Generazione di organoidi polmonari interi 3D da cellule staminali pluripotenti indotte per la modellazione della biologia e della malattia dello sviluppo polmonare

Riepilogo

L'articolo descrive la differenziazione diretta graduale delle cellule staminali pluripotenti indotte in organoidi polmonari interi tridimensionali contenenti cellule polmonari epiteliali sia prossimali che distali insieme a mesenchima.

Abstract

Lo sviluppo e la malattia polmonare umana sono stati difficili da studiare a causa della mancanza di sistemi modello in vitro biologicamente rilevanti. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) possono essere differenziate gradualmente in organoidi polmonari multicellulari 3D, costituiti da popolazioni di cellule epiteliali e mesenchimali. Ricapitoliamo i segnali di sviluppo embrionale introducendo temporalmente una varietà di fattori di crescita e piccole molecole per generare in modo efficiente l'endoderma definitivo, l'endoderma dell'intestino anteriore e successivamente le cellule progenitrici polmonari. Queste cellule vengono quindi incorporate nel mezzo della matrice della membrana basale a fattore di crescita ridotto (GFR), consentendo loro di svilupparsi spontaneamente in organoidi polmonari 3D in risposta a fattori di crescita esterni. Questi organoidi polmonari interi (WLO) subiscono fasi iniziali di sviluppo polmonare tra cui morfogenesi ramificata e maturazione dopo l'esposizione a desametasone, AMP ciclico e isobutilxantina. I WLO possiedono cellule epiteliali delle vie aeree che esprimono i marcatori KRT5 (basale), SCGB3A2 (club) e MUC5AC (calice) e cellule epiteliali alveolari che esprimono HOPX (tipo alveolare I) e SP-C (tipo alveolare II). Sono presenti anche cellule mesenchimali, tra cui l'actina della muscolatura liscia (SMA) e il recettore A del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα). I WLO derivati da iPSC possono essere mantenuti in condizioni di coltura 3D per molti mesi e possono essere ordinati per i marcatori di superficie per purificare una specifica popolazione cellulare. I LLO derivati da iPSC possono anche essere utilizzati per studiare lo sviluppo polmonare umano, compresa la segnalazione tra l'epitelio polmonare e il mesenchima, per modellare mutazioni genetiche sulla funzione e lo sviluppo delle cellule polmonari umane e per determinare la citotossicità degli agenti infettivi.

Introduzione

Il polmone è un organo complicato, eterogeneo e dinamico che si sviluppa in sei fasi distinte: maturazione embrionale, pseudoghiandolare, canalicolare, sacculare, alveolare e ^{microvascolare1,2}. Le ultime due fasi si verificano prima e dopo la nascita nello sviluppo umano, mentre le prime quattro fasi si verificano esclusivamente durante lo sviluppo fetale, a meno che non si verifichi la nascita pretermine3. La fase embrionale inizia nello strato germinale endodermico e si conclude con il germogliamento della trachea e delle gemme polmonari. Lo sviluppo polmonare avviene in parte attraverso la segnalazione tra le cellule epiteliali e mesenchimali4. Queste interazioni provocano la ramificazione polmonare, la proliferazione, la determinazione del destino cellulare e la differenziazione cellulare del polmone in via di sviluppo. Il polmone è diviso in zone conduttrici (trachea ai bronchioli terminali) e zone respiratorie (bronchioli respiratori agli alveoli). Ogni zona contiene tipi di cellule epiteliali uniche; comprese le cellule basali, secretorie, ciliate, a pennello, neuroendocrine e ionocitarie nelle vie aeree conduttrici5, seguite da cellule alveolari di tipo I e II nell'epitelio ^{respiratorio6}. Molto è ancora sconosciuto sullo sviluppo e la risposta alle lesioni dei vari tipi di cellule. I modelli di organoidi polmonari derivati da iPSC consentono lo studio dei meccanismi che guidano lo sviluppo del polmone umano, gli effetti delle mutazioni genetiche sulla funzione polmonare e la risposta sia dell'epitelio che del mesenchima agli agenti infettivi senza la necessità di tessuto polmonare umano primario.

I marcatori corrispondenti ai vari stadi della differenziazione embrionale includono CXCR4, cKit, FOXA2 e SOX17 per l'endoderma definitivo (DE)⁷, FOXA2, TBX1 e SOX2 per l'endoderma anteriore dell'intestino anteriore (AFE)⁸ e NKX2-1 per le prime cellule progenitrici ^polmonari9. Nello sviluppo polmonare embrionale, l'intestino anteriore si divide nell'esofago dorsale e nella trachea ventrale. Le gemme dei polmoni destro e sinistro appaiono come due outpouching indipendenti attorno al germoglio ^tracheale10. Durante la morfogenesi ramificata, il mesenchima che circonda l'epitelio produce tessuto elastico, muscolatura liscia, cartilagine e ^{vascolarizzazione11}. L'interazione tra l'epitelio e il mesenchima è essenziale per il normale sviluppo polmonare. Ciò include la secrezione di ^FGF1012 da parte del mesenchima e ^SHH13 prodotto dall'epitelio.

Qui, descriviamo un protocollo per la differenziazione diretta delle hiPSC in organoidi polmonari interi tridimensionali (3D) (WLO). Mentre ci sono approcci simili che incorporano l'isolamento delle cellule progenitrici polmonari tramite smistamento allo stadio LPC per produrre organoidi alveolari14,15 (distali) o organoidi delle vie ^aeree16 (prossimali), o generare sferoidi ventrali-anteriori del foregut per produrre organoidi polmonari umani che esprimono marcatori alveolari e mesenchimali e organoidi progenitori della punta delle ^gemme17 , il punto di forza di questo metodo è l'inclusione di entrambi i tipi di cellule epiteliali e mesenchimali polmonari per modellare e orchestrare la morfogenesi, la maturazione e l'espansione della ramificazione polmonare in vitro.

Questo protocollo utilizza piccole molecole e fattori di crescita per dirigere la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti attraverso l'endoderma definitivo, l'endoderma dell'intestino anteriore e le cellule progenitrici polmonari. Queste cellule vengono quindi indotte in organoidi polmonari interi 3D attraverso importanti fasi di sviluppo, tra cui la ramificazione e la maturazione. Il riassunto del protocollo di differenziazione è mostrato nella Figura 1a con immagini rappresentative in campo luminoso della differenziazione endodermica e organoide mostrata nella Figura 1b. La Figura 1c,d mostra i dettagli dell'espressione genica della differenziazione endodermica e l'espressione genica di entrambe le popolazioni prossimali e distali delle cellule epiteliali polmonari dopo aver completato la differenziazione.

Protocollo

Questo protocollo di studio è stato approvato dall'Institutional Review Board del programma di protezione della ricerca umana dell'UCSD (181180).

1. Induzione definitiva dell'endoderma da cellule staminali pluripotenti indotte (Giorno 1 - 3)

1. Scongelare lentamente il fattore di crescita ridotto (GFR) -membrana basale (BM) mezzo di matrice su ghiaccio 30 minuti prima dell'uso. In miscela DMEM/F12 a freddo, diluire il mezzo della matrice GFR BM 1:1 in modo tale che costituisca il 50% di questo mezzo. Posizionare le punte della pipetta P1000 nel congelatore per raffreddare prima dell'uso.
2. Rivestire ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti con 500 μL di mezzo matrice a membrana basale GFR al 50% preparato in DMEM/F12 ghiacciato. Una volta rivestito il numero desiderato di pozzetti, rimuovere qualsiasi miscela media in eccesso e/o bolle dai pozzetti e posizionare la piastra su ghiaccio o frigorifero a 4 °C per 20 minuti per fissare. Quindi, spostare la piastra nell'incubatore a 37 °C durante la notte per gelificare e asciugare.
3. Una volta che le hiPSC raggiungono il 70-90% di confluenza, aggiungere 10 μM di inibitore della chinasi associata a Rho (ROCK) Y-27632 un'ora prima della dissociazione. Aspirare il fluido e lavare una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Dissociare gli hiPSC aggiungendo un mezzo di distacco cellulare (0,5 ml / pozzetto di una piastra a 12 pozzetti) e incubare per 20 minuti a 37 °C in un incubatore a _CO2 al 5%.
4. Rimuovere le piastre dall'incubatore e aggiungere 0,5 ml/12 pozzetti di mezzo di passaggio delle cellule staminali (Tabella 1) ai pozzetti; triturare delicatamente le cellule utilizzando una punta P1000 per ottenere una sospensione a singola cellula. Trasferire cellule dissociate in un tubo centrifugo conico da 15 ml; centrifuga per 5 min a 300 x g.
5. Aspirare il mezzo e risospesciare il pellet cellulare con 1 mL di mTeSR Plus media integrato con 10 μM di inibitore ROCK (Y-27632). Eseguire un conteggio delle celle. Aggiungere 2,0 x ¹⁰⁵ hiPSC in 1 mL di mTeSR integrato con l'inibitore ROCK Y-27632 per pozzetto di una piastra a membrana basale GFR a 12 pozzetti. Incubare a 37 °C durante la notte.
   NOTA: il numero di seeding delle celle deve essere ottimizzato per ogni riga di cella. 24 ore dopo la placcatura, i pozzetti dovrebbero essere confluenti al 50% -70%.
6. Il giorno 1, aspirare il mTeSR Plus e aggiungere il mezzo di induzione Definitive Endoderm (DE) (Tabella 1) integrato con 100 ng/mL di activina A umana e 5 μM di inibitore GSK3β/attivatore Wnt CHIR99021.
   NOTA: I media DE con inibitore GSK3β/attivatore Wnt CHIR99021 devono essere rimossi entro 20-24 ore dall'induzione de del giorno 1 per una differenziazione di successo.
7. Il giorno 2 e il giorno 3, il passaggio al supporto di induzione DE integrato con 100 ng / mL di activina A solo.
   NOTA: la differenziazione de non deve superare un totale di 72 ore, o l'efficacia diminuirà. Il giorno 4, se si osserva una moria di grandi cellule, ridurre il tempo totale di esposizione ai media DE di 6-12 ore.
8. Per analizzare l'efficienza de, confermare un'espressione superiore al 90% di CXCR4 e/o cKit tramite citometria a flusso o analisi di immunofluorescenza di FOXA2 e/o SOX17 (Figura 2a).

2. Induzione dell'endoderma anteriore dell'intestino anteriore (AFE) (Giorno 4 - 6)

1. Il giorno 4, cambiare il mezzo in mezzo basale privo di siero (SFBM) (Tabella 1) integrato con 10 μM SB431542 e 2 μM dorsomorfina per l'induzione afE. Cambia i supporti AFE ogni giorno per 3 giorni (giorno 4, giorno 5 e giorno 6).
2. Per analizzare l'efficienza AFE, confermare la robusta espressione di SOX2, TBX1 e FOXA2 tramite colorazione a immunofluorescenza (Figura 2b).

3. Differenziazione delle cellule progenitrici polmonari (LPC) (Giorno 7 - 16)

1. Il giorno 7, scongelare il mezzo della matrice della membrana GFR-basale sul ghiaccio. Aspirare il supporto AFE e lavare bene con 1x PBS. Aggiungere 1 mL di soluzione di distacco cellulare e incubare per 10 minuti a 37 °C.
2. Aggiungere 1 mL di mezzo di tempra (2% FBS in DMEM/F12) ai pozzetti contenenti la soluzione di distacco cellulare. Mantenere le cellule come aggregati pipettando su e giù delicatamente. Assicurarsi che tutte le cellule siano spostate e trasferite in un tubo centrifugo conico da 15 ml. Centrifuga per 5 min a 300 x g.
3. Rimuovere il surnatante e risospese il pellet cellulare in mezzo di tempra integrato con 10 ng/mL di proteina morfogenica ossea ricombinante umana-4 (BMP4), 0,1 μM di acido retinoico all-trans (RA), 3 μM di inibitore GSK3β/attivatore Wnt CHIR99021 e 10 μM di rock inibitore Y-27632.
4. Eseguire un conteggio delle celle. Aggiungere 2,5 x ¹⁰⁵ celle a 100 μL di mezzo a matrice di membrana fredda GFR-basement, mescolare bene e posizionare la goccia in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Incubare la piastra a 37 °C per 30-60 min per permettere al mezzo di polimerizzare. Aggiungere 1 mL di supporto LPC integrato con 10 μM di inibitore ROCK Y-27632 per pozzetto assicurando che la goccia media sia completamente sommersa e incubata a 37 °C durante la notte.
5. Il giorno 8, 24 ore dopo l'induzione di LPC, cambiare il mezzo LPC per rimuovere l'inibitore ROCK Y-27632. Cambia il mezzo LPC a giorni alterni per un totale di 9-11 giorni.
   NOTA: Se il mezzo diventa giallo entro 24 ore, cambiare mezzo ogni giorno.
6. Per analizzare l'efficienza LPC, confermare una robusta espressione del fattore di trascrizione intracellulare NKX2-1 o eseguire la citometria a flusso per i marcatori di superficie ^CD47hi/CD26low15 o ^CPM18 (Figura 2c). Grossolanamente, gli sferoidi LPC dovrebbero essere rotondi e trasparenti (Figura 2c).
   NOTA: Non procedere con la differenziazione degli organoidi polmonari se l'efficienza di NKX2-1 è inferiore al 30%.

4.3D induzione di organoidi polmonari (Giorno 16 - 22)

1. Il giorno 17, scongelare il mezzo della matrice della membrana GFR-basale sul ghiaccio. Aspirare il mezzo di induzione LPC. Aggiungere quindi 2 μg/mL di dispasi (1 mL) al pozzo e risospescere la miscela media/dispase con una pipetta P1000. Incubare a 37 °C per 15 min. Triturare nuovamente la miscela e incubare a 37 °C per altri 15 minuti.
2. Trasferire la dispacciatura e le celle in un tubo centrifugo conico da 15 ml. Utilizzare PBS refrigerato (2-3 ml) per lavare il pozzetto e risospesso la miscela dispase/cell. Centrifuga per 5 min a 400 x g. Rimuovere manualmente il surnatante, facendo attenzione a non distubare lo strato di pellet medio/cellulare. Ripetere il lavaggio PBS refrigerato e centrifugare il tubo della centrifuga conica per altri 5 minuti a 400 x g.
3. Rimuovere manualmente il surnatante e quindi aggiungere 2 ml di soluzione di dissociazione a base di tripsina al tubo conico della centrifuga. Incubare a 37 °C per 12 min.
4. Dopo l'incubazione, risospese le cellule con una punta della pipetta P1000. Quindi aggiungere un volume uguale di mezzi di tempra al tubo conico della centrifuga e girare verso il basso a 400 x g per 5 minuti. Aspirare le cellule surnatante e risospese in mezzo di tempra + 10 μM di inibitore ROCK Y-27632.
   NOTA: l'induzione di organoidi polmonari di successo si verifica quando le cellule sono incorporate come aggregati, non singole cellule, regolare il pipettaggio di conseguenza.
5. Eseguire un conteggio delle celle. Calcola il volume necessario per ottenere 5,0-8,0 x ¹⁰⁴ celle per pozzetto. Aliquotare gli aggregati di cellule LPC in tubi microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare per 5 minuti a 400 x g. Rimuovere il surnatante in eccesso, facendo attenzione a non agitare il pellet cellulare. Lasciare solo 10 μL di mezzo residuo.
6. Sospendere nuovamente il pellet cellulare in 200 μL di mezzo a matrice di membrana fredda GFR-basamento e aggiungere agli inserti della membrana di coltura cellulare (diametro 6,5 mm, poro 0,4 μm, membrana in poliestere). Incubare la piastra a 37 °C per 30-60 minuti per consentire la polimerizzazione del mezzo a matrice di membrana GFR-basement.
7. Aggiungere 1 mL di mezzo di induzione organoide 3D (Tabella 1) integrato con fattore di crescita dei fibroblasti-7 (FGF7) (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), inibitore GSK3β/attivatore Wnt CHIR (3 μM), fattore di crescita epidermico (EGF) (10 ng/mL) e 10 μM di inibitore ROCK Y-27632 alla camera basolaterale dell'inserto di membrana. Cambia il mezzo a giorni alterni per 6 giorni.

5.3D Ramificazione organoide polmonare (Giorno 23 - 28)

1. Il giorno 23 passa al mezzo ramificato 3D (Tabella 1) integrato con FGF7 (10 ng / mL), FGF10 (10 ng / mL), inibitore GSK3β / attivatore Wnt CHIR99021 (3 μM), RA (0,1 μM), EGF (10 ng / mL) e fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) / fattore di crescita placentare (PlGF) (10 ng / mL). Cambia il mezzo a giorni alterni per 6 giorni.
   NOTA: Al giorno 6 della differenziazione ramificata 3D, dovrebbero esserci più organoidi ramificati (Figura 2).

6.3D maturazione organoide polmonare (Giorno 29 - 34)

1. Il giorno 29, passare al mezzo di maturazione 3D (Tabella 1), che è lo stesso del mezzo di ramificazione 3D ma con l'aggiunta di desametasone (50 nM), cAMP (100 μM) e 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), un inibitore della fosfodiesterasi chiamato anche isobutilxantina (100 μM). Cambia il mezzo a giorni alterni per 6 giorni.
   NOTA: Entro 24 ore dalla maturazione 3D, gli organoidi ramificati dovrebbero espandersi e trasformarsi in sfere trasparenti.

7.3D Immunocitochimica organoide polmonare

1. Per l'analisi organoide polmonare intera 3D, fissare il mezzo della matrice della membrana basale GFR negli inserti di membrana con paraformaldeide (PFA) al 4% per 1 ora a 4 °C. Incorporare la cera di paraffina e montarla su diapositive secondo i protocolli standard pubblicati.
2. Eseguire il recupero dell'antigene prima della colorazione. I marcatori delle vie aeree includono KRT5, MUC5AC e SCGB3A2. I marcatori alveolari includono SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 e HOPX (Figura 3).

8. Rimozione di organoidi polmonari interi dal mezzo della matrice della membrana GFR-basale per il passaggio, FACS o crioconservazione

1. Per dissociare gli organoidi dal mezzo della matrice della membrana basale GFR, rimuovere i mezzi dalla camera basale e aggiungere 2 μg/mL di dispasi (1 mL) nella camera apicale.
2. Triturare delicatamente la miscela media/dispasa con una pipetta P1000 e metterla nell'incubatrice per 15 min. Triturare delicatamente la miscela di nuovo e incubare per altri 15 minuti.
3. Aggiungere 1 mL di PBS refrigerato (4 °C) e trasferire gli organoidi con il mezzo della matrice in un tubo centrifugo conico da 15 mL. Girare a 400 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante con attenzione, per non disturbare il pellet cellulare.
4. Lavare ancora una volta con 1 mL di PBS refrigerato e girare a 400 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante con attenzione, per non disturbare la miscela medio/cellulare.
5. Aggiungere 1 mL di soluzione di distacco cellulare al tubo conico della centrifuga, triturare delicatamente la miscela media/cellulare della matrice di membrana GFR-Basement. Mettere nell'incubatrice per 12 minuti per il passaggio di cellule come aggregati o per la crioconservazione) o 20 minuti per la sospensione a singola cellula.
6. Aggiungere lo stesso volume di mezzi di tempra e girare verso il basso a 400 x g per 5 minuti. Risospeso in mezzo di tempra + 10 μM di ROCK Inibitore Y-27632.
   NOTA: In questa fase, nel tubo non si deve vedere alcun mezzo residuo della membrana basale. Se il mezzo residuo rimane, ripetere i passaggi 8.5 e 8.6.
7. Eseguire un conteggio delle celle. Calcolare il volume necessario per le applicazioni a valle.

Risultati

24 ore dopo la placcatura, giorno 1, le iPSC dovrebbero essere confluenti al 50% -90%. Il giorno 2, DE dovrebbe essere confluente al 90% -95%. Durante l'induzione de, è comune osservare una significativa morte cellulare il giorno 4, ma le cellule attaccate manterranno una morfologia compatta di ciottoli (Figura 2b). Interrompere la differenziazione se la maggior parte delle cellule aderenti si stacca e considera di abbreviare l'esposizione ai mezzi DE con activina A di 6-12 ore. Durante l'i...

Discussione

Il successo della differenziazione degli organoidi polmonari interi 3D (WLO) si basa su un protocollo multi-step di 6 settimane con attenzione ai dettagli, incluso il tempo di esposizione a fattori di crescita e piccole molecole, la densità cellulare dopo il passaggio e la qualità delle hiPSC. Per la risoluzione dei problemi, vedere la Tabella 2. Le hiPSC dovrebbero essere confluenti per circa il 70%-80%, con meno del 5% di differenziazione spontanea prima della dissociazione. Questo protocollo richied...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture
12 well plates	Corning	3512
12-well inserts, 0.4um, translucent	VWR	10769-208
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Accutase	Innovative Cell Tech	AT104
ascorbic acid	Sigma	A4544
B27 without retinoic acid	ThermoFisher	12587010
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution	Gibco	15260-037
Dispase	StemCellTech	7913
DMEM/F12	Gibco	10565042
FBS	Gibco	10082139
Glutamax	Life Technologies	35050061
Ham’s F12	Invitrogen	11765-054
HEPES	Gibco	15630-080
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax	Invitrogen	31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828028
Matrigel	Corning	354230
Monothioglycerol	Sigma	M6145
mTeSR plus Kit (10/case)	Stem Cell Tech	5825
N2	ThermoFisher	17502048
NEAA	Life Technologies	11140050
Pen/strep	Lonza	17-602F
ReleSR	Stem Cell Tech	5872
RPMI1640 + Glutamax	Life Technologies	12633012
TrypLE	Gibco	12605-028
Y-27632 (Rock Inhibitor)	R&D Systems	1254/1
Growth Factors/Small Molecules
Activin A	R&D Systems	338-AC
All-trans retinoic acid (RA)	Sigma-Aldrich	R2625
BMP4	R&D Systems	314-BP/CF
Br-cAMP	Sigma-Aldrich	B5386
CHIR99021	Abcam	ab120890
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dorsomorphin	R&D Systems	3093
EGF	R&D Systems	236-EG
FGF10	R&D Systems	345-FG/CF
FGF7	R&D Systems	251-KG/CF
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)	Sigma-Aldrich	I5879
SB431542	R&D Systems	1614
VEGF/PIGF	R&D Systems	297-VP/CF
Primary antibodies			Dilution rate
CXCR4-PE	R&D Systems	FAB170P	1:200 (F)
HOPX	Santa Cruz Biotech	sc-398703	0.180555556
HTII-280	Terrace Biotech	TB-27AHT2-280	0.145833333
KRT5	Abcam	ab52635	0.180555556
NKX2-1	Abcam	ab76013	0.25
NKX2-1-APC	LS-BIO	LS-C264437	1:1000 (F)
proSPC	Abcam	ab40871	0.215277778
SCGB3A2	Abcam	ab181853	0.25
SOX2	Invitrogen	MA1-014	0.180555556
SOX9	R&D Systems	AF3075	0.180555556
SPB (mature)	7 Hills	48604	1: 1500 (F) 1:500 (W)a
SPC (mature)	LS Bio	LS-B9161	1:100 (F); 1:500 (W) a