meio de um estudo representa uma variável experimental adicionada em um modelo de doença, o que muitas vezes aumenta o número de animais que são necessários. Com esses fatores em mente, técnicas de imagem não invasivas que podem ser usadas para avaliar de forma confiável a esteatose e a fibrose em modelos animais NASH/NAFLD em pontos de tempo inicial se mostram valiosas. Shear wave elastography (SWE) é um método baseado em ultrassom usado para medir a elasticidade dos tecidos moles. A técnica mede a propagação de ondas de cisalhamento criadas por pulsos de ultrassom supersônicos direcionados a um alvo tecidual e, em seguida, calcula um valor chamado E modulus⁴. A velocidade da onda de tesoura é proporcional ao grau de rigidez tecidual.

As figuras 1 e figura 2 mostram a configuração da área de imagem e o instrumento SWE. O instrumento SWE é uma unidade única com duas telas e um painel de controle mostrado na Figura 2A. O monitor superior (Figura 2B) atua como monitor de computador e exibe imagens e diretórios do paciente. O painel de controle (Figura 2C) é uma matriz de botões e mostradores que controlam aspectos gerais da captura de imagem: congelar tela, salvar imagens, mudar de um modo para outro. A tela inferior(Figura 2D) é uma tela sensível ao toque com controles adicionais para alterar configurações e age como um teclado para inserir dados conforme necessário. O instrumento é equipado com uma caneta para usar na tela de toque, se desejar. As sondas de ultrassom se prendem ao painel frontal inferior do dispositivo. Para o modo B e a imagem SWE em roedores, foi utilizado o transdutor super-linear de 6 a 20 MHz. Essa capacidade de medir não invasivamente a rigidez tecidual faz da SWE uma ferramenta valiosa para a identificação e estadiamento da fibrose hepática⁵ em pacientes nash, diminuindo a necessidade de métodos mais invasivos. A SWE tem sido, de fato, usada para medir a fibrose hepática em pacientes e é um método aprovado pela FDA para escorar fibrose na clínica⁶. O uso da SWE para monitorar a progressão do NASH em modelos animais da doença forneceria uma ferramenta translacional para o desenvolvimento de tratamentos e, simultaneamente, melhoraria o bem-estar animal através da redução do número de indivíduos animais e do refinamento de procedimentos in vivo para minimizar a dor e a angústia.

A imagem SWE em pacientes humanos usa um transdutor de ultrassom de baixa frequência⁴, o que não é ideal para animais de pequeno porte. Notavelmente, técnicas de SWE de alta frequência têm sido utilizadas para avaliar a eficácia da inibição de acetil-CoA em patogênese de NASH em um modelo⁷de ratos , e a utilidade desta técnica tem sido descrita em modelos de ratos tetraclorito de carbono de fibrose hepática com resultados bem sucedidos quando comparados aos métodos tradicionais de pontuação histológica METAVIR⁸. No entanto, a literatura existente carece de informações detalhadas sobre a aplicação de imagens SWE em modelos pré-clínicos de NASH. Como descrito acima, a esteatose hepática é uma das principais características da condição NAFLD/NASH e é um estágio importante onde a intervenção pode ser considerada. Assim, avaliar o acúmulo de gordura hepática utilizando uma modalidade de imagem é tão importante quanto avaliar a fibrose hepática em modelos pré-clínicos de NASH/NAFLD.

Uma técnica de ultrassom conhecida como índice de RH, uma razão de brilho tecidual do fígado em comparação com a do córtex renal, tem sido usada como marcador substituto de esteatose na clínica^9,10. Esta abordagem, no entanto, não tem sido amplamente utilizada em modelos animais pré-clínicos de NAFLD/NASH. Este artigo descreve um método de medição da elasticidade, bem como o índice de RH como um marcador substituto de fibrose hepática e esteatose, respectivamente, em um modelo de rato deficiente em colina e alta gordura (CDAHFD) do NAFLD/NASH. Este modelo induz esteatose rápida, inflamação hepática e fibrose, que é mensurável dentro de 6 semanas em camundongos¹¹. A adição de colesterol (1%) a esta dieta tem sido demonstrada para promover a fibrogênese em ratos¹², tornando este modelo um candidato adequado para estudos de validação envolvendo imagens de ondas de tesoura. No geral, essa tecnologia de imagem também pode ser aplicada a uma ampla gama de modelos/dietas NASH onde a esteatose e/ou fibrose é um ponto final de interesse.

Protocolo

Todos os procedimentos envolventes aos animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Pfizer e realizados em uma unidade credenciada internacional da AAALAC (Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care).

1. Indução de doenças

1. Use ratos Wister Han machos (150-175 g; ~ 6-7 semanas de idade; total de 40 ratos) que estão livres de patógenos avencionários de ratos conhecidos. Abriga os ratos em pares em caging individualmente ventilado com cama de papel (ver a Tabela de Materiais) e mantê-los a 22 ± 1 °C, 40-70% de umidade relativa com um ciclo claro-escuro de 12:12 h.
2. Coloque os ratos pesando 150-175 g (~6-7 semanas de idade) em uma dieta deficiente em colina, com 1% de colesterol (n = 20) ou uma chow de roedor de laboratório padrão (n = 20) dependendo do desenho do estudo.
   NOTA: Neste estudo, foram inscritos 40 ratos com 20 animais por grupo. Ao final da^6ª semana, metade da coorte de cada grupo foi necropsiada para análise histológica de amostras hepáticas no meio do estudo. Assim, o tamanho da amostra foi de 10 animais por grupo para os pontos de tempo de 9^e 12^semanas.

2. Configuração do instrumento

1. Configure a área de imagem da seguinte forma: inclua uma superfície aquecida para manter o animal aquecido durante a imagem (c na Figura 1), e um cone de nariz de anestesia assegurado para entregar anestesia inalante para manter um plano de anestesia durante todo o procedimento (b na Figura 1).
2. Use um suporte de sonda de ultrassom para facilitar a movimentação da sonda de ultrassom para o local desejado e para evitar que a sonda repouse sobre o animal.
   1. Use gel de ultrassom aquecido na pele onde a imagem do ultrassom é adquirida.
   2. Mantenha as seguintes configurações ao longo do procedimento, que podem ser ajustadas na tela sensível ao toque: Alimentação Acústica 0.0 dB; Sintonizador de tecido 1540 m/s; Alcance Dinâmico 60 dB; Faixa de elasticidade (para o modo SWE) < 30 kPa.
3. Anexar a sonda de ultrassom ao sistema ferroviário no suporte especializado (a na Figura 1).
4. Ligue o instrumento e deixe-o inicializar. Uma vez que o monitor esteja ligado, observe a imagem do Modo B com detalhes do transdutor conectado.

3. Preparação do assunto

1. Certifique-se de que os animais estão em jejum pelo menos 4h antes do procedimento de imagem para evitar que o conteúdo intestinal interfira na aquisição de imagens.
   1. Após pelo menos 4h de jejum, coloque um rato em uma câmara de indução anestésico isoflurane até que um nível adequado de anestesia seja atingido, confirmado sem resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo. Exponha os animais a 3-5% de isoflurane por 3-5 min para induzir anestesia.
   2. Para anestesia de manutenção, mantenha os animais abaixo de 2-3% de isoflurane durante a aquisição de imagens. Aplique pomada oftalmica para proteger o olho da secagem durante a anestesia.
2. Uma vez alcançada a anestesia, remova um animal da câmara de indução e coloque-o em um cobertor de corrente de água quente e quente. Coloque um cone de nariz anestésico sobre o focinho, e raspe o animal do lado direito, da caixa torácica à pélvis. Use creme de depilação química para remover todos os cabelos restantes nesta área.
3. Uma vez removido o cabelo, coloque um animal na recumbência lateral esquerda com patas superiores coladas acima da cabeça em uma plataforma de imagem quente(Figura 3A).
4. Pressione a tecla paciente no painel de controle de instrumentos e identifique o sujeito de acordo com o desenho do estudo.
   1. Abra a função Teclado no instrumento tocando no ícone na tela sensível ao toque. Digite os nomes conforme desejado.
   2. Toque em Sair para sair da tela do nome do paciente. Observe que o modo B reabre no monitor.

4. Aquisição de imagem para medição do índice hepato-renal (HR)

1. Aplique uma pequena quantidade de gel de ultrassom aquecido na região da pele depilada no animal.
2. Mova a sonda de ultrassom para tocar a área coberta de gel do sujeito(Figura 3B). Uma vez que uma imagem ao vivo do modo B dos órgãos internos do sujeito apareça no monitor, mova a sonda de ultrassom para a área ligeiramente acima do quadril, apenas paralelamente às vértebras lombares (plano sagital).
3. Utilizando o visor do modo B no monitor, localize o rim direito identificando a artéria renal grande e a separação do córtex/medula(Figura 4A). Além disso, observe parte do fígado em um único plano da imagem.
   1. Certifique-se de que há pouco ou nenhum artefato de imagem, como sombras e bolhas de ar.
4. Meça uma razão de modo B para obter o índice de RH.
   1. Certifique-se de que tanto o córtex renal quanto o parênquim hepático estão no mesmo plano de foco. Se necessário, ajuste o foco e ganhe controle para obter uma imagem clara.
      1. Ajuste o foco girando o botão Focus no painel de controle. Ajuste o ganho pressionando o botão Auto TGC uma vez.
   2. Pressione a tecla Freeze no painel de controle. Certifique-se de que o animal está entre as respirações ao congelar a tela para evitar imagens embaçadas.
   3. Uma vez que a tela esteja congelada, toque em Ferramentas de Medição na tela de toque. Selecione A relação de modo B, uma ferramenta incorporada que mede o brilho relativo de um tecido de uma região de interesse selecionada. Crie um círculo de 2 mm para selecionar uma região de interesse (ROI). Ajuste o tamanho do círculo movendo um dedo ao longo da borda externa da trackball no painel de controle.
   4. Coloque o círculo de 2 mm na imagem hepática ROI, que deve ser localizado à direita do rim. Identifique o tecido hepático com base em sua ecogenicidade homogênea e contorno liso.
   5. Uma vez que o círculo esteja no lugar, pressione o botão Selecionar no painel de controle e observe o novo círculo que aparece.
   6. Ajuste o tamanho do novo círculo para 2 mm, e coloque-o na imagem do córtex renal. Certifique-se de manter a profundidade dos círculos no fígado e córtex renal o mesmo. Uma vez no lugar, pressione o botão Selecionar no painel de controle. Observe que a ferramenta de sistema incorporada exibe o índice de RH como uma relação de modo B.
   7. Pressione salvar a imagem para salvar a imagem e observe as imagens salvas que aparecem como miniaturas no lado direito do monitor.
   8. Pressione o botão Congelar no painel de controle para descongelar a imagem e retornar a uma imagem ao vivo do modo B.
5. Repita a medição da razão do modo B 3 vezes em diferentes profundidades e planos de tecido. Calcule a média dessas três relações de modo B para cada animal e ponto de tempo.

5. Aquisição de imagem para Elastografia de Ondas de Tesoura

1. Mova a sonda transversalmente na área subcostal direita para localizar o fígado usando o Modo B. Localize uma área do fígado que é principalmente parenchyma e livre de vasos sanguíneos grandes, como a veia portal e artéria hepática. Uma vez encontrada uma área clara do fígado, gere um mapa de elasticidade do tecido pressionando o botão SWE no painel de controle.
2. Ajuste o tamanho e a posição da caixa SWE abaixo da cápsula hepática em uma área livre de sombras. Identifique a cápsula como uma linha ecogênica brilhante perto do topo do fígado.
3. Observe que a caixa SWE transita para um mapa de cores dentro de 5-10 s. Uma vez que a caixa esteja cheia e estável, pressione o botão Congelar no painel de controle quando o animal estiver entre as respirações.
   NOTA: A quantidade mínima de cobertura da caixa deve ser de 60-80% para avaliar com precisão a elasticidade do fígado.
4. Na tela de toque, toque em QBox, uma ferramenta de sistema incorporada que calcula a elasticidade de um ROI no mapa de elasticidade da onda de corte. Observe o círculo e a caixa de dados que aparecem no monitor. Ajuste a posição do QBox tocando no ícone de posição na tela de toque para a configuração desejada.
5. Ajuste o tamanho do círculo para 3 mm movendo um dedo ao longo da borda externa da trackball no painel de controle. Usando o trackball, posicione o círculo em uma área livre de sombra com coloração uniforme(Figura 5A,B). Tome cuidado para evitar áreas conhecidas de rigidez, como vasos sanguíneos ou cápsula hepática, bem como sangrou para baixo dessas estruturas.
6. Quando uma área adequada for encontrada, pressione Salvar imagem no painel de controle para salvar a imagem. Repita este procedimento 3 vezes em diferentes áreas do fígado. Mova a sonda para cima e para baixo ou para os lados no abdômen para coletar imagens mapeadas por SWE de diferentes áreas do fígado.
7. Uma vez que todas as imagens tenham sido coletadas, pressione o Exame final no painel de controle e anote a tela de informações do paciente que aparece no monitor.
8. Retire a fita das patas do animal, limpe o excesso de gel e remova o animal da fase de imagem. Deixe-o se recuperar da anestesia em uma gaiola quente e seca por si só até se recuperar totalmente. Monitore cada animal para garantir a recuperação total da anestesia, indicada por sua capacidade de manter a recumedência severa
9. Repita passos nas seções 4-5 para cada animal da coorte a ser retratado.

6. Recuperação e análise de dados de imagem

1. Quando as imagens de todos os animais tiverem sido coletadas, desligue a anestesia.
2. Para retirar os dados da imagem da máquina, pressione o botão Revisar no painel de controle e observe todas as varreduras realizadas nesse instrumento que aparecem no monitor. Procure as varreduras desejadas usando a janela de pesquisa no canto superior da tela.
3. Selecione todas as varreduras necessárias para análise de dados verificando a caixa ao lado do nome do paciente através do trackball e do botão Selecionar. Uma vez que todas as varreduras necessárias sejam destacadas, selecione Exportar JPEGs na tela de toque. Exportar dados para uma unidade de rede ou uma unidade USB (Universal Serial Bus) portátil. Localize as portas USB na parte de trás do instrumento.
4. Uma vez que os arquivos tenham sido exportados, abra arquivos jpg individuais de cada varredura em um computador de estação de trabalho. Observe todos os dados do lado direito da imagem: B Mode Ratio-collect the B Ratio number; Q Caixa-coletar o valor de elasticidade média (kPa).
5. Insira todos os dados em uma planilha ou outro software de gerenciamento de banco de dados e realize as análises estatísticas desejadas.

7. Análise histológica de amostras hepáticas

1. Ao final da^6ª semana, realizar necropsia em metade da coorte de cada grupo para análise histológica de estudo médio das amostras hepáticas. Da mesma forma, eutanize o resto da coorte de animais, e colete amostras de fígado para análise histológica no ponto de tempo de 12^semanas.
2. Para coloração oro, fixar seções hepáticas em formalina com tampo neutro de 10% e criopreservá-las com sacarose usando uma solução de sacarose refrigerada de 30% durante a noite, no mínimo. Crio-embede as seções em composto de temperatura de corte ideal, e crio-seção-los em slides carregados para se preparar para a coloração ORO.
3. Coloque as crio-seções em 100% propilenoglicol por 2 min seguido de uma incubação noturna em solução oro de 0,5%. Após a remoção da solução ORO, diferencie as seções em 85% de propilenoglicol por 1 min, enxágue em água deionizada e contra-retém com a modificação de Hematoxilina-Lillie de Mayer por 1 min.
   1. Coloque as manchas nos slides usando um meio de montagem aquoso e seque-os à temperatura ambiente.
4. Para PSR, deparaffinize slides de seção hepática fixas, parafinas, coloque-as durante a noite em Bouin Fluid, e depois manche-as usando um colorador de slides automatizado de acordo com o protocolo do fabricante com alguns passos otimizados (1% de ácido fosfomólico para 5 min; 0,1% Sirius Vermelho em ácido picrico saturado por 90 min; 2 x 30 s lavagem em ácido acetástico). Desidrate automaticamente os slides e, em seguida, monte-os com um meio de montagem permanente.
5. Capture imagens dos slides manchados de ORO e PSR usando o scanner de microscopia digital na ampliação de 20x, salve-as em formato .svs e armazene no banco de dados de imagens do gerenciador de slides.
6. Analise as imagens usando algoritmos personalizados criados em software de patologia digital. Aplique uniformemente aplicações de software de patologia digital com parâmetros limiares para identificar e quantificar a área de seções hepáticas, bem como as áreas manchadas de ORO e PSR. Exporte as medidas para uma planilha para cálculos percentuais de área.

8. Análise estatística

1. Realize a análise estatística dos dados de imagem com a ANOVA bidirecional usando o teste de comparações múltiplas de Sidak para avaliar a diferença entre grupos em diferentes momentos. Assuma diferenças significativas entre os grupos para valores de probabilidade p ≤ 0,001. Além disso, realize a correlação das leituras de imagens com análises histológicas.
2. Utilizar estatísticas não paramétricas para analisar os resultados da análise histológica deste estudo. Reporte os valores do grupo como ± faixa semi-interquartil (sIQR). Assuma diferenças significativas entre os grupos para valores de probabilidade p ≤ 0,001. Use um teste Mann-Whitney para comparar a quantidade de PSR e mancha histoquímica ORO entre diferentes grupos.

Resultados

Uma marca registrada dos animais alimentados com CDAHFD é a esteatose. O acúmulo de gordura no fígado altera as propriedades ecogênicas do tecido, que podem ser quantificadas medindo o brilho do fígado e normalizando-o ao brilho do córtex renal a partir de uma imagem do modo B tirada no mesmo plano. O valor quantificado é expresso como um índice de RH, que é uma medida indireta de esteatose. Na Figura 4A,uma imagem hepática representativa de um animal de controle mostra aproximadam...

Discussão

Imagens baseadas em ultrassom, incluindo SWE, podem ser uma ferramenta inestimável para a avaliação longitudinal da esteatose hepática e rigidez em modelos pré-clínicos de NAFLD/NASH. Este artigo descreve metodologias detalhadas sobre como adquirir o modo B de alta qualidade, bem como imagens de SWE de fígados para a medição do índice de RH e elasticidade usando um modelo de rato induzido pela dieta CDAHFD de NASH. Além disso, os resultados mostram excelente correlação do índice de RH e elasticidade com o p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aixplorer	Supersonic Imagine		Shear Wave Elastography Instrument
Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer	Supersonic Imagine		Transducer for Shear Wave Elastography
Alpha-dri bedding			rat cages
Aperio AT2 scanner	Leica Biosystems		Digital Pathology Brightfield Scanner
Compac 6 Anesthesia System	VetEquip		Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however.
Manage Imager Database	Leica Biosystems		Digital Pathology
Mayer's Hematoxilin	Dako/Agilent		H&E Staining/Histology
Nair	Church & Dwight		Hair remover
Oil Red O solution	Poly Scientific		Lipid Staining/Histology
Picrosirius Red Stain (PSR)	Rowley Biochemical	F-357-2	Collagen Stain/Histology
Puralube Opthalmic ointment	Dechra Veterinary Product		Lubrication to prevent eye dryness during anesthesia
Tissue-Tek Prisma Plus	Sakura Finetek USA		Automated slide stainer
VISIOPHARM software	Visiopharm		Digital pathology software
	Research Diets	A06071309i	NASH inducing diet
	Purina	5053	Control animal chow
Vevo imaging station	Fujifilm VisualSonics		The Vevo imaging station is used for holding the ultrasound transducer during imaging.
Wistar Han rats	Charles River Laboratories