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Resumo

O artigo descreve a diferenciação direcionada de células-tronco pluripotentes induzidas a organoides pulmonares inteiros tridimensionais contendo células pulmonares epiteliais proximais e disais, juntamente com mesenchyme.

Resumo

O desenvolvimento pulmonar humano e a doença têm sido difíceis de estudar devido à falta de sistemas de modelos in vitro biologicamente relevantes. Células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs) podem ser diferenciadas em organoides pulmonares multicelulares 3D, feitos de populações epiteliais e células mesenquimais. Recapitulamos pistas de desenvolvimento embrionário introduzindo temporalmente uma variedade de fatores de crescimento e pequenas moléculas para gerar eficientemente o endoderme definitivo, o endoderme anterior e, posteriormente, as células progenitoras pulmonares. Essas células são então incorporadas no meio de matriz de membrana de fator de crescimento (GFR)-porão, permitindo que elas se desenvolvam espontaneamente em organoides pulmonares 3D em resposta a fatores de crescimento externos. Estes organoides pulmonares inteiros (WLO) passam por estágios iniciais de desenvolvimento pulmonar, incluindo morfogênese ramificada e maturação após exposição à dexametasona, AMP cíclico e isobutylxanthine. Os WLOs possuem células epiteliais das vias aéreas expressando os marcadores KRT5 (basal), SCGB3A2 (clube) e MUC5AC (cálice), bem como células epiteliais alveolares expressando HOPX (tipo alveolar I) e SP-C (alveolar tipo II). Células mesenquimais também estão presentes, incluindo actina muscular lisa (SMA), e receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas A (PDGFRα). Os WLOs derivados do iPSC podem ser mantidos em condições de cultura 3D por muitos meses e podem ser classificados para marcadores de superfície para purificar uma população celular específica. Os WLOs derivados do iPSC também podem ser utilizados para estudar o desenvolvimento pulmonar humano, incluindo a sinalização entre o epitélio pulmonar e o mesenquimme, para modelar mutações genéticas na função e desenvolvimento das células pulmonares humanas, e para determinar a citotoxicidade dos agentes infecciosos.

Introdução

O pulmão é um órgão complicado, heterogêneo e dinâmico que se desenvolve em seis estágios distintos - embrionário, pseudoglandular, canalicular, saccular, alveolar e maturação microvascular1,2. As duas últimas fases ocorrem pré e pós-natal no desenvolvimento humano, enquanto os quatro primeiros estágios ocorrem exclusivamente durante o desenvolvimento fetal, a menos que ocorram nascimentos prematuros3. A fase embrionária começa na camada de germes endodérmicos e termina com o brotamento da traqueia e dos botões pulmonares. O desenvolvimento pulmonar ocorre em parte através da sinalização entre as células epiteliais e mesenquimais4. Essas interações resultam em ramificação pulmonar, proliferação, determinação do destino celular e diferenciação celular do pulmão em desenvolvimento. O pulmão é dividido em zonas de condução (traqueia para os brônquios terminais) e zonas respiratórias (brônquios respiratórios aos alvéolos). Cada região contém tipos únicos de células epiteliais; incluindo células basais, secretas, ciliadas, escovas, neuroendócrinas e ionócitos nas vias aéreas condutoras5, seguidas por células alveolares tipo I e II no epitélio respiratório6. Ainda não se sabe muito sobre o desenvolvimento e a resposta à lesão dos vários tipos de células. Modelos organoides fundidas derivadas do iPSC permitem o estudo de mecanismos que impulsionam o desenvolvimento pulmonar humano, os efeitos das mutações genéticas na função pulmonar e a resposta tanto do epitélio quanto do mesenquime a agentes infecciosos sem a necessidade de tecido pulmonar humano primário.

Os marcadores correspondentes aos vários estágios de diferenciação embrionária incluem CXCR4, cKit, FOXA2 e SOX17 para endoderme definitivo (DE)7, FOXA2, TBX1 e SOX2 para endoderme anterior (AFE)8, e NKX2-1 para células progenitoras pulmonares precoces9. No desenvolvimento pulmonar embrionário, o foregut se divide no esôfago dorsal e na traqueia ventral. Os botões dos pulmões direito e esquerdo aparecem como dois outpouchings independentes ao redor do broto traqueal10. Durante a morfogênese ramificada, o mesenquima em torno do epitélio produz tecido elástico, músculo liso, cartilagem e vasculatura11. A interação entre o epitélio e o mesenquime é essencial para o desenvolvimento pulmonar normal. Isso inclui a secreção de FGF1012 pelo mesenchyme e SHH13 produzidos pelo epitélio.

Aqui, descrevemos um protocolo para a diferenciação direcionada de hiPSCs em organoides pulmonares tridimensionais (3D) inteiros (WLO). Embora existam abordagens semelhantes que incorporem o isolamento de células progenitoras pulmonares através da triagem no estágio LPC para fazer organoides allveolares 14,15 (distal) ou organoides das vias aéreas16 (proximal), ou gerar esferoides ventral-anteriores para fazer organoides pulmonares humanos expressando marcadores alveolares e mesenquimais e organoides progenitores de bud , a força deste método é a inclusão de ambos os tipos de células epiteliais pulmonares e mesenquimais para padronizar e orquestrar morfogênese de ramificação pulmonar, maturação e expansão in vitro.

Este protocolo utiliza pequenas moléculas e fatores de crescimento para direcionar a diferenciação de células-tronco pluripotentes através de endoderme definitivo, endoderme anterior de foregut e células progenitoras pulmonares. Essas células são então induzidas em organoides pulmonares 3D inteiros através de importantes etapas de desenvolvimento, incluindo ramificação e maturação. O resumo do protocolo de diferenciação é mostrado na Figura 1a com imagens representativas de brightfield de diferenciação endodérmica e organoide mostrada na Figura 1b. A Figura 1c,d mostra os detalhes da expressão genética da diferenciação endodérmica, bem como a expressão genética das populações proximais e distais das células epiteliais pulmonares após completar a diferenciação.

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Protocolo

Este protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Programa de Proteção à Pesquisa Humana da UCSD (181180).

1. Indução definitiva de endóderme de células-tronco pluripotentes induzidas (Dia 1 - 3)

  1. Degelo lento fator de crescimento reduzido (GFR)-membrana de porão (BM) meio de matriz no gelo 30 minutos antes do uso. No DMEM/F12 frio, misture, dilui o meio de matriz BM GFR 1:1 de tal forma que constitua 50% deste meio. Coloque as pontas de pipeta P1000 no congelador para esfriar antes de usar.
  2. Cubra cada poço de uma placa de 12 poços com 500 μL de matriz de membrana de 50% GFR-porão preparada em DMEM/F12 gelado. Uma vez revestido o número desejado de poços, remova qualquer mistura média e/ou bolhas em excesso de poços e coloque a placa no gelo ou geladeira a 4 °C por 20 minutos para definir. Em seguida, mova a placa para a incubadora a 37 °C durante a noite para gelar e secar.
  3. Uma vez que os hiPSCs atinjam 70-90% de confluência, adicione 10 μM de Inibidor de Quinase (ROCK) associado a Rho Y-27632 uma hora antes da dissociação. Aspire fora da mídia e lave uma vez com salina tamponada fosfato (PBS). Dissociar hiPSCs adicionando meio de descolamento celular (0,5 mL/ poço de uma placa de 12 poços) e incubar por 20 min a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5%.
  4. Remova as placas da incubadora e adicione 0,5 mL/12-well de meio de passagem de células-tronco (Tabela 1) aos poços; células suavemente triturada usando uma ponta P1000 para obter suspensão unicelular. Transferir células dissociadas em um tubo de centrífuga cônica de 15 mL; centrífuga por 5 min a 300 x g.
  5. Aspire fora do médio e resuspenda a pelota celular com 1 mL de mTeSR Plus de mídia suplementada com inibidor rock de 10 μM (Y-27632). Faça uma contagem de células. Adicione 2,0 x 105 hiPSCs em 1 mL de mTeSR complementado com inibidor de ROCHA Y-27632 por poço de uma placa revestida de membrana de 12 poços de GFR-porão. Incubar a 37 °C durante a noite.
    NOTA: O número de semeadura celular deve ser otimizado por linha celular. 24 h após o revestimento, os poços devem ser 50%-70% confluentes.
  6. No dia 1, aspire fora do mTeSR Plus e adicione mídia de indução Definitiva Endoderm (DE) (Tabela 1) complementada com 100 ng/mL de ativação humana A e 5 μM de inibidor GSK3β/Ativador Wnt CHIR99021.
    NOTA: A mídia DE com o inibidor GSK3β/ativador Wnt CHIR99021 deve ser removida dentro de 20-24 h do dia 1 Indução DE para diferenciação bem sucedida.
  7. No dia 2 e dia 3, mude para mídia de indução DE complementada com 100 ng/mL apenas de ativação A.
    NOTA: A diferenciação DE não deve exceder um total de 72 h, ou a eficácia diminuirá. No dia 4, se for observado o die-off de células grandes, diminua o tempo total de exposição da mídia DE em 6-12 h.
  8. Para analisar a eficiência de DE, confirme maior que 90% de expressão CXCR4 e/ou cKit através da citometria de fluxo ou análise de imunofluorescência de FOXA2 e/ou SOX17 (Figura 2a).

2. Indução anterior de endodermia de foregut (AFE) (Dia 4 - 6)

  1. No dia 4, mude a mídia para meio basal livre de soro (SFBM) (Tabela 1) complementada com 10 μM SB431542 e 2 μM Dorsomorphin para indução AFE. Mude a mídia AFE diariamente por 3 dias (dia 4, dia 5 e dia 6).
  2. Para analisar a eficiência da AFE, confirme a expressão robusta de SOX2, TBX1 e FOXA2 através de coloração de imunofluorescência (Figura 2b).

3. Diferenciação de célula progenitora pulmonar (LPC) (Dia 7 - 16)

  1. No dia 7, descongele a matriz de membrana GFR-porão no gelo. Aspire a mídia AFE e lave bem com 1x PBS. Adicione 1 mL de solução de descolamento celular e incubar por 10 min a 37 °C.
  2. Adicione 1 mL de meio de saciamento (2% FBS em DMEM/F12) aos poços que contêm solução de descolamento celular. Mantenha as células como agregados, encanar suavemente para cima e para baixo. Certifique-se de que todas as células sejam desalojadas e transferidas para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL. Centrifugar por 5 min a 300 x g.
  3. Remova o supernascimento e resuspenque a pelota celular em meio de saciamento suplementado com 10 ng/mL de proteína morfogênica ósseo recombinante humano-4 (BMP4), 0,1 μM de ácido retinóico totalmente trans (RA), 3 μM de inibidor GSK3β/Ativador Wnt CHIR99021, e 10 μM de Inibidor de Rocha Y-27632.
  4. Faça uma contagem de células. Adicione 2,5 x 105 células a 100 μL de meio de matriz de membrana GFR-porão frio, misture bem e coloque gotícula em um poço de uma placa de 12 poços. Incubar a placa a 37 °C por 30-60 min para permitir que o médio polimerize. Adicione 1 mL de mídia LPC suplementada com 10 μM de Inibidor de ROCHA Y-27632 por poço garantindo que a gota média esteja totalmente submersa e incubada a 37 °C durante a noite.
  5. No dia 8, 24 h após a indução do LPC, altere o meio LPC para remover o Inibidor de ROCHA Y-27632. Troque o meio LPC a cada dois dias por um total de 9-11 dias.
    NOTA: Se o meio ficar amarelo dentro de 24h, troque de meio todos os dias.
  6. Para analisar a eficiência do LPC, confirme a expressão robusta do fator de transcrição intracelular NKX2-1 ou realize a citometria de fluxo para marcadores de superfície CD47hi/CD26low15 ou CPM18 (Figura 2c). Grosseiramente, os esferoides LPC devem ser redondos e transparentes (Figura 2c).
    NOTA: Não proceda com a diferenciação organoide pulmonar se a eficiência do NKX2-1 estiver abaixo de 30%.

Indução organoide pulmonar 4.3D (Dia 16 - 22)

  1. No dia 17, descongele a matriz de membrana GFR-porão no gelo. Aspire o meio de indução LPC. Em seguida, adicione 2 μg/mL de dispase (1 mL) ao poço e resuspenque a mistura média/dispase com uma pipeta P1000. Incubar a 37 °C por 15 min. Triturar a mistura novamente e incubar a 37 °C por mais 15 min.
  2. Transfira o dispase e as células para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL. Use PBS refrigerado (2-3 mL) para lavar o poço e resuspensar a mistura dispase/célula. Centrífuga por 5 min a 400 x g. Remova manualmente o supernatante, tomando cuidado para não distub a camada de pelota média/célula. Repita a lavagem pbs gelada e centrífugue o tubo de centrífuga cônica por mais 5 min a 400 x g.
  3. Remova manualmente o supernante e, em seguida, adicione 2 mL de solução de dissociação baseada em trippsina ao tubo de centrífuga cônica. Incubar a 37 °C por 12 min.
  4. Após a incubação, resuspend células com uma ponta de pipeta P1000. Em seguida, adicione um volume igual de mídia saciante ao tubo de centrífuga cônica e gire para baixo a 400 x g por 5 min. Aspire as células supernascidas e resuspend em meio de saciamento + 10 μM de Inibidor de ROCHA Y-27632.
    NOTA: A indução de organoide pulmonar bem-sucedida ocorre quando as células são incorporadas como agregados, não células únicas, ajustam a pipetação de acordo.
  5. Faça uma contagem de células. Calcule o volume necessário para obter 5,0-8,0 x 104 células por poço. Alíquota a célula LPC agrega em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL e centrífuga por 5 min a 400 x g. Remova o excesso de supernanato, tomando cuidado para não agitar a pelota celular. Deixe apenas 10 μL de mídia residual.
  6. Suspenda a pelota celular em 200 μL de meio de matriz de membrana gfr-porão frio e adicione às pastilhas de membrana de cultura celular (6,5 mm de diâmetro, poros de 0,4 μm, membrana de poliéster). Incubar a placa a 37 °C por 30-60 min para permitir que a matriz de membrana GFR-porão seja polimerizar.
  7. Adicionar 1 mL de meio de indução organoide 3D (Tabela 1) complementado com fator de crescimento do fibroblasto-7 (FGF7) (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), inibidor GSK3β/Ativador Wnt CHIR (3 μM), fator de crescimento epidérmico (EGF) (10 ng/mL) e 10 μM de Inibidor de ROCHA Y-27632 para a câmara basolateral da pastilha da membrana. Troque o meio dia não por 6 dias.

Ramificação organoide pulmonar 5.3D (Dia 23 - 28)

  1. No dia 23, mude para meio de ramificação 3D (Tabela 1) complementado com FGF7 (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), inibidor GSK3β/Ativador Wnt CHIR99021 (3 μM), RA (0,1 μM), EGF (10 ng/mL) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) / fator de crescimento placentário (PlGF) (10 ng/mL). Troque o meio dia não por 6 dias.
    NOTA: No dia 6 de diferenciação de ramificações 3D, deve haver organoides de ramificação múltiplos (Figura 2).

Maturação organoide .3D pulmão 6.3D (Dia 29 - 34)

  1. No dia 29, mudar para meio de maturação 3D (Tabela 1), que é o mesmo que meio de ramificação 3D, mas com a adição de dexametasona (50 nM), cAMP (100 μM) e 3-isobutil-1-metilxanthine (IBMX), um inibidor de fosfodiester também chamado isobutylxanthine (100 M). Troque o meio dia não por 6 dias.
    NOTA: Dentro de 24 horas após o amadurecimento 3D, os organoides ramificados devem expandir e se transformar em esferas transparentes.

Imunocitoquímica organoide pulmonar 7.3D

  1. Para análise organoide pulmonar inteira 3D, fixar o meio de matriz de membrana GFR-porão nas pastilhas de membrana com 4% de paraformaldeído (PFA) por 1h a 4 °C. Incorporar em cera de parafina e montar em slides por protocolos publicados padrão.
  2. Realize a recuperação de antígenos antes da coloração. Os marcadores das vias aéreas incluem KRT5, MUC5AC e SCGB3A2. Os marcadores alveolares incluem SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 e HOPX (Figura 3).

8. Remoção de organoides pulmonares inteiros do meio de matriz de membrana GFR-porão para passagem, FACS ou criopreservação

  1. Para dissociar os organoides do meio de matriz de membrana GFR-porão, remova a mídia da câmara basal e adicione 2 μg/mL de dispase (1 mL) na câmara apical.
  2. Triturar suavemente a mistura média/dispase com uma pipeta P1000 e coloque na incubadora por 15 minutos. Triturar suavemente a mistura novamente e incubar por mais 15 minutos.
  3. Adicione 1 mL de PBS refrigerado (4 °C) e transfira organoides com o meio de matriz em um tubo de centrífuga cônica de 15 mL. Gire a 400 x g por 5 min. Remova o supernatante cuidadosamente, para não perturbar a pelota celular.
  4. Lave mais uma vez com PBS refrigerado de 1 mL e gire a 400 x g por 5 min. Remova o supernatante cuidadosamente, para não perturbar a mistura média/celular.
  5. Adicione 1 mL de solução de descolamento celular ao tubo cônico centrífuga, levemente triturado resuspend a mistura de membrana GFR-Porão média/célula. Coloque na incubadora por 12 minutos para células passantes como agregados ou para criopreservação), ou 20 min para suspensão de célula única.
  6. Adicione o volume igual de mídia saciante e gire para baixo em 400 x g por 5 min. Resuspend em meio de saciamento + 10 μM de Inibidor de ROCHA Y-27632.
    NOTA: Nesta etapa, nenhum meio de membrana residual do porão deve ser visto no tubo. Se o meio residual permanecer, repita as etapas 8.5 e 8.6.
  7. Faça uma contagem de células. Calcule o volume necessário para aplicações a jusante.

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Resultados

24 horas após o revestimento, dia 1, os iPSCs devem ser 50%-90% confluentes. No dia 2, o DE deve ser 90%-95% confluente. Durante a indução de DE, é comum observar morte celular significativa no dia 4, mas as células anexadas manterão uma morfologia compacta de paralelepípedo (Figura 2b). Descontinua a diferenciação se a maioria das células aderentes se desprender e considerar reduzir a exposição à mídia DE com ativação A por 6-12 h. Durante a indução da AFE, a morte celular...

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Discussão

A diferenciação bem sucedida de organoides pulmonares inteiros 3D (WLO) conta com um protocolo de várias etapas e seis semanas com atenção aos detalhes, incluindo tempo de exposição a fatores de crescimento e pequenas moléculas, densidade celular após a passagem e a qualidade dos hiPSCs. Para solucionar problemas, consulte tabela 2. hiPSCs devem ser aproximadamente 70%-80% confluentes, com menos de 5% de diferenciação espontânea antes da dissociação. Este protocolo exige o meio "mTeSR plus"...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture
12 well platesCorning3512
12-well inserts, 0.4um, translucentVWR10769-208
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
AccutaseInnovative Cell TechAT104
ascorbic acidSigmaA4544
B27 without retinoic acidThermoFisher12587010
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solutionGibco15260-037
DispaseStemCellTech7913
DMEM/F12Gibco10565042
FBSGibco10082139
GlutamaxLife Technologies35050061
Ham’s F12Invitrogen11765-054
HEPESGibco15630-080
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + GlutamaxInvitrogen31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828028
MatrigelCorning354230
MonothioglycerolSigmaM6145
mTeSR plus Kit (10/case)Stem Cell Tech5825
N2ThermoFisher17502048
NEAALife Technologies11140050
Pen/strepLonza17-602F
ReleSRStem Cell Tech5872
RPMI1640 + GlutamaxLife Technologies12633012
TrypLEGibco12605-028
Y-27632 (Rock Inhibitor)R&D Systems1254/1
Growth Factors/Small Molecules
Activin AR&D Systems338-AC
All-trans retinoic acid (RA)Sigma-AldrichR2625
BMP4R&D Systems314-BP/CF
Br-cAMPSigma-AldrichB5386
CHIR99021Abcamab120890
DexamethasoneSigma-AldrichD4902
DorsomorphinR&D Systems3093
EGFR&D Systems236-EG
FGF10R&D Systems345-FG/CF
FGF7R&D Systems251-KG/CF
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)Sigma-AldrichI5879
SB431542R&D Systems1614
VEGF/PIGFR&D Systems297-VP/CF
Primary antibodiesDilution rate
CXCR4-PER&D SystemsFAB170P1:200 (F)
HOPXSanta Cruz Biotechsc-3987030.180555556
HTII-280Terrace BiotechTB-27AHT2-2800.145833333
KRT5Abcamab526350.180555556
NKX2-1Abcamab760130.25
NKX2-1-APCLS-BIOLS-C2644371:1000 (F)
proSPCAbcamab408710.215277778
SCGB3A2Abcamab1818530.25
SOX2InvitrogenMA1-0140.180555556
SOX9R&D SystemsAF30750.180555556
SPB (mature)7 Hills486041: 1500 (F) 1:500 (W)a
SPC (mature)LS BioLS-B91611:100 (F); 1:500 (W) a

Referências

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