从诱导多能干细胞生成3D全肺类器官，用于模拟肺发育生物学和疾病

摘要

本文描述了诱导多能干细胞与含有近端和远端上皮肺细胞以及间充质的三维全肺类器官的逐步定向分化。

摘要

由于缺乏生物学相关的 体外 模型系统，人类肺部发育和疾病一直难以研究。人类诱导多能干细胞（hiPSCs）可以逐步分化成3D多细胞肺类器官，由上皮细胞群和间充质细胞群组成。我们通过暂时引入各种生长因子和小分子来概括胚胎发育线索，以有效地产生明确的内胚层，前颈内胚层，以及随后的肺祖细胞。然后将这些细胞嵌入生长因子减少（GFR）基底膜基质培养基中，使它们能够响应外部生长因子自发发育成3D肺类器官。这些全肺类器官（WLO）在暴露于地塞米松，环AMP和异丁基黄嘌呤后经历早期肺部发育阶段，包括分支形态发生和成熟。WLO具有表达标志物KRT5（基底），SCGB3A2（俱乐部）和MUC5AC（杯）的气道上皮细胞以及表达HOPX（肺泡I型）和SP-C（肺泡II型）的肺泡上皮细胞。还存在间充质细胞，包括平滑肌肌动蛋白（SMA）和血小板衍生的生长因子受体A（PDGFRα）。iPSC衍生的WLO可以在3D培养条件下维持数月，并且可以分类为表面标记物以纯化特定的细胞群。iPSC衍生的WLO也可用于研究人肺发育，包括肺上皮和间充质之间的信号传导，模拟人肺细胞功能和发育的基因突变，并确定感染因子的细胞毒性。

引言

肺是一个复杂的、异质的、动态的器官，在六个不同的阶段发育 - 胚胎期、假性腺体、小管性、囊状、肺泡和微血管成熟^1，2。后两个阶段发生在人类发育的前后阶段，而前四个阶段只发生在胎儿发育过程中，除非发生早产³。胚胎期从内胚层开始，以气管和肺芽的萌芽结束。肺部发育部分通过上皮细胞和间充质细胞之间的信号传导^发生4。这些相互作用导致肺分支，增殖，细胞命运决定和发育中肺的细胞分化。肺分为传导区（气管到末端细支气管）和呼吸区（呼吸道细支气管到肺泡）。每个区域包含独特的上皮细胞类型;包括传导气道中的基底细胞、分泌细胞、纤毛细胞、刷状细胞、神经内分泌细胞和离子细胞⁵，其次是呼吸道上皮中的肺泡 I 型和 II 型细胞⁶。关于各种细胞类型的发育和对损伤的反应，还有很多未知数。iPSC衍生的肺类器官模型能够研究驱动人类肺部发育的机制，基因突变对肺功能的影响，以及上皮和间充质对感染因子的反应，而无需原发性人体肺组织。

与胚胎分化各个阶段相对应的标志物包括用于确定性内胚层 （DE）7 的 CXCR4、cKit、FOXA2 和 SOX17、用于前前肠内胚层 （AFE）⁸ 的 FOXA2、TBX1 和 SOX2，以及用于早期肺祖细胞的 NKX2-19。在胚胎肺发育中，前肠分为背食道和腹侧气管。右肺和左肺的芽表现为气管芽周围的两个独立的外垂¹⁰。在分支形态发生过程中，上皮周围的间充质产生弹性组织、平滑肌、软骨和脉管系统¹¹。上皮和间充质之间的相互作用对于正常的肺部发育至关重要。这包括间充质分泌的^FGF1012和上皮产生的^SHH13。

在这里，我们描述了一种将hiPSCs定向分化为三维（3D）全肺类器官（WLO）的方案。虽然有类似的方法通过LPC阶段的分选分离肺祖细胞，以制造肺泡样^14，15 （远端）类器官或气道¹⁶ （近端）类器官，或产生腹侧前肠球状体，使人肺类器官表达肺泡细胞和间充质标志物以及芽尖祖器官¹⁷，这种方法的优势在于包括肺上皮细胞和间充质细胞类型，以在 体外模式和协调肺分支形态发生，成熟和扩增。

该协议使用小分子和生长因子来指导多能干细胞通过确定性内胚层，前叶内胚层和肺祖细胞的分化。然后，这些细胞通过重要的发育步骤（包括分支和成熟）被诱导成3D全肺类器官。分化方案的摘要如图 1a 所示，内胚层和类器官分化的代表性明场图像如图 1b所示。 图1c、d 显示了完成分化后内胚层分化的基因表达细节以及肺上皮细胞近端和远端群体的基因表达。

研究方案

该研究方案由UCSD人类研究保护计划机构审查委员会批准（181180）。

1. 诱导多能干细胞的确定性内胚层诱导（第1-3天）

1. 使用前30分钟在冰上缓慢解冻生长因子减少（GFR）基底膜（BM）基质培养基。在冷的DMEM/F12混合物中，以1∶1的比例稀释GFR BM基质培养基，使其构成该培养基的50%。使用前将 P1000 移液器吸头放入冰箱中冷藏。
2. 用在冰冷的DMEM / F12中制备的500μL50%GFR基底膜基质培养基体涂覆12孔板的每个孔。一旦涂覆了所需数量的孔，从孔中除去任何多余的介质混合物和/或气泡，并将板放在4°C的冰或冰箱上20分钟以凝固。然后，将板移至37°C的培养箱过夜以凝胶并干燥。
3. 一旦hiPSCs达到70-90%汇合度，在解离前一小时加入10μMRho相关激酶（ROCK）抑制剂Y-27632。吸出培养基，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤一次。通过加入细胞分离培养基（0.5 mL /孔的12孔板）解离hiPSCs，并在5%CO 2培养箱中在37°C下孵育₂₀ 分钟。
4. 从培养箱中取出板，将0.5mL / 12孔的干细胞传代培养基（表1）加入孔中;使用P1000尖端轻轻研磨细胞以获得单细胞悬浮液。将解离的细胞转移到15mL锥形离心管中;在300× g下离心5分钟。
5. 吸出培养基并用1mL mTeSR Plus培养基重悬细胞沉淀，并补充10μM ROCK抑制剂（Y-27632）。执行细胞计数。在1 mL mTeSR中加入2.0 x ¹⁰⁵ hiPSCs，每孔12孔GFR基底膜介质包衣板中补充ROCK抑制剂Y-27632。在37°C孵育过夜。
   注意:必须为每个细胞系优化细胞接种数量。电镀24小时后，孔应汇合50%-70%。
6. 在第1天，吸出mTeSR Plus并加入确定性内胚层（DE）诱导培养基（表1），并补充100ng / mL人激活素A和5μMGSK3β抑制剂/ Wnt激活剂CHIR99021。
   注意:具有GSK3β抑制剂/ Wnt激活剂CHIR99021的DE培养基应在DE诱导第1天的20-24小时内取出，以成功分化。
7. 在第 2 天和第 3 天，换用仅补充 100 ng/mL 的激活素 A 的 DE 诱导培养基。
   注意:DE分化不应超过72小时，否则疗效会降低。在第4天，如果观察到大细胞死亡，则将总DE培养基暴露时间减少6-12小时。
8. 为了分析DE效率，通过流式细胞术或FOXA2和/或SOX17的免疫荧光分析确认大于90%的CXCR4和/或cKit表达（图2a）。

2. 前肠前内胚层 （AFE） 诱导 （第 4 - 6 天）

1. 在第4天，将培养基换成血清游离基础培养基（SFBM）（表1），补充10μM SB431542和2μM背吗啡用于AFE诱导。每天更换AFE介质3天（第4天，第5天和第6天）。
2. 为了分析AFE效率，通过免疫荧光染色确认SOX2，TBX1和FOXA2的稳健表达（图2b）。

3. 肺祖细胞（LPC）分化（第7-16天）

1. 第7天，在冰上解冻GFR基底膜基质培养基。吸出AFE培养基，用1x PBS清洗干净。加入1mL细胞分离溶液，并在37°C下孵育10分钟。
2. 将1mL淬火培养基（DMEM / F12中的2%FBS）加入含有细胞分离溶液的孔中。通过轻轻上下移液将细胞保持为聚集体。确保所有细胞被移位并转移到15mL锥形离心管中。在300× g下离心5分钟。
3. 除去上清液并将细胞沉淀重悬于补充有10ng / mL人重组骨形态蛋白-4（BMP4），0.1μM全反式视黄酸（RA），3μMGSK3β抑制剂/ Wnt激活剂CHIR99021和10μM岩石抑制剂Y-27632的淬火培养基中。
4. 执行细胞计数。将2.5×¹⁰⁵ 个细胞加入100μL冷GFR基底膜基质培养基中，充分混合，并将液滴放入12孔板的孔中。将板在37°C下孵育30-60分钟，以使培养基聚合。每孔加入1 mL LPC培养基，并补充10μM的ROCK抑制剂Y-27632，确保培养基滴完全浸没并在37°C下孵育过夜。
5. 在LPC诱导后第8天24小时，更换LPC培养基以除去ROCK抑制剂Y-27632。每隔一天更换一次 LPC 介质，总共 9-11 天。
   注意:如果培养基在24小时内变黄，请每天更换培养基。
6. 为了分析LPC效率，确认细胞内转录因子NKX2-1的稳健表达或对表面标志物^CD47hi / CD26low15或^CPM18进行流式细胞术（图2c）。总的来说，LPC球体应该是圆形和透明的（图2c）。
   注意:如果NKX2-1的效率低于30%，则不要进行肺类器官分化。

4.3D肺类器官诱导（第16-22天）

1. 在第17天，在冰上解冻GFR基底膜基质介质。吸出LPC诱导培养基。然后向孔中加入2μg/ mL的分散酶（1mL），并用P1000移液器重悬培养基/分离酶混合物。在37°C孵育15分钟。再次研磨混合物并在37°C下再孵育15分钟。
2. 将分散酶和细胞转移到15mL锥形离心管中。使用冷却的PBS（2-3 mL）洗涤孔并重悬分散酶/细胞混合物。在400× g下离心5分钟。手动除去上清液，注意不要对培养基/细胞沉淀层进行消毒。重复冷却的PBS洗涤，并在400× g下离心锥形离心管再离心5分钟。
3. 手动除去上清液，然后将2mL胰蛋白酶基解离溶液加入锥形离心管中。在37°C孵育12分钟。
4. 孵育后，用P1000移液器吸头重悬细胞。然后将等体积的淬火介质加入锥形离心管中，并以400× g 向下旋转5分钟。吸出上清液并将细胞重悬于淬灭培养基+ 10μM的ROCK抑制剂Y-27632中。
   注意:当细胞作为聚集体而不是单个细胞嵌入时，会发生成功的肺类器官诱导，相应地调整移液。
5. 执行细胞计数。计算获得每孔5.0-8.0 x ¹⁰⁴ 个细胞所需的体积。将LPC细胞等分到1.5mL微量离心管中，并在400× g下离心5分钟。除去多余的上清液，注意不要搅动细胞沉淀。仅留下10μL残留培养基。
6. 将细胞沉淀重新悬浮在200μL冷GFR基底膜基质培养基质培养基中，并加入细胞培养膜插入物（直径6.5mm，0.4μm孔，聚酯膜）。将板在37°C孵育30-60分钟，以使GFR基底膜基质介质聚合。
7. 将1mL补充成纤维细胞生长因子-7（FGF7）（10ng / mL），FGF10（10ng / mL），GSK3β抑制剂/ Wnt激活剂CHIR（3μM），表皮生长因子（EGF）（10ng / mL）和10μMROCK抑制剂Y-27632的3D类器官诱导培养基（表1）加入膜插入物的基底外侧腔。每隔一天更换一次培养基，持续 6 天。

5.3D 肺类器官分支（第23-28天）

1. 在第23天，换用补充FGF7（10 ng / mL），FGF10（10ng / mL），GSK3β抑制剂/ Wnt激活剂CHIR99021（3μM），RA（0.1μM），EGF（10ng / mL）和血管内皮生长因子（VEGF）/胎盘生长因子（PlGF）（10ng / mL）的3D支化培养基（表1）。每隔一天更换一次培养基，持续 6 天。
   注意:在3D分支分化的第6天，应该有多个分支类器官（图2）。

6.3D肺类器官成熟 （第29- 34天）

1. 在第29天，换用3D成熟培养基（表1），其与3D支化培养基相同，但加入地塞米松（50nM），cAMP（100μM）和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX），磷酸二酯酶抑制剂也称为异丁基黄嘌呤（100μM）。每隔一天更换一次培养基，持续 6 天。
   注意:在3D成熟后24小时内，分支类器官应膨胀并变成透明球体。

7.3D 肺类器官免疫细胞化学

1. 对于3D全肺类器官分析，在4°C下将GFR基底膜基质基质培养基固定在具有4%多聚甲醛（PFA）的膜插入物中1小时。 嵌入石蜡中，并按照标准公布的协议安装到载玻片上。
2. 染色前进行抗原检索。气道标志物包括 KRT5、MUC5AC 和 SCGB3A2。肺泡标志物包括SP-C，SP-B，HTII-280，HTI-56和HOPX（图3）。

8. 从 GFR 基底膜基质培养基中取出全肺类器官，用于传代、FACS 或冷冻保存

1. 要从GFR基底膜基质培养基中解离类器官，请从基底腔中除去培养基，并在顶室中加入2μg/ mL的分散酶（1 mL）。
2. 用P1000移液器轻轻研磨培养基/分离酶混合物，并置于培养箱中15分钟。再次轻轻研磨混合物，再孵育15分钟。
3. 加入1mL冷却的PBS（4°C），并将含有基质培养基的类器官转移到15mL锥形离心管中。以400 x g 旋转5分钟。小心除去上清液，不要干扰细胞沉淀。
4. 用 1 mL 冷藏的 PBS 再次洗涤，然后以 400 x g 离心 5 分钟。小心取出上清液，不要干扰培养基/细胞混合物。
5. 将1mL细胞分离溶液加入锥形离心管中，轻轻研磨重悬GFR-基底膜基质培养基质/细胞混合物。置于培养箱中12分钟，将细胞作为聚集体传代或用于冷冻保存），或20分钟用于单细胞悬浮液。
6. 加入等体积的淬火培养基，以400 x g 离心5分钟。重悬于淬火培养基+ 10μM的ROCK抑制剂Y-27632中。
   注意:在此步骤中，不应在管中看到残留的基底膜介质。如果残留培养基，请重复步骤8.5和8.6。
7. 执行细胞计数。计算下游应用所需的体积。

结果

电镀后24小时，第1天，iPSCs应为50%-90%汇合。在第 2 天，DE 应为 90%-95% 汇合。在DE诱导期间，通常在第4天观察到显着的细胞死亡，但附着的细胞将保留紧凑的鹅卵石形态（图2b）。如果大多数贴壁细胞分离，则停止分化，并考虑将活性素A的DE培养基暴露时间缩短6-12小时。在AFE诱导期间，细胞死亡是最小的，细胞保持贴壁，但会显得更小，更异质。只有当双阳性SOX2和FOXA2的产量>...

讨论

3D全肺类器官（WLO）的成功分化依赖于多步骤，6周的方案，并注重细节，包括暴露于生长因子和小分子的时间，传代后的细胞密度以及hiPSCs的质量。故障排除请参见 表2。hiPSCs 应约为 70%-80% 汇合，解离前自发分化小于 5%。该协议要求"mTeSR+"介质;然而，普通的"mTeSR"培养基也被使用，结果相当，而且价格更便宜。对于细胞外基质，我们使用GFR基底膜基质培养基质。我们使用ReLesR（见

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture
12 well plates	Corning	3512
12-well inserts, 0.4um, translucent	VWR	10769-208
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Accutase	Innovative Cell Tech	AT104
ascorbic acid	Sigma	A4544
B27 without retinoic acid	ThermoFisher	12587010
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution	Gibco	15260-037
Dispase	StemCellTech	7913
DMEM/F12	Gibco	10565042
FBS	Gibco	10082139
Glutamax	Life Technologies	35050061
Ham’s F12	Invitrogen	11765-054
HEPES	Gibco	15630-080
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax	Invitrogen	31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828028
Matrigel	Corning	354230
Monothioglycerol	Sigma	M6145
mTeSR plus Kit (10/case)	Stem Cell Tech	5825
N2	ThermoFisher	17502048
NEAA	Life Technologies	11140050
Pen/strep	Lonza	17-602F
ReleSR	Stem Cell Tech	5872
RPMI1640 + Glutamax	Life Technologies	12633012
TrypLE	Gibco	12605-028
Y-27632 (Rock Inhibitor)	R&D Systems	1254/1
Growth Factors/Small Molecules
Activin A	R&D Systems	338-AC
All-trans retinoic acid (RA)	Sigma-Aldrich	R2625
BMP4	R&D Systems	314-BP/CF
Br-cAMP	Sigma-Aldrich	B5386
CHIR99021	Abcam	ab120890
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dorsomorphin	R&D Systems	3093
EGF	R&D Systems	236-EG
FGF10	R&D Systems	345-FG/CF
FGF7	R&D Systems	251-KG/CF
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)	Sigma-Aldrich	I5879
SB431542	R&D Systems	1614
VEGF/PIGF	R&D Systems	297-VP/CF
Primary antibodies			Dilution rate
CXCR4-PE	R&D Systems	FAB170P	1:200 (F)
HOPX	Santa Cruz Biotech	sc-398703	0.180555556
HTII-280	Terrace Biotech	TB-27AHT2-280	0.145833333
KRT5	Abcam	ab52635	0.180555556
NKX2-1	Abcam	ab76013	0.25
NKX2-1-APC	LS-BIO	LS-C264437	1:1000 (F)
proSPC	Abcam	ab40871	0.215277778
SCGB3A2	Abcam	ab181853	0.25
SOX2	Invitrogen	MA1-014	0.180555556
SOX9	R&D Systems	AF3075	0.180555556
SPB (mature)	7 Hills	48604	1: 1500 (F) 1:500 (W)a
SPC (mature)	LS Bio	LS-B9161	1:100 (F); 1:500 (W) a