JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

本稿では、近位および遠位上皮肺細胞と共に近位および遠位上皮肺細胞の両方を含む3次元全肺オルガノイドに対する誘導多能性幹細胞のステップ指向分化について説明する。

要約

ヒトの肺の発達と疾患は、生体関連の インビトロ モデルシステムがないため、研究が困難であった。ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、上皮細胞と間葉系細胞集団の両方からなる3D多細胞性肺オルガノイドに段階的に分化することができる。胚発生の手掛かりを、様々な成長因子と小分子を一時的に導入し、決定的な内胚、前腸内胚の内胚体、そしてその後肺前駆細胞を効率的に生成することによって再現します。これらの細胞は、次に成長因子還元(GFR)基膜マトリックス培地に埋め込まれ、外部の成長因子に応答して3D肺オルガノイドに自発的に発達することを可能にする。これらの全肺オルガノイド(WLO)は、デキサメタゾン、環状AMPおよびイソブチルキサンチンへの暴露後の分岐形態形成および成熟を含む初期の肺発達段階を受ける。Wloは、マーカーKRT5(基底)、SCGB3A2(クラブ)およびMUC5AC(ゴブレット)、およびHOPX(肺胞タイプI)およびSP-C(肺胞タイプII)を発現する肺胞上皮細胞を発現する気道上皮細胞を有する。間葉系細胞は、平滑筋アクチン(SMA)、および血小板由来増殖因子受容体A(PDGFRα)を含む存在も存在する。iPSC由来のWloは、何か月の間、3D培養条件で維持することができ、特定の細胞集団を精製するために表面マーカーのためにソートすることができる。iPSC由来のWlosは、肺上皮と間葉系間のシグナル伝達を含むヒト肺の発達を研究し、ヒト肺細胞の機能および発達に関する遺伝子変異をモデル化し、感染剤の細胞毒性を決定するためにも利用することができる。

概要

肺は、胚性、仮頭腺、運河、嚢胞、眼胞、微小血管成熟の6つの異なる段階で発達する複雑で異質な動的器官である1,2。後者の2つの段階は人間の発達において出生前および出生後に起こり、最初の4段階は早産が起こらない限り胎児の発達中に排他的に起こる3。胚期は内胚芽層から始まり、気管と肺の芽の出芽で終わる。肺の発達は、上皮細胞と間葉系細胞4との間のシグナル伝達を介して部分的に起こる。これらの相互作用は、肺の分岐、増殖、細胞の運命決定および発達中の肺の細胞分化をもたらす。肺は伝導域(末端気管支への気管)と呼吸帯(肺胞への呼吸気管支)に分けられる。各ゾーンには、ユニークな上皮細胞タイプが含まれています。導体気道内に基底、分泌、毛様体、ブラシ、神経内分泌、ヨウノサイト細胞を含む5、続いて肺胞型I型およびII細胞を呼吸上皮6に含む。様々な細胞型の損傷に対する発達と反応については、まだ多くのことが不明である。iPSC由来の肺オルガノイドモデルは、ヒト肺の発達を促進するメカニズム、肺機能に対する遺伝子変異の影響、および原発性ヒト肺組織を必要とせずに感染因子に対する上皮および間葉の両方の反応を促進する。

胚分化の様々な段階に対応するマーカーとしては、CXCR4、cKit、FOXA2、およびSOX17が決定的な内胚(DE)7、FOXA2、TBX1、および前前腸内胚葉(AFE)8のSOX2、早期肺前駆細胞用NKX2-1が含まれる。胚性肺の発達では、前腸は食道および腹側気管に分かれる。右と左の肺の芽は気管の芽10のまわりの2つの独立した外挿として現れる。分岐形態形成の間葉形成の間葉は、伸縮性組織、平滑筋、軟骨、脈管構造11を生成する。上皮と間葉系の相互作用は、正常な肺の発達に不可欠である。これには、上皮によって産生される間葉系およびSHH13によるFGF1012の分泌が含まれる。

ここでは、HIPSCを3次元(3D)全肺オルガノイド(WLO)に誘導分化するためのプロトコルについて説明する。LPC段階で並べ替えを行って肺胞状の14,15(遠位)オルガノイドまたは気道16(近位)オルガロイドを作ったり、腹側前腸前腸球体を生成して肺胞細胞とmesenterのマーカーと親子のマーカーと前駆体のマーカーと前足のマーカーを選別することによって肺前駆細胞の単離を組み込む同様のアプローチがある。この方法の強さは、肺分岐形態形成、成熟、およびインビトロでの拡張をパターン化し、調整するための肺上皮および間葉細胞型の両方を含めることである。

このプロトコルは、小分子と成長因子を使用して、決定的な内胚葉、前腸内臓内臓、肺前駆細胞を介して多能性幹細胞の分化を指示する。これらの細胞は、分岐および成熟を含む重要な発達段階を通じて3D全肺オルガノイドに誘導される。分化プロトコルの概要は、図1bに示す内胚葉およびオルガノイド分化の代表的な明視野画像を用いて図1aに示されている。図1c,dは、分化を完了した後の肺上皮細胞の近位および遠位の両方の集団の遺伝子発現と同様に、内皮分化の遺伝子発現の詳細を示す。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

この研究議定書は、UCSDの人間研究保護プログラム(181180)の機関審査委員会によって承認されました。

1. 人工多能性幹細胞からの決定的な内胚葉誘導(1日目~3日目)

  1. ゆっくりと解凍成長因子は、使用の30分前に氷上の(GFR)基質膜(BM)マトリックス培地を減少させた。冷たいDMEM/F12において、混合物は、この培地の50%を構成するようなGFRBMマトリックス培地1:1を希釈する。P1000ピペットの先端を冷凍庫に入れ、使用前に冷やします。
  2. 氷冷DMEM/F12で調製した50%GFR基膜マトリックス媒体の500 μLで12ウェルプレートの各ウェルをコーティングします。必要な数のウェルがコーティングされたら、余分な培地混合物および/または気泡を井戸から取り除き、プレートを氷または冷蔵庫の上に4°Cで20分間置きます。その後、プレートを一晩37°Cでインキュベーターに移動させてゲル化し、乾燥させた。
  3. HiPSCが70-90%の合流度に達したら、解離の1時間前に10μMのRho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y-27632を加えます。培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で一度洗います。細胞剥離培地(12ウェルプレートの0.5mL/ウェル)を添加してHIPSCを解離し、5%CO2 インキュベーターで37°Cで20分間インキュベートします。
  4. インキュベーターからプレートを取り出し、0.5 mL/12ウェルの幹細胞通過媒体(表1)をウェルに加えます。P1000チップを使用して細胞を穏やかに三分し、単細胞懸濁液を得る。解き分けた細胞を15 mL円錐形遠心分離管に移す;遠心分離機は300× gで5分間。
  5. 培地を吸引し、10 μM ROCK阻害剤(Y-27632)を添加したmTeSR Plus培地1 mLで細胞ペレットを再懸濁する。セルカウントを実行します。12ウェルGFR地下膜媒体被覆プレートのウェルあたりROCK阻害剤Y-27632を補ったmTeSRの1 mLに2.0 x 105のhiPSCを加えます。一晩で37°Cでインキュベートする。
    注: セルのシード数はセルラインごとに最適化する必要があります。めっき後24時間、ウェルは50%-70%コンフルエントでなければなりません。
  6. 1日目、mTeSR Plusを吸引し、ヒトアクチビンAの100ng/mLとGSK3β阻害剤/WntアクチベーターCHIR99021の5μMを添加した決定的内胚葉(DE)誘導培地(表1)を加える。
    注:GSK3β阻害剤/WntアクチベーターCHIR99021を有するDE培地は、分化を成功させるために1日目DE誘導の20-24時間以内に除去されるべきである。
  7. 2日目および3日目に、100 ng/mLのアクチビンAのみを補ったDE誘導培地に変更する。
    注: DE 分化は合計 72 時間を超えないようにしてください。4日目に、大きな細胞ダイオフが観察された場合、DE培地の総暴露時間を6〜12時間減少させる。
  8. DE効率を解析するには、FOXA2および/またはSOX17のフローサイトメトリーまたは免疫蛍光分析を介して、CXCR4および/またはcKit発現を90%以上確認します(図2a)。

2. 前腸内臓(AFE)誘導(4日目~6日目)

  1. 4日目、培地をAFE誘導用に10μM SB431542および2μMドーソモルフィンを添加した無血清基底培地(SFBM)(表1)に変更します。AFE メディアを毎日 3 日間 (4 日目、5 日目、および 6 日目) に変更します。
  2. AFE効率を解析するために、免疫蛍光染色によるSOX2、TBX1、FOXA2の強い発現を確認します(図2b)。

3. 肺前駆細胞(LPC)分化(7日目~16日目)

  1. 7日目に、氷上のGFR基基膜マトリックス培地を解凍する。AFE培地を吸引し、1x PBSでよく洗います。1 mLの細胞剥離液を加え、37°Cで10分間インキュベートします。
  2. 細胞剥離液を含むウェルに1mLの焼入媒体(DMEM/F12で2%FBS)を加えます。細胞を上下に軽くピペット化して凝集体として保持します。すべての細胞が外れ、15 mL円錐形遠心分離管に移ることを確認してください。遠心分離機は300× gで5分間
  3. 上清を取り除き、ヒト組換え骨形態形成タンパク質-4(BMP4)の10 ng/mL、全トランスレチノイン酸(RA)の0.1 μM、GSK3β阻害剤/Wnt活性化剤CHIR99021の3μM、および10μMのロック阻害剤Y-2766666600を補ったクエンチン化培地中の細胞ペレットを再懸濁させる。
  4. セルカウントを実行します。2.5 x 105 細胞を100 μLの冷たいGFR基膜マトリックス培地に加え、よく混ぜ合わせ、液滴を12ウェルプレートのウェルに入れる。プレートを37°Cで30〜60分間インキュベートし、培地を重合させます。10 μMのROCK阻害剤Y-27632を添加したLPC培地を1ウェルあたり1mL添加して、培地の低下が完全に水没し、一晩で37°Cでインキュベートされるようにします。
  5. 8日目、LPC誘導後24時間、LPC培地を変更してROCK阻害剤Y-27632を除去した。LPC培地を1日おきに9~11日間変更します。
    注:24時間以内にメディアが黄色になった場合は、毎日メディアを変更してください。
  6. LPC効率を解析するには、細胞内転写因子NKX2-1の強い発現を確認するか、CD47hi/CD26low15またはCPM18の表面マーカーに対してフローサイトメトリーを行う(図2c)。LPCスフェロイドは、丸く透明である必要があります(図2c)。
    注:NKX2-1の効率が30%を下回る場合は、肺オルガノイド分化を進めないでください。

4.3D肺オルガノイド誘導(16日目~22日目)

  1. 17日目に、氷上のGFR基基膜マトリックス培地を解凍する。LPC誘導培地を吸引する。その後、2 μg/mL のディスパーゼ (1 mL) をウェルに加え、P1000 ピペットで培地/ディスパーゼ混合物を再中断します。37°Cで15分間インキュベートします。再び混合物をトリチュレートし、さらに15分間37°Cでインキュベートします。
  2. ディスパーゼと細胞を15 mL円錐形遠心分離チューブに移します。冷やしたPBS(2〜3mL)を使用して井戸を洗浄し、ディスパーゼ/細胞混合物を再中断します。遠心分離機 400 x g で 5 分間上清を手動で除去し、培地/細胞ペレット層を外さないよう注意する。冷やしたPBS洗浄を繰り返し、円錐状遠心管を400xgでさらに5分間遠心分離 します。
  3. 上清を手動で取り出し、2 mLのトリプシンベース解離液を円錐遠心管に加えます。37°Cで12分間インキュベートします。
  4. インキュベーション後、P1000ピペットチップで細胞を再懸濁する。その後、円錐遠心管に焼入れ培地の等量を追加し、5分間400 x g でスピンダウンします。ROCK阻害剤Y-27632の焼入培地+10μMの上清および再懸濁細胞を吸引する。
    注:成功した肺オルガノイド誘導は、細胞が単一細胞ではなく凝集体として埋め込まれるときに発生し、それに応じてピペットを調整します。
  5. セルカウントを実行します。ウェルあたり 5.0~ 8.0 x 104 セルを得るために必要な体積を計算します。アリコートLPC細胞は、400 x gで5分間、1.5 mLマイクロ遠心分離チューブと遠心分離機に凝集 する。余分な上清を除去し、細胞ペレットを攪拌しないように注意する。残りの媒体は10μLだけ残します。
  6. 細胞ペレットを200μLの冷たいGFR基底膜マトリックス培地に再懸濁し、細胞培養膜挿入物(直径6.5mm、0.4μmの細孔、ポリエステル膜)に添加します。30~60分間37°Cでプレートをインキュベートし、GFR基質膜マトリックス媒体を重合させます。
  7. 線維芽細胞増殖因子-7(FGF7)(10 ng/mL)、FGF10(10 ng/mL)、GSK3β阻害剤/Wnを添加した3Dオルガノイド誘導培地(表1)を1mL追加 チロピターCHIR(3μM)、表皮成長因子(EGF)(10 ng/mL)、および10μMのROCK阻害剤Y-27632を膜インサートのバソラテラチャンバーに挿入した。1 日おきに 6 日間、メディアを変更します。

5.3D肺オルガノイド分枝(23日目~28日目)

  1. 23日目にFGF7(10 ng/mL)、FGF10(10 ng/mL)、GSK3β阻害剤/Wnt活性化剤CHIR9902を添加した3D分岐培地(表1)に変更 1(3 μM)、RA(0.1 μM)、EGF(10 ng/mL)、血管内皮成長因子(VEGF)/胎盤成長因子(PlGF)(10 ng/mL)。1 日おきに 6 日間、メディアを変更します。
    注: 3D 分岐分化の 6 日目には、複数の分岐オルガノイドが存在する必要があります(図 2)。

6.3D肺オルガノイド成熟(29日目~34日目)

  1. 29日目には、3D分岐培地と同じであるが、デキサメタゾン(50nM)、cAMP(100μM)、および3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)を添加した3D分岐培地(表1)に変更し、ホスホジエステラーゼ阻害剤(100μM)とも呼ばれる。1 日おきに 6 日間、メディアを変更します。
    注:3D成熟後24時間以内に、分枝オルガノイドは拡大し、透明な球に変わるはずです。

7.3D肺オルガノイド免疫細胞化学

  1. 3D全肺オルガノイド分析では、GFR基基膜マトリックス培地を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で4%のパラホルムアルデヒド(PFA)で4°Cで1時間固定します。 パラフィンワックスに埋め込み、標準的な公開プロトコルごとにスライドにマウントします。
  2. 染色前に抗原検索を行う。気道マーカーにはKRT5、MUC5AC、およびSCGB3A2が含まれます。歯槽マーカーには、SP-C、SP-B、HTII-280、HTI-56、およびHOPXが含まれる(図3)。

8. GFR基基膜マトリックス媒体からの全肺オルガノイドの除去、FACS、または凍結保存

  1. GFR基底膜マトリックス媒体からオルガノイドを解離するには、基底チャンバーから培地を取り出し、坐骨室に2μg/mLのディスパーゼ(1mL)を加えます。
  2. P1000ピペットで培地/ディスパーゼ混合物を穏やかにトリチュレートし、インキュベーターに15分間置きます。混合物をもう一度穏やかにトリチュレートし、さらに15分間インキュベートします。
  3. 1 mLの冷蔵PBS(4°C)を加え、マトリックス培地を用いてオルガノイドを15 mL円錐形遠心管に移します。400 x g で 5 分間スピンします。上清を慎重に除去し、細胞ペレットを乱さない。
  4. 1 mLチルドPBSでもう一度洗い、400 x g で5分間スピンダウンします。上清を慎重に取り除き、培地/細胞混合物を乱さない。
  5. 円錐状遠心分離管に1 mLの細胞剥離液を加え、GFR基膜マトリックス培地/細胞混合物を穏やかにトリチュレート再懸濁させる。インキュベーターに12分間、凝集体または凍結保存用として細胞を通過させるため、または単一細胞懸濁液の場合は20分間置きます。
  6. 同じ量の焼入れメディアを追加し、400 x g で5分間スピンダウンします。ROCK阻害剤Y-27632の焼入培地+ 10 μMで再懸濁します。
    注:このステップでは、チューブに残った基質膜媒体は見られるべきではありません。残留媒体が残っている場合は、ステップ8.5と8.6を繰り返します。
  7. セルカウントを実行します。ダウンストリーム アプリケーションに必要なボリュームを計算します。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

めっきの24時間後、1日目、iPSCは50%-90%コンフルエントでなければなりません。2日目には、DEは90%-95%コンフルエントでなければなりません。DE誘導の間、4日目に有意な細胞死を観察することが一般的であるが、結合された細胞はコンパクトな石畳の形態を保持する(図2b)。接着細胞の大部分が剥離する場合は分化を中止し、6-12時間でアクチビンAを有するDE培地への暴露を?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

3D全肺オルガノイド(WLO)の分化が成功したのは、成長因子や小分子への暴露時間、通過後の細胞密度、HiPSCの品質など、細部に注意を払った6週間のマルチステッププロトコルに依存しています。トラブルシューティングについては、 表 2 を参照してください。hiPSCは、解離前に約70%〜80%のコンフルエントで、5%未満の自発的分化を行う必要があります。このプロトコルは"mTeSR プラ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、カリフォルニア再生医療研究所(CIRM)(DISC2-COVID19-12022)によって支援されました。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture
12 well platesCorning3512
12-well inserts, 0.4um, translucentVWR10769-208
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
AccutaseInnovative Cell TechAT104
ascorbic acidSigmaA4544
B27 without retinoic acidThermoFisher12587010
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solutionGibco15260-037
DispaseStemCellTech7913
DMEM/F12Gibco10565042
FBSGibco10082139
GlutamaxLife Technologies35050061
Ham’s F12Invitrogen11765-054
HEPESGibco15630-080
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + GlutamaxInvitrogen31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828028
MatrigelCorning354230
MonothioglycerolSigmaM6145
mTeSR plus Kit (10/case)Stem Cell Tech5825
N2ThermoFisher17502048
NEAALife Technologies11140050
Pen/strepLonza17-602F
ReleSRStem Cell Tech5872
RPMI1640 + GlutamaxLife Technologies12633012
TrypLEGibco12605-028
Y-27632 (Rock Inhibitor)R&D Systems1254/1
Growth Factors/Small Molecules
Activin AR&D Systems338-AC
All-trans retinoic acid (RA)Sigma-AldrichR2625
BMP4R&D Systems314-BP/CF
Br-cAMPSigma-AldrichB5386
CHIR99021Abcamab120890
DexamethasoneSigma-AldrichD4902
DorsomorphinR&D Systems3093
EGFR&D Systems236-EG
FGF10R&D Systems345-FG/CF
FGF7R&D Systems251-KG/CF
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)Sigma-AldrichI5879
SB431542R&D Systems1614
VEGF/PIGFR&D Systems297-VP/CF
Primary antibodiesDilution rate
CXCR4-PER&D SystemsFAB170P1:200 (F)
HOPXSanta Cruz Biotechsc-3987030.180555556
HTII-280Terrace BiotechTB-27AHT2-2800.145833333
KRT5Abcamab526350.180555556
NKX2-1Abcamab760130.25
NKX2-1-APCLS-BIOLS-C2644371:1000 (F)
proSPCAbcamab408710.215277778
SCGB3A2Abcamab1818530.25
SOX2InvitrogenMA1-0140.180555556
SOX9R&D SystemsAF30750.180555556
SPB (mature)7 Hills486041: 1500 (F) 1:500 (W)a
SPC (mature)LS BioLS-B91611:100 (F); 1:500 (W) a

参考文献

  1. Ten Have-Opbroek, A. A. Lung development in the mouse embryo. Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).
  2. Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
  3. Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36(2016).
  4. Hines, E. A., Sun, X. Tissue crosstalk in lung development. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).
  5. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
  6. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
  7. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  8. Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
  9. Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
  10. Schittny, J. C. Development of the lung. Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).
  11. Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
  12. Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
  13. Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
  14. Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
  15. Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
  16. McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51(2018).
  17. Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
  18. Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
  19. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
  20. Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
  21. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  22. Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
  23. Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
  24. McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
  25. Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
  26. Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450(2019).
  27. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  28. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
  29. McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
  30. Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293(2020).
  31. Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
  32. Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

170 3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved