Generierung von 3D-Ganzlungenorganoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen zur Modellierung der Lungenentwicklungsbiologie und -krankheit

Zusammenfassung

Der Artikel beschreibt die schrittweise gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zu dreidimensionalen ganzen Lungenorganoiden, die sowohl proximale als auch distale epitheliale Lungenzellen zusammen mit Mesenchym enthalten.

Zusammenfassung

Die Entwicklung und Erkrankung der menschlichen Lunge war aufgrund des Mangels an biologisch relevanten In-vitro-Modellsystemen schwer zu untersuchen. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPS-Zellen) können schrittweise in mehrzellige 3D-Lungenorganoide differenziert werden, die sowohl aus epithelialen als auch aus mesenchymalen Zellpopulationen bestehen. Wir rekapitulieren embryonale Entwicklungssignale, indem wir zeitlich eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen einführen, um effizient definitive Endoderm-, anteriore Vorderdarm-Endoderm- und anschließend Lungen-Vorläuferzellen zu erzeugen. Diese Zellen werden dann in ein wachstumsfaktorreduziertes (GFR)-Basalmembranmatrixmedium eingebettet, so dass sie sich als Reaktion auf externe Wachstumsfaktoren spontan zu 3D-Lungenorganoiden entwickeln können. Diese ganzen Lungenorganoide (WLO) durchlaufen frühe Entwicklungsstadien der Lunge, einschließlich verzweigter Morphogenese und Reifung nach Exposition gegenüber Dexamethason, zyklischem AMP und Isobutylxanthin. WLOs besitzen Atemwegsepithelzellen, die die Marker KRT5 (basal), SCGB3A2 (Club) und MUC5AC (Kelch) exprimieren, sowie alveoläre Epithelzellen, die HOPX (alveolarer Typ I) und SP-C (alveolarer Typ II) exprimieren. Mesenchymalzellen sind ebenfalls vorhanden, einschließlich Aktin der glatten Muskulatur (SMA) und des von Thrombozyten abgeleiteten Wachstumsfaktorrezeptors A (PDGFRα). iPSC-abgeleitete WLOs können unter 3D-Kulturbedingungen für viele Monate aufbewahrt und nach Oberflächenmarkern sortiert werden, um eine bestimmte Zellpopulation zu reinigen. iPSC-abgeleitete WLOs können auch verwendet werden, um die menschliche Lungenentwicklung zu untersuchen, einschließlich der Signalübertragung zwischen dem Lungenepithel und dem Mesenchym, um genetische Mutationen auf die Funktion und Entwicklung menschlicher Lungenzellen zu modellieren und die Zytotoxizität von Infektionserregern zu bestimmen.

Einleitung

Die Lunge ist ein kompliziertes, heterogenes, dynamisches Organ, das sich in sechs verschiedenen Stadien entwickelt - embryonaler, pseudoglandulärer, kanalikulärer, sackulärer, alveolärer und mikrovaskulärer ^Reifung1,2. Die beiden letztgenannten Phasen treten prä- und postnatal in der menschlichen Entwicklung auf, während die ersten vier Phasen ausschließlich während der fetalen Entwicklung auftreten, es sei denn, es tritt eine Frühgeburt ^auf3. Die embryonale Phase beginnt in der endodermalen Keimschicht und endet mit dem Austrieb der Luftröhre und der Lungenknospen. Die Lungenentwicklung erfolgt zum Teil über die Signalübertragung zwischen den Epithel- und Mesenchymzellen4. Diese Wechselwirkungen führen zu Lungenverzweigung, Proliferation, Bestimmung des zellulären Schicksals und zellulärer Differenzierung der sich entwickelnden Lunge. Die Lunge ist in leitende Zonen (Luftröhre zu den terminalen Bronchiolen) und Atemzonen (respiratorische Bronchiolen zu den Alveolen) unterteilt. Jede Zone enthält einzigartige Epithelzelltypen; einschließlich basaler, sekretorischer, flimmerförmiger, Bürsten-, neuroendokriner und Ionozytenzellen im leitenden ^Atemweg5, gefolgt von alveolären Typ-I- und -II-Zellen im respiratorischen ^Epithel6. Über die Entstehung und Reaktion auf Verletzungen der verschiedenen Zelltypen ist noch viel unbekannt. iPSC-abgeleitete Lungenorganoidmodelle ermöglichen die Untersuchung von Mechanismen, die die Entwicklung der menschlichen Lunge vorantreiben, der Auswirkungen genetischer Mutationen auf die Lungenfunktion und der Reaktion sowohl des Epithels als auch des Mesenchyms auf Infektionserreger, ohne dass primäres menschliches Lungengewebe erforderlich ist.

Zu den Markern, die den verschiedenen Stadien der embryonalen Differenzierung entsprechen, gehören CXCR4, cKit, FOXA2 und SOX17 für das definitive Endoderm (DE)⁷, FOXA2, TBX1 und SOX2 für das vordere Vorderdarmendoderm (AFE)⁸ und NKX2-1 für frühe Lungenvorläuferzellen9. Bei der embryonalen Lungenentwicklung teilt sich der Vorderdarm in die dorsale Speiseröhre und die ventrale Luftröhre. Die Knospen der rechten und linken Lunge erscheinen als zwei unabhängige Ausscheidungen um die Trachealknospe10. Während der Verzweigung der Morphogenese produziert das Mesenchym, das das Epithel umgibt, elastisches Gewebe, glatte Muskulatur, Knorpel und ^{Gefäßkulatur11}. Die Wechselwirkung zwischen Epithel und Mesenchym ist essentiell für eine normale Lungenentwicklung. Dazu gehört die Sekretion von ^FGF1012 durch das Mesenchym und ^SHH13, das vom Epithel produziert wird.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gerichteten Differenzierung von hiPS-Zellen in dreidimensionale (3D) ganze Lungenorganoide (WLO). Während es ähnliche Ansätze gibt, die die Isolierung von Lungenvorläuferzellen durch Sortierung im LPC-Stadium beinhalten, um alveolär-ähnliche ^14,15 (distale) Organoide oder ^Atemwege16 (proximale) Organoide herzustellen oder ventral-anteriore Vorderdarm-Sphäroide zu erzeugen, um menschliche Lungenorganoide herzustellen, die alveoläre Zell- und mesenchymale Marker und Knospenspitzen-Vorläuferorganoide ^{exprimieren17} Die Stärke dieser Methode ist die Einbeziehung sowohl von Lungenepithel- als auch von mesenchymalen Zelltypen, um die Morphogenese, Reifung und Expansion der Lunge in vitro zu strukturieren und zu orchestrieren.

Dieses Protokoll verwendet kleine Moleküle und Wachstumsfaktoren, um die Differenzierung pluripotenter Stammzellen durch definitive Endoderm-, vordere Vorderdarm-Endoderm- und Lungenvorläuferzellen zu steuern. Diese Zellen werden dann durch wichtige Entwicklungsschritte, einschließlich Verzweigung und Reifung, in 3D-Ganze Lungenorganoide induziert. Die Zusammenfassung des Differenzierungsprotokolls ist in Abbildung 1a mit repräsentativen Hellfeldbildern der endodermalen und organoiden Differenzierung in Abbildung 1b dargestellt. Abbildung 1c,d zeigt die Genexpressionsdetails der endodermalen Differenzierung sowie die Genexpression sowohl der proximalen als auch der distalen Populationen von Lungenepithelzellen nach Abschluss der Differenzierung.

Protokoll

Dieses Studienprotokoll wurde vom Institutional Review Board des Human Research Protections Program der UCSD (181180) genehmigt.

1. Definitive Endoderm-Induktion aus induzierten pluripotenten Stammzellen (Tag 1 - 3)

1. Langsames Auftauen des Wachstumsfaktors reduziert (GFR)-Basalmembran (BM) Matrixmedium auf Eis 30 Minuten vor Gebrauch. In kaltem DMEM/F12-Gemisch das GFR BM-Matrixmedium 1:1 so verdünnen, dass es 50% dieses Mediums ausmacht. Legen Sie die P1000-Pipettenspitzen in den Gefrierschrank, um sie vor gebrauchen zu kühlen.
2. Beschichten Sie jede Vertiefung einer 12-Well-Platte mit 500 μL 50% GFR-Basalmembranmatrixmedium, das in eiskaltem DMEM/F12 hergestellt wurde. Sobald die gewünschte Anzahl von Vertiefungen beschichtet ist, entfernen Sie überschüssiges Mediumsgemisch und/oder Blasen aus den Vertiefungen und stellen Sie die Platte bei 4 °C für 20 minuten auf Eis oder Kühlschrank. Dann die Platte über Nacht bei 37 °C zum Gelieren und Trocknen in den Inkubator bringen.
3. Sobald hiPSCs eine Konfluenz von 70-90% erreicht haben, fügen Sie eine Stunde vor der Dissoziation 10 μM Rho-assoziierten Kinase (ROCK) Inhibitor Y-27632 hinzu. Saugen Sie das Medium ab und waschen Sie es einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Dissoziieren Sie hiPS-Zellen durch Zugabe von Zellablösungsmedium (0,5 ml / Vertiefung einer 12-Well-Platte) und inkubieren Sie für 20 min bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator.
4. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und geben Sie 0,5 ml/12-Well Stammzell-Passaging-Medium (Tabelle 1) in die Vertiefungen; Zellen mit einer P1000-Spitze sanft verdrängen, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Übertragen Sie dissoziierte Zellen in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen; Zentrifuge für 5 min bei 300 x g.
5. Aspirieren Sie das Medium ab und resuspenieren Sie das Zellpellet mit 1 ml mTeSR Plus-Medium, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor (Y-27632). Führen Sie eine Zellenzählung durch. Fügen Sie 2,0 x ¹⁰⁵ hiPSCs in 1 ml mTeSR, ergänzt mit ROCK-Inhibitor Y-27632, pro Vertiefung einer 12-Well GFR-Basement-Membran medium coated Plate hinzu. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
   HINWEIS: Die Anzahl der Zellaussaatzellen muss pro Zelllinie optimiert werden. 24 h nach dem Plattieren sollten die Vertiefungen 50% -70% konfluent sein.
6. An Tag 1 das mTeSR Plus absaugen und definitive Endoderm (DE)-Induktionsmedien (Tabelle 1) hinzufügen, die mit 100 ng/ml humanem Aktivin A und 5 μM GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR99021 ergänzt werden.
   HINWEIS: DE-Medien mit GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR99021 sollten innerhalb von 20-24 h nach Tag 1 DE-Induktion für eine erfolgreiche Differenzierung entfernt werden.
7. Wechseln Sie an Tag 2 und Tag 3 zu DE-Induktionsmedien, die nur mit 100 ng /ml Aktivin A ergänzt werden.
   HINWEIS: Die DE-Differenzierung sollte insgesamt 72 h nicht überschreiten, da sonst die Wirksamkeit abnimmt. Wenn an Tag 4 ein Absterben großer Zellen beobachtet wird, verringern Sie die gesamte DE-Medienexpositionszeit um 6-12 h.
8. Um die DE-Effizienz zu analysieren, bestätigen Sie mehr als 90% CXCR4- und/oder cKit-Expression mittels Durchflusszytometrie oder Immunfluoreszenzanalyse von FOXA2 und/oder SOX17 (Abbildung 2a).

2. Induktion des vorderen Vorderdarmendoderms (AFE) (Tag 4 - 6)

1. Wechseln Sie an Tag 4 das Medium zu serumfreiem Basalmedium (SFBM) (Tabelle 1), ergänzt mit 10 μM SB431542 und 2 μM Dorsomorphin zur AFE-Induktion. Wechseln Sie die AFE-Medien täglich für 3 Tage (Tag 4, Tag 5 und Tag 6).
2. Um die AFE-Effizienz zu analysieren, bestätigen Sie die robuste Expression von SOX2, TBX1 und FOXA2 durch Immunfluoreszenzfärbung (Abbildung 2b).

3. Differenzierung der Lungenvorläuferzellen (LPC) (Tag 7 - 16)

1. An Tag 7 das GFR-Basalmembran-Matrixmedium auf Eis auftauen. Saugen Sie das AFE-Medium ab und waschen Sie es gut mit 1x PBS. 1 ml Zellablösung zugeben und 10 min bei 37 °C inkubieren.
2. 1 ml Abschreckmedium (2 % FBS in DMEM/F12) in die Vertiefungen geben, die Zellablösung enthalten. Halten Sie Zellen als Aggregate, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen entfernt und in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt werden. Zentrifuge für 5 min bei 300 x g.
3. Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in Quenching-Medium, ergänzt mit 10 ng/ml humanem rekombinantem knochenmorphogenem Protein-4 (BMP4), 0,1 μM All-trans-Retinsäure (RA), 3 μM GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR99021 und 10 μM Gesteinsinhibitor Y-27632.
4. Führen Sie eine Zellenzählung durch. Fügen Sie 2,5 x ¹⁰⁵ Zellen zu 100 μL kaltem GFR-Basement-Membranmatrixmedium hinzu, mischen Sie gut und geben Sie das Tröpfchen in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte. Die Platte bei 37 °C für 30-60 min inkubieren, damit das Medium polymerisieren kann. Fügen Sie 1 ml LPC-Medien, ergänzt mit 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632 pro Vertiefung, hinzu, um sicherzustellen, dass der mittlere Tropfen vollständig eingetaucht ist, und inkubieren Sie bei 37 ° C über Nacht.
5. Wechseln Sie am Tag 8, 24 h nach der LPC-Induktion, das LPC-Medium, um den ROCK-Inhibitor Y-27632 zu entfernen. Wechseln Sie das LPC-Medium jeden zweiten Tag für insgesamt 9-11 Tage.
   HINWEIS: Wenn das Medium innerhalb von 24 Stunden gelb wird, wechseln Sie das Medium jeden Tag.
6. Um die LPC-Effizienz zu analysieren, bestätigen Sie die robuste Expression des intrazellulären Transkriptionsfaktors NKX2-1 oder führen Sie eine Durchflusszytometrie für die Oberflächenmarker ^CD47hi/CD26low15 oder ^CPM18 durch (Abbildung 2c). Grob gesagt sollten die LPC-Sphäroide rund und transparent sein (Abbildung 2c).
   HINWEIS: Fahren Sie nicht mit der Differenzierung der Lungenorganoide fort, wenn die Effizienz von NKX2-1 unter 30% liegt.

4.3D Lungenorganoid-Induktion (Tag 16 - 22)

1. Am Tag 17 das GFR-Basalmembran-Matrixmedium auf Eis auftauen. Aspirieren Sie das LPC-Induktionsmedium. Anschließend werden 2 μg/ml Dispase (1 ml) in die Vertiefung gegeben und das Medium/Dispase-Gemisch mit einer P1000-Pipette resuspendiert. Bei 37 °C für 15 min inkubieren. Die Mischung erneut verdränken und bei 37 °C weitere 15 min inkubieren.
2. Übertragen Sie die Dispase und die Zellen in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie gekühltes PBS (2-3 ml), um den Brunnen zu waschen und die Dispase / Zell-Mischung wieder zu verstopfen. Zentrifuge für 5 min bei 400 x g. Entfernen Sie den Überstand manuell und achten Sie darauf, die Medium- / Zellpelletschicht nicht zu entstuben. Wiederholen Sie die gekühlte PBS-Wäsche und zentrifugieren Sie das konische Zentrifugenröhrchen für weitere 5 minuten bei 400 x g.
3. Entfernen Sie den Überstand manuell und geben Sie dann 2 ml Trypsin-basierte Dissoziationslösung in das konische Zentrifugenröhrchen. Bei 37 °C für 12 min inkubieren.
4. Nach der Inkubation resuspendieren Sie die Zellen mit einer P1000-Pipettenspitze. Dann ein gleiches Volumen Abschreckmittel in das konische Zentrifugenröhrchen geben und bei 400 x g für 5 min herunterdrehen. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie Zellen in Löschmedium + 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632.
   HINWEIS: Eine erfolgreiche Lungenorganoidinduktion tritt auf, wenn Zellen als Aggregate eingebettet sind, nicht einzelne Zellen, passen Sie das Pipettieren entsprechend an.
5. Führen Sie eine Zellenzählung durch. Berechnen Sie das Volumen, das benötigt wird, um 5,0-8,0 x ¹⁰⁴ Zellen pro Bohrloch zu erhalten. Aliquot aggregiert die LPC-Zelle zu 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiert für 5 min bei 400 x g. Entfernen Sie überschüssigen Überstand und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu rühren. Lassen Sie nur 10 μL Restmedien.
6. Suspendieren Sie das Zellpellet in 200 μL kaltem GFR-Basalmembranmatrixmedium erneut und fügen Sie sie den Zellkulturmembraneinsätzen hinzu (6,5 mm Durchmesser, 0,4 μm Pore, Polyestermembran). Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 30-60 min, damit das GFR-Basalmembranmatrixmedium polymerisieren kann.
7. 1 ml 3D-Organoid-Induktionsmedium (Tabelle 1), ergänzt mit Fibroblasten-Wachstumsfaktor-7 (FGF7) (10 ng/ml), FGF10 (10 ng/ml), GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR (3 μM), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) (10 ng/ml) und 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632 in die basolaterale Kammer des Membraneinsatzes geben. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag für 6 Tage.

5.3D Lungenorganoidverzweigung (Tag 23 - 28)

1. Am Tag 23 Wechsel zu 3D-Verzweigungsmedium (Tabelle 1), ergänzt mit FGF7 (10 ng/ml), FGF10 (10 ng/ml), GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR99021 (3 μM), RA (0,1 μM), EGF (10 ng/ml) und vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) / Plazentawachstumsfaktor (PlGF) (10 ng/ml). Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag für 6 Tage.
   HINWEIS: An Tag 6 der 3D-Verzweigungsdifferenzierung sollten mehrere verzweigte Organoide vorhanden sein (Abbildung 2).

6.3D Reifung der Lungenorganoide (Tag 29 - 34)

1. Wechseln Sie am Tag 29 zu einem 3D-Reifungsmedium (Tabelle 1), das mit dem 3D-Verzweigungsmedium identisch ist, jedoch mit dem Zusatz von Dexamethason (50 nM), cAMP (100 μM) und 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), einem Phosphodiesterase-Inhibitor, der auch isobutylxanthin (100 μM) genannt wird. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag für 6 Tage.
   HINWEIS: Innerhalb von 24 h nach der 3D-Reifung sollten sich die verzweigten Organoide ausdehnen und in transparente Kugeln übergehen.

7.3D Immunzytozytochemie des Lungenorganoids

1. Für die 3D-Analyse des gesamten Lungenorganoids das GFR-Basalmembranmatrixmedium in den Membraneinsätzen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 1 h bei 4 °C fixieren. In Paraffinwachs einbetten und gemäß den standardmäßig veröffentlichten Protokollen auf Objektträger montieren.
2. Führen Sie vor der Färbung einen Antigenabruf durch. Zu den Atemwegsmarkierungen gehören KRT5, MUC5AC und SCGB3A2. Alveolare Marker umfassen SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 und HOPX (Abbildung 3).

8. Entfernung ganzer Lungenorganoide aus dem GFR-Basalmembranmatrixmedium für Passage, FACS oder Kryokonservierung

1. Um die Organoide vom GFR-Basalmembranmatrixmedium zu dissoziieren, entfernen Sie Medien aus der Basalkammer und fügen Sie 2 μg/ml Dispase (1 ml) in die apikale Kammer hinzu.
2. Das Medium/Dispase-Gemisch mit einer P1000-Pipette vorsichtig verdrängen und für 15 min in den Inkubator geben. Die Mischung noch einmal vorsichtig veredeln und weitere 15 min inkubieren.
3. 1 mL gekühltes PBS (4 °C) zugeben und Organoide mit dem Matrixmedium in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen übertragen. Bei 400 x g für 5 min drehen. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, um das Zellpellet nicht zu stören.
4. Noch einmal mit 1 ml gekühltem PBS waschen und bei 400 x g für 5 min herunterdrehen. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, um das Medium/Zell-Gemisch nicht zu stören.
5. 1 ml Zellablösung in das konische Zentrifugenröhrchen geben, vorsichtig verdreinigen und das GFR-Basement-Membranmatrix-Medium/Zell-Gemisch vorsichtig resuspendieren. Für 12 min in den Inkubator geben, um Zellen als Aggregate oder zur Kryokonservierung zu überreichen) oder 20 min für Einzelzellsuspensionen.
6. Fügen Sie das gleiche Volumen an Löschmedien hinzu und drehen Sie es bei 400 x g für 5 min herunter. Resuspend in Abschreckmedium + 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632.
   HINWEIS: Bei diesem Schritt sollte kein Restmedium der Basalmembran im Rohr zu sehen sein. Wenn das Restmedium übrig bleibt, wiederholen Sie die Schritte 8.5 und 8.6.
7. Führen Sie eine Zellenzählung durch. Berechnen Sie das für nachgelagerte Anwendungen benötigte Volumen.

Ergebnisse

24 Stunden nach dem Plattieren, Tag 1, sollten iPS-Zellen 50% -90% konfluent sein. An Tag 2 sollte DE zu 90%-95% konfluent sein. Während der DE-Induktion ist es üblich, am Tag 4 einen signifikanten Zelltod zu beobachten, aber die angeschlossenen Zellen behalten eine kompakte Kopfsteinpflastermorphologie bei (Abbildung 2b). Brechen Sie die Differenzierung ab, wenn sich die Mehrheit der adhärenten Zellen löst, und erwägen Sie, die Exposition gegenüber DE-Medien mit Activin A um 6-12 h zu...

Diskussion

Die erfolgreiche Differenzierung von 3D-Ganzlungenorganoiden (WLO) beruht auf einem mehrstufigen, 6-wöchigen Protokoll mit Liebe zum Detail, einschließlich der Zeit der Exposition gegenüber Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen, der Zelldichte nach dem Passieren und der Qualität der hiPS-Zellen. Informationen zur Problembehandlung finden Sie in Tabelle 2. hiPS-Zellen sollten etwa 70%-80% konfluent sein, mit weniger als 5% spontaner Differenzierung vor der Dissoziation. Dieses Protokoll erfordert d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture
12 well plates	Corning	3512
12-well inserts, 0.4um, translucent	VWR	10769-208
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Accutase	Innovative Cell Tech	AT104
ascorbic acid	Sigma	A4544
B27 without retinoic acid	ThermoFisher	12587010
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution	Gibco	15260-037
Dispase	StemCellTech	7913
DMEM/F12	Gibco	10565042
FBS	Gibco	10082139
Glutamax	Life Technologies	35050061
Ham’s F12	Invitrogen	11765-054
HEPES	Gibco	15630-080
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax	Invitrogen	31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828028
Matrigel	Corning	354230
Monothioglycerol	Sigma	M6145
mTeSR plus Kit (10/case)	Stem Cell Tech	5825
N2	ThermoFisher	17502048
NEAA	Life Technologies	11140050
Pen/strep	Lonza	17-602F
ReleSR	Stem Cell Tech	5872
RPMI1640 + Glutamax	Life Technologies	12633012
TrypLE	Gibco	12605-028
Y-27632 (Rock Inhibitor)	R&D Systems	1254/1
Growth Factors/Small Molecules
Activin A	R&D Systems	338-AC
All-trans retinoic acid (RA)	Sigma-Aldrich	R2625
BMP4	R&D Systems	314-BP/CF
Br-cAMP	Sigma-Aldrich	B5386
CHIR99021	Abcam	ab120890
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dorsomorphin	R&D Systems	3093
EGF	R&D Systems	236-EG
FGF10	R&D Systems	345-FG/CF
FGF7	R&D Systems	251-KG/CF
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)	Sigma-Aldrich	I5879
SB431542	R&D Systems	1614
VEGF/PIGF	R&D Systems	297-VP/CF
Primary antibodies			Dilution rate
CXCR4-PE	R&D Systems	FAB170P	1:200 (F)
HOPX	Santa Cruz Biotech	sc-398703	0.180555556
HTII-280	Terrace Biotech	TB-27AHT2-280	0.145833333
KRT5	Abcam	ab52635	0.180555556
NKX2-1	Abcam	ab76013	0.25
NKX2-1-APC	LS-BIO	LS-C264437	1:1000 (F)
proSPC	Abcam	ab40871	0.215277778
SCGB3A2	Abcam	ab181853	0.25
SOX2	Invitrogen	MA1-014	0.180555556
SOX9	R&D Systems	AF3075	0.180555556
SPB (mature)	7 Hills	48604	1: 1500 (F) 1:500 (W)a
SPC (mature)	LS Bio	LS-B9161	1:100 (F); 1:500 (W) a