Application de l’échographie et de l’imagerie par élastographie par ondes de cisaillement dans un modèle de rat de NAFLD / NASH

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation d’une technique d’échographie améliorée pour observer et quantifier de manière non invasive les changements tissulaires hépatiques dans les modèles de rongeurs de stéatose hépatique non alcoolique.

Résumé

La stéatohépatite non alcoolique (NASH) est une affection du spectre de la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), caractérisée par une accumulation de graisse hépatique (stéatose) et une inflammation conduisant à la fibrose. Les modèles précliniques récapitulant étroitement la NASH humaine / NAFLD sont essentiels au développement de médicaments. Alors que la biopsie du foie est actuellement la norme d’or pour mesurer la progression et le diagnostic de la NAFLD / NASH en clinique, dans l’espace préclinique, la collecte d’échantillons de foie entier à plusieurs moments au cours d’une étude ou la biopsie du foie est nécessaire pour l’analyse histologique afin d’évaluer le stade de la maladie.

La réalisation d’une biopsie du foie à mi-parcours est une procédure invasive et exigeante en main-d’œuvre, et la collecte d’échantillons de foie pour évaluer le niveau de la maladie augmente le nombre d’animaux de recherche nécessaires à une étude. Ainsi, il est nécessaire de mettre en avant un biomarqueur d’imagerie fiable, traduisible et non invasif pour détecter la NASH/NAFLD dans ces modèles précliniques. Les images non invasives en mode B basées sur l’échographie et l’élastographie par ondes de cisaillement (SWE) peuvent être utilisées pour mesurer la stéatose ainsi que la fibrose hépatique. Pour évaluer l’utilité de la SWE dans les modèles précliniques de RONGEURs de la NASH, les animaux ont été soumis à un régime pro-NASH et ont subi une échographie non invasive en mode B et une imagerie par élastographie par ondes de cisaillement pour mesurer l’indice hépatorénal (HR) et l’élasticité du foie, mesurant la progression de l’accumulation de graisse hépatique et de la rigidité tissulaire, respectivement, à plusieurs moments au cours d’une étude NAFLD / NASH donnée.

L’indice HR et les chiffres d’élasticité ont été comparés aux marqueurs histologiques de la stéatose et de la fibrose. Les résultats ont montré une forte corrélation entre l’indice HR et le pourcentage de coloration à l’huile rouge O (ORO), ainsi qu’entre l’élasticité et la coloration du foie par picro-Sirius Red (PSR). La forte corrélation entre les méthodes ex vivo classiques et les résultats de l’imagerie in vivo fournit des preuves que l’élastographie par ondes de cisaillement / imagerie par ultrasons peut être utilisée pour évaluer le phénotype et la progression de la maladie dans un modèle préclinique de NAFLD / NASH.

Introduction

La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est une affection métabolique caractérisée par une accumulation excessive de graisse dans le foie et devient rapidement une maladie hépatique de premier plan dans le monde avec une prévalence mondiale récemment signalée de 25%¹. La stéatohépatite non alcoolique (NASH) est un stade plus avancé du spectre de la NAFLD, caractérisé par un excès de graisse hépatique avec des dommages cellulaires progressifs, une inflammation et une fibrose. Ces affections sont souvent silencieuses, non détectées par des tests sanguins ou des examens de routine, jusqu’à ce que des dommages considérables soient déjà survenus au foie d’un patient. Actuellement, l’étalon-or pour diagnostiquer la NASH chez les patients est l’examen histologique d’échantillons de biopsie hépatique dérivés du patient. De même, les chercheurs précliniques qui travaillent à comprendre la pathogenèse de la NASH / NAFLD ainsi que l’industrie du développement de médicaments s’appuient sur la biopsie en coin in vivo d’échantillons de foie ou l’euthanasie terminale de cohortes satellites pour l’histologie afin de mesurer la stéatose, l’inflammation et la fibrose.

Par exemple, la biopsie en coin hépatique a été une technique standard pour évaluer la stéatohépatite et la fibrose lors de l’utilisation du modèle GUBRA NASH^2. La méthode de biopsie en coin du foie est invasive et laborieuse chez les petits animaux³. L’utilisation de la biopsie du foie en coin au milieu d’une étude représente une variable expérimentale supplémentaire dans un modèle de maladie, ce qui augmente souvent le nombre d’animaux nécessaires. Compte tenu de ces facteurs, les techniques d’imagerie non invasives qui peuvent être utilisées pour évaluer de manière fiable la stéatose et la fibrose dans les modèles animaux NASH / NAFLD à des moments précoces s’avèrent précieuses. L’élastographie par ondes de cisaillement (SWE) est une méthode à base d’ultrasons utilisée pour mesurer l’élasticité des tissus mous. La technique mesure la propagation des ondes de cisaillement créées par des impulsions ultrasonores supersoniques dirigées vers une cible tissulaire, puis calcule une valeur appelée module E^4. La vitesse de l’onde de cisaillement est proportionnelle au degré de rigidité des tissus.

Les figures 1 et 2 montrent la configuration de la zone d’imagerie et l’instrument SWE. L’instrument SWE est une seule unité à roues avec deux écrans et un panneau de commande illustré à la figure 2A. Le moniteur supérieur(Figure 2B)agit comme l’écran de l’ordinateur et affiche les images et les répertoires des patients. Le panneau de commande (Figure 2C) est un ensemble de boutons et de cadrans qui contrôlent les aspects généraux de la capture d’image: gel de l’écran, enregistrement des images, passage d’un mode à un autre. L’écran inférieur(Figure 2D)est un écran tactile avec des commandes supplémentaires pour modifier les paramètres et agit comme un clavier pour saisir des données au besoin. L’instrument est équipé d’un stylet à utiliser sur l’écran tactile si vous le souhaitez. Les sondes à ultrasons se fixent au panneau avant inférieur de l’appareil. Pour l’imagerie en mode B et SWE chez les rongeurs, le transducteur super-linéaire de 6 à 20 MHz a été utilisé. Cette capacité à mesurer de manière non invasive la rigidité tissulaire fait de SWE un outil précieux pour l’identification et la stadification de la fibrose hépatique⁵ chez les patients NASH, réduisant ainsi le besoin de méthodes plus invasives. SWE a, en fait, été utilisé pour mesurer la fibrose hépatique chez les patients et est une méthode approuvée par la FDA pour noter la fibrose dans la clinique⁶. L’utilisation de SWE pour surveiller la progression de la NASH dans les modèles animaux de la maladie fournirait un outil translationnel pour le développement de traitements et améliorerait simultanément le bien-être des animaux grâce à la réduction du nombre de sujets animaux et au raffinement des procédures in vivo pour minimiser la douleur et la détresse.

L’imagerie SWE chez les patients humains utilise un transducteur à ultrasons basse fréquence⁴, ce qui n’est pas idéal pour les petits animaux. Notamment, des techniques SWE à haute fréquence ont été utilisées pour évaluer l’efficacité de l’inhibition de l’acétyl-CoA carboxylase sur la pathogenèse de la NASH dans un modèle de rat^7,et l’utilité de cette technique a été décrite dans des modèles de fibrose hépatique de rat tétrachlorure de carbone avec des résultats positifs par rapport aux méthodes traditionnelles de notation histologique METAVIR⁸. Cependant, la littérature existante manque d’informations détaillées sur la technique et la méthodologie sur l’application de l’imagerie SWE dans les modèles précliniques de la NASH. Comme décrit ci-dessus, la stéatose hépatique est l’une des principales caractéristiques de la nafld / NASH et constitue une étape importante où une intervention peut être envisagée. Ainsi, l’évaluation de l’accumulation de graisse hépatique à l’aide d’une modalité d’imagerie est aussi importante que l’évaluation de la fibrose hépatique dans les modèles précliniques de NASH / NAFLD.

Une technique d’échographie connue sous le nom d’indice HR, un rapport de la luminosité tissulaire du foie par rapport à celle du cortex rénal, a été utilisée comme marqueur de substitution de la stéatose dans la clinique^9,10. Cette approche, cependant, n’a pas été largement utilisée dans les modèles animaux précliniques de NAFLD/NASH. Cet article décrit une méthode de mesure de l’élasticité ainsi que l’indice HR en tant que marqueur de substitution de la fibrose hépatique et de la stéatose, respectivement, dans un modèle de rat NAFLD / NASH déficient en choline et riche en graisses (CDAHFD). Ce modèle induit une stéatose rapide, une inflammation du foie et une fibrose, ce qui est mesurable dans les 6 semaines chez la souris¹¹. Il a été démontré que l’ajout de cholestérol (1%) à ce régime favorise la fibrogenèse chez le rat^12,faisant de ce modèle un candidat approprié pour les études de validation impliquant l’imagerie par ondes de cisaillement. Dans l’ensemble, cette technologie d’imagerie peut également être appliquée à un large éventail de modèles / régimes NASH où la stéatose et / ou la fibrose est un critère d’intérêt.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de Pfizer et menées dans un établissement accrédité AAALAC (Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) International.

1. Induction de la maladie

1. Utilisez des rats Han Wister mâles (150-175 g; ~ 6-7 semaines; total 40 rats) qui sont exempts d’agents pathogènes adventitiels connus pour rats. Hébergez les rats par paires dans une cage ventilée individuellement avec de la litière en papier (voir le tableau des matériaux)et maintenez-les à 22 ± 1 ° C, 40-70% d’humidité relative avec un cycle lumière-obscurité de 12:12 h.
2. Placez les rats pesant de 150 à 175 g (~ 6-7 semaines) sur un régime riche en choline et riche en graisses avec 1% de cholestérol (n = 20) ou un chow de rongeur de laboratoire standard (n = 20) selon la conception de l’étude.
   NOTE: Dans cette étude, un total de 40 rats ont été recrutés avec 20 animaux par groupe. À la fin de la 6^e semaine, la moitié de la cohorte de chaque groupe a été nécropsiée pour une analyse histologique à mi-étude des échantillons de foie. Ainsi, la taille de l’échantillon était de 10 animaux par groupe pour les points de temps^{de la 9e} et de^{la 12e} semaine.

2. Configuration de l’instrument

1. Configurez la zone d’imagerie comme suit : inclure une surface chauffée pour garder l’animal au chaud pendant l’imagerie (c sur la figure 1)et un cône nasal d’anesthésie sécurisé pour délivrer une anesthésie par inhalation afin de maintenir un plan d’anesthésie tout au long de la procédure (b sur la figure 1).
2. Utilisez un porte-sonde à ultrasons pour faciliter le déplacement de la sonde à ultrasons à l’endroit souhaité et pour empêcher la sonde de reposer sur l’animal.
   1. Utilisez un gel à ultrasons réchauffé sur la peau où l’image échographique est acquise.
   2. Maintenez les paramètres suivants tout au long de la procédure, qui peuvent être ajustés sur l’écran tactile: Puissance acoustique 0,0 dB; Accordeur tissulaire 1540 m/s; Plage dynamique 60 dB; Plage d’élasticité (pour le mode SWE) < 30 kPa.
3. Fixez la sonde à ultrasons au système de rail dans le support spécialisé (a dans la figure 1).
4. Allumez l’instrument et laissez-le démarrer. Une fois le moniteur allumé, notez l’image du mode B avec les détails du transducteur connecté.

3. Préparation du sujet

1. Assurez-vous que les animaux sont à jeun au moins 4 heures avant la procédure d’imagerie pour éviter que le contenu intestinal n’interfère avec l’acquisition d’images.
   1. Après au moins 4 heures de jeûne, placer un rat dans une chambre d’induction anesthésique isoflurane jusqu’à ce qu’un niveau approprié d’anesthésie soit atteint, confirmé par aucune réponse au pincement des orteils. Exposez les animaux à 3-5% d’isoflurane pendant 3-5 min pour induire une anesthésie.
   2. Pour l’anesthésie d’entretien, gardez les animaux sous 2-3% d’isoflurane pendant l’acquisition de l’image. Appliquez une pommade ophtalmique pour protéger l’œil du dessèchement pendant l’anesthésie.
2. Une fois l’anesthésie réalisée, retirez un animal de la chambre d’induction et placez-le sur une couverture de circulation d’eau chaude chaude. Placez un cône de nez anesthésique sur le museau et rasez l’animal sur son côté droit, de la cage thoracique au bassin. Utilisez une crème d’épilation chimique pour enlever tous les poils restants dans cette zone.
3. Une fois les poils enlevés, placez un animal en position couchée latérale gauche avec les pattes supérieures scotchées au-dessus de la tête sur une plate-forme d’imagerie chaude(Figure 3A).
4. Appuyez sur la touche Patient du panneau de commande de l’instrument et identifiez le sujet en fonction de la conception de l’étude.
   1. Ouvrez la fonction Clavier de l’instrument en appuyant sur l’icône sur l’écran tactile. Tapez les noms comme vous le souhaitez.
   2. Appuyez sur Quitter pour quitter l’écran du nom du patient. Observez que le mode B se rouvre sur le moniteur.

4. Acquisition d’images pour la mesure de l’indice hépato-rénal (HR)

1. Appliquez une petite quantité de gel à ultrasons réchauffé sur la région de la peau épilée sur l’animal.
2. Déplacez la sonde à ultrasons pour toucher la zone recouverte de gel du sujet (Figure 3B). Une fois qu’une image en direct en mode B des organes internes du sujet apparaît sur le moniteur, déplacez la sonde à ultrasons vers la zone légèrement au-dessus de la hanche, juste parallèle aux vertèbres lombaires (plan sagittal).
3. À l’aide de l’affichage en mode B sur le moniteur, localisez le rein droit en identifiant la grande artère rénale et la séparation cortex/moelle épinière (Figure 4A). De plus, observez une partie du foie dans un seul plan de l’image.
   1. Assurez-vous qu’il y a peu ou pas d’artefacts d’image tels que des ombres et des bulles d’air.
4. Mesurez un rapport de mode B pour obtenir l’indice HR.
   1. Assurez-vous que le cortex rénal et le parenchyme hépatique sont dans le même plan de focalisation. Si nécessaire, ajustez la mise au point et prenez le contrôle pour obtenir une image claire.
      1. Réglez la mise au point en tournant le bouton De mise au point du panneau de commande. Ajustez le gain en appuyant une fois sur le bouton Auto TGC.
   2. Appuyez sur la touche Freeze du panneau de commande. Assurez-vous que l’animal est entre les respirations lorsque vous gelez l’écran pour éviter les images floues.
   3. Une fois l’écran figé, appuyez sur Outils de mesure sur l’écran tactile. Sélectionnez Rapport en mode B, un outil intégré qui mesure la luminosité relative d’un tissu à partir d’une région d’intérêt sélectionnée. Créez un cercle de 2 mm pour sélectionner une région d’intérêt (ROI). Ajustez la taille du cercle en déplaçant un doigt le long du bord extérieur du trackball sur le panneau de commande.
   4. Placez le cercle de 2 mm sur le ROI de l’image hépatique, qui doit être situé à droite du rein. Identifier le tissu hépatique en fonction de son échogénicité homogène et de son contour lisse.
   5. Une fois le cercle en place, appuyez sur le bouton Sélectionner du panneau de commande et observez le nouveau cercle qui apparaît.
   6. Ajustez la taille du nouveau cercle à 2 mm et placez-le sur l’image du cortex rénal. Assurez-vous de garder la même profondeur des cercles sur le foie et le cortex rénal. Une fois en place, appuyez sur le bouton Select du panneau de commande. Observez que l’outil système intégré affiche l’indice HR sous la forme d’un rapport en mode B.
   7. Appuyez sur Enregistrer l’image pour enregistrer l’image et observez les images enregistrées qui apparaissent sous forme de vignettes sur le côté droit du moniteur.
   8. Appuyez sur le bouton Figer du panneau de configuration pour dégeler l’image et revenir à une image en mode B en direct.
5. Répétez la mesure du rapport du mode B 3 fois à différentes profondeurs et plans de tissu. Calculez la moyenne de ces trois rapports en mode B pour chaque animal et point temporel.

5. Acquisition d’images pour l’élastographie par ondes de cisaillement

1. Déplacez la sonde transversalement dans la zone sous-costale droite pour localiser le foie en utilisant le mode B. Localisez une zone du foie qui est principalement un parenchyme et exempte de gros vaisseaux sanguins tels que la veine porte et l’artère hépatique. Une fois qu’une zone claire du foie a été trouvée, générez une carte d’élasticité de cisaillement du tissu en appuyant sur le bouton SWE du panneau de commande.
2. Ajustez la taille et la position de la boîte SWE sous la capsule hépatique dans une zone exempte d’ombres. Identifiez la capsule comme une ligne échogène brillante près du sommet du foie.
3. Observez que la boîte SWE passe à une carte couleur dans un délai de 5 à 10 s. Une fois que la boîte est pleine et stable, appuyez sur le bouton Congeler sur le panneau de commande lorsque l’animal est entre deux respirations.
   REMARQUE: La quantité minimale de couverture de la boîte devrait être de 60-80% pour évaluer avec précision l’élasticité du foie.
4. Sur l’écran tactile, appuyez sur QBox, un outil système intégré qui calcule l’élasticité à partir d’un retour sur investissement sur la carte d’élasticité des ondes de cisaillement. Observez le cercle et la zone de données qui apparaissent sur le moniteur. Ajustez la position du QBox en appuyant sur l’icône de position sur l’écran tactile à la configuration souhaitée.
5. Ajustez la taille du cercle à 3 mm en déplaçant un doigt le long du bord extérieur de la trackball sur le panneau de commande. À l’aide du trackball, positionnez le cercle dans une zone exempte d’ombre avec une coloration uniforme (Figure 5A, B). Prenez soin d’éviter les zones connues de raideur telles que les vaisseaux sanguins ou la capsule hépatique, ainsi que les saignements de ces structures.
6. Lorsqu’une zone adéquate est trouvée, appuyez sur Enregistrer l’image sur le panneau de configuration pour enregistrer l’image. Répétez cette procédure 3 fois dans différentes zones du foie. Déplacez la sonde de haut en bas ou latéralement sur l’abdomen pour recueillir des images cartographiées SWE de différentes zones du foie.
7. Une fois que toutes les images ont été collectées, appuyez sur End Exam sur le panneau de commande et notez l’écran d’information du patient qui apparaît sur le moniteur.
8. Retirez le ruban adhésif des pattes de l’animal, essuyez l’excès de gel et retirez l’animal de l’étape d’imagerie. Laissez-le récupérer de l’anesthésie dans une cage chaude et sèche par lui-même jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli. Surveiller chaque animal pour assurer un rétablissement complet de l’anesthésie, indiqué par sa capacité à maintenir le repose-sternal
9. Répétez les étapes des sections 4 à 5 pour chaque animal de la cohorte à imager.

6. Récupération et analyse des données d’image

1. Lorsque des images pour tous les animaux ont été recueillies, désactivez l’anesthésie.
2. Pour extraire les données d’image de la machine, appuyez sur le bouton Révision du panneau de commande et observez toutes les numérisations effectuées sur cet instrument qui apparaissent sur le moniteur. Recherchez les scans souhaités à l’aide de la fenêtre de recherche dans le coin supérieur de l’écran.
3. Sélectionnez toutes les analyses nécessaires à l’analyse des données en cochant la case à côté du nom du patient via le trackball et le bouton Sélectionner. Une fois que toutes les analyses nécessaires sont mises en surbrillance, sélectionnez Exporter les fichiers JPEG sur l’écran tactile. Exportez les données vers un lecteur réseau ou un lecteur USB (Universal Serial Bus) portable. Localisez les ports USB à l’arrière de l’instrument.
4. Une fois les fichiers exportés, ouvrez les fichiers jpg individuels de chaque analyse sur un poste de travail. Observez toutes les données sur le côté droit de l’image: Rapport du mode B - collectez le numéro du rapport B; Q Box-collectez la valeur de l’élasticité moyenne (kPa).
5. Entrez toutes les données dans une feuille de calcul ou un autre logiciel de gestion de base de données et effectuez les analyses statistiques souhaitées.

7. Analyse histologique d’échantillons de foie

1. À la fin de la 6^e semaine, effectuer une autopsie sur la moitié de la cohorte de chaque groupe pour une analyse histologique à mi-étude des échantillons de foie. De même, euthanasier le reste de la cohorte d’animaux et prélever des échantillons de foie pour analyse histologique à la 12e semaine.
2. Pour la coloration ORO, fixez les sections de foie dans du for formel tamponné à 10% neutre et cryoconservez-les avec du saccharose à l’aide d’une solution réfrigérée de saccharose à 30% pendant la nuit au minimum. Cryo-intégrer les sections dans un composé à température de coupe optimale et les cryo-section sur des lames chargées pour les préparer à la coloration ORO.
3. Placer les cryo-sections dans du propylène glycol à 100% pendant 2 min, suivi d’une incubation de nuit dans une solution ORO à 0,5%. Après retrait de la solution ORO, différencier les sections dans du propylène glycol à 85% pendant 1 min, rincer à l’eau désionisée et contre-tacher avec la modification de Mayer Hematoxylin-Lillie pendant 1 min.
   1. Placez les couvercles sur les glissières à l’aide d’un support de montage aqueux et séchez-les à température ambiante.
4. Pour le PSR, déparaffinez les lames de section hépatique fixées au formol et incorporées à la paraffine, placez-les pendant la nuit dans Bouin Fluid, puis colorez-les à l’aide d’un colorant à glissière automatisé selon le protocole du fabricant avec quelques étapes optimisées (1% d’acide phosphomolybdique pendant 5 min; 0,1% de Sirius Red dans de l’acide picrique saturé pendant 90 min; 2 x 30 s laver dans 0,5% d’acide acétique). Déshydratez automatiquement les glissières, puis montez-les avec un support de montage permanent.
5. Capturez des images des diapositives colorées ORO et PSR à l’aide du scanner de microscopie numérique à un grossissement de 20x, enregistrez-les au format .svs et stockez-les dans la base de données d’images du gestionnaire de diapositives.
6. Analysez les images à l’aide d’algorithmes personnalisés créés dans un logiciel de pathologie numérique. Appliquer uniformément des applications logicielles de pathologie numérique avec des paramètres de seuil pour identifier et quantifier la zone des sections hépatiques ainsi que les zones colorées ORO et PSR. Exportez les mesures dans une feuille de calcul pour les calculs de pourcentage de surface.

8. Analyse statistique

1. Effectuer une analyse statistique des données d’imagerie avec une ANOVA bidirectionnelle à l’aide du test de comparaisons multiples de Sidak pour évaluer la différence entre les groupes à différents moments. Supposons des différences significatives entre les groupes pour les valeurs de probabilité p ≤ 0,001. En outre, effectuez une corrélation des lectures d’imagerie avec des analyses histologiques.
2. Utilisez des statistiques non paramétriques pour analyser les résultats de l’analyse histologique de cette étude. Indiquez les valeurs du groupe comme médianes ± plage semi-interquartile (sIQR). Supposons des différences significatives entre les groupes pour les valeurs de probabilité p ≤ 0,001. Utilisez un test de Mann-Whitney pour comparer la quantité de coloration histochimique PSR et ORO entre différents groupes.

Résultats

L’une des caractéristiques des animaux nourris au CDAHFD est la stéatose. L’accumulation de graisse dans le foie modifie les propriétés échogènes du tissu, qui peuvent être quantifiées en mesurant la luminosité du foie et en la normalisant à la luminosité du cortex rénal à partir d’une image en mode B prise dans le même plan. La valeur quantifiée est exprimée sous la forme d’un indice HR, qui est une mesure indirecte de la stéatose. Dans la figure 4A,une image repré...

Discussion

L’imagerie par ultrasons, y compris SWE, peut être un outil inestimable pour l’évaluation longitudinale de la stéatose et de la rigidité du foie dans les modèles précliniques de NAFLD / NASH. Cet article décrit des méthodologies détaillées sur la façon d’acquérir le mode B de haute qualité ainsi que des images SWE du foie pour la mesure de l’indice HR et de l’élasticité à l’aide d’un modèle de NASH induit par le régime CDAHFD. En outre, les résultats montrent une excellente corrélation d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aixplorer	Supersonic Imagine		Shear Wave Elastography Instrument
Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer	Supersonic Imagine		Transducer for Shear Wave Elastography
Alpha-dri bedding			rat cages
Aperio AT2 scanner	Leica Biosystems		Digital Pathology Brightfield Scanner
Compac 6 Anesthesia System	VetEquip		Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however.
Manage Imager Database	Leica Biosystems		Digital Pathology
Mayer's Hematoxilin	Dako/Agilent		H&E Staining/Histology
Nair	Church & Dwight		Hair remover
Oil Red O solution	Poly Scientific		Lipid Staining/Histology
Picrosirius Red Stain (PSR)	Rowley Biochemical	F-357-2	Collagen Stain/Histology
Puralube Opthalmic ointment	Dechra Veterinary Product		Lubrication to prevent eye dryness during anesthesia
Tissue-Tek Prisma Plus	Sakura Finetek USA		Automated slide stainer
VISIOPHARM software	Visiopharm		Digital pathology software
	Research Diets	A06071309i	NASH inducing diet
	Purina	5053	Control animal chow
Vevo imaging station	Fujifilm VisualSonics		The Vevo imaging station is used for holding the ultrasound transducer during imaging.
Wistar Han rats	Charles River Laboratories