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요약

이 기사는 근접성 및 말단 상피 폐 세포를 메센키메와 함께 포함하는 3차원 전체 폐 오르가노이드로 유도된 다능성 줄기 세포의 단계 현명한 분화를 설명합니다.

초록

인간 폐 발달 및 질병은 생물학적으로 관련된 체외 모델 시스템의 부족으로 인해 연구하기가 어려웠습니다. 인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC)는 상피 및 중간 엽 세포 집단으로 만든 3D 다세포 폐 오르가노이드로 단계적으로 분화 될 수 있습니다. 우리는 다양한 성장 인자와 작은 분자를 효율적으로 생성하여 배아 발달 신호를 재구성하여 최종 엔도름, 전방 전방 전구 장부, 그리고 그 이후에 폐 선조 세포를 생성합니다. 이 세포는 그 때 감소된 성장 인자 감소 (GFR)-지하 막 매트릭스 매체에 내장되어, 그(것)들이 외부 성장 인자에 응하여 3D 폐 오르가노이드로 자발적으로 발전할 수 있게 합니다. 이 전체 폐 오르가노이드 (WLO)는 덱사메타손, 순환 앰프 및 이소부틸산틴에 노출 된 후 형성 형성 및 성숙을 포함한 초기 폐 발달 단계를 겪습니다. WlOs는 마커 KRT5 (기저), SCGB3A2 (클럽) 및 MUC5AC (잔)뿐만 아니라 HOPX (alveolar 타입 I) 및 SP-C (alveolar type II)를 표현하는 폐포 상피 세포를 발현하는 기도 상피 세포를 보유하고 있습니다. 중간엽 세포는 또한 평활근 액틴(SMA) 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 A(PDGFRα)를 포함하는 존재한다. iPSC 유래 WlOs는 몇 달 동안 3D 배양 조건에서 유지될 수 있으며 특정 세포 집단을 정화하기 위해 표면 마커를 위해 정렬될 수 있다. iPSC 유래 WlOs는 또한 폐 상피와 관혈 사이의 신호를 포함하여 인간의 폐 발달을 연구하고, 인간 폐 세포 기능 및 발달에 대한 유전 적 돌연변이를 모델링하고, 감염제의 세포 독성을 결정하는 데 활용될 수 있다.

서문

폐는 배아, 의사, 캐날리큘러, 충류, 및 미세 혈관 성숙1,2 - 6 개의 별개의 단계에서 발전하는 복잡하고 이질적이며 역동적 인 기관입니다. 후자의 두 단계는 조산이 발생하지 않는 한 태아 발달 중에 독점적으로 발생하는 반면, 인간 발달에서 산후적으로 발생합니다3. 배아 단계는 내피 세균 층에서 시작하여 기관및 폐 싹의 신진으로 끝납니다. 폐 발달은 상피 세포와 중간엽 세포 4 사이의 신호를 통해 부분적으로 발생합니다. 이러한 상호 작용은 폐 분지, 증식, 세포 운명 결정 및 발전 폐의 세포 분화를 초래합니다. 폐는 전도 영역(말기 기관으로의 기관) 및 호흡기 영역(폐포에 대한 호흡기 기관지)으로 나뉩니다. 각 영역은 독특한 상피 세포 유형을 포함; 기저, 분비, 모양, 브러시, 신경 내분비 및 이오노세포 세포를 실시하는 기도55, 호흡 상피에서 폐포형 I 및 II 세포가 뒤따른다. 많은 개발 및 다양 한 세포 유형의 부상에 대 한 응답에 대 한 아직 알 수 없습니다. iPSC 유래 폐 오르가노이드 모델은 인간의 폐 발달을 유도하는 메커니즘, 폐 기능에 대한 유전 적 돌연변이의 효과 및 1 차적인 인간 폐 조직에 대한 필요없이 전염성 요원에 대한 상피 및 메센키메 의 반응을 가능하게합니다.

배아 분화의 다양한 단계에 대응하는 마커는 CXCR4, cKit, FOXA2 및 SOX17을 위한 최종 엔도드름(DE)7, FOXA2, TBX1 및 SOX2를 위한 전방 전방 배구 내분방(AFE)8, 및 초기 폐선세포에 대한 NKX2-1을 포함한다. 배아 폐 발달에서, 전장은 등쪽 식도와 복부 기관으로 분할합니다. 오른쪽과 왼쪽 폐의 싹은 기관 bud10 주위에 두 개의 독립적 인 외설로 나타납니다. 형태 발생을 분기하는 동안 상피를 둘러싼 중간 근막은 탄성 조직, 부드러운 근육, 연골 및 혈관11을 생성합니다. 상피와 메센키메 사이의 상호 작용은 정상적인 폐 발달에 필수적입니다. 여기에는 FGF1012의 분비성 및 상피에 의해 생성된 SHH13이 포함됩니다.

여기서, 우리는 hiPSC의 지시된 분화에 대한 프로토콜을 3차원(3D) 전체 폐 오르가노이드(WLO)로 기술한다. LPC 단계에서 분류를 통해 폐 전구 세포의 절연을 통합하여 폐포-유사 14,15(distal) 오르가노이드 또는 기도를 만드는 유사한 접근법이 있지만, 16(근접) 오르가노이드, 또는 폐포 세포와 중간엽 마커 및 버드 팁 선조 오르가노이드를 발현하는 인간 폐 오르가노이드를 만들기 위해 복부 전방 전구 스페로이드를 생성합니다17 , 이 방법의 강도는 폐 상피 및 중간엽 세포 유형을 패턴화하여 체외에서 폐 분지, 성숙 및 확장을 조율하는 것이다.

이 프로토콜은 작은 분자와 성장 인자를 사용하여 최종 엔데름, 전방 전방 배구 내분 및 폐 선조 세포를 통해 다능성 줄기 세포의 분화를 지시합니다. 이 세포는 그 때 분기및 성숙을 포함하여 중요한 발달 단계를 통해 3D 전체 폐 오르가노이드로 유도됩니다. 분화 프로토콜의 요약은 도 1b 에 도시된 내분피 및 오르가노이드 분화의 대표적인 브라이트필드 이미지와 함께 도 1a에 도시된다. 도 1c,d 는 분화를 완료한 후 폐 상피 세포의 근위 및 탈모 집단의 유전자 발현뿐만 아니라 내피 분화의 유전자 발현 세부 사항을 보여준다.

프로토콜

이 연구 프로토콜은 UCSD의 인간 연구 보호 프로그램 (181180)의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 유도 만능 줄기 세포에서 최종 엔도드름 유도 (1 일 - 3)

  1. 천천히 해동 성장 인자 감소 (GFR)-지하 막 (BM) 매트릭스 배지 얼음에 30 분 전에 사용하기 전에. 감기 DMEM/F12에서, 혼합물은, GFR BM 매트릭스 배지를 희석시켜 이 매체의 50%를 구성한다. P1000 파이펫 팁을 냉동실에 놓아 사용하기 전에 식힙니다.
  2. 얼음 차가운 DMEM/F12로 제조된 500 μL의 500 μL의 500 μL로 12웰 플레이트의 각 웰을 코팅합니다. 원하는 수의 우물이 코팅되면, 우물에서 여분의 중간 혼합물 및 /또는 거품을 제거하고 20 분 동안 얼음이나 냉장고에 접시를 놓습니다. 그런 다음, 접시를 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이터로 이동하여 겔화하고 건조시합니다.
  3. hiPSC가 70-90%의 연결성에 도달하면 해리 전에 10 μM의 Rho 관련 키나아제(ROCK) 억제제 Y-27632를 추가합니다. 매체를 흡기하고 인산염 완충식식염(PBS)으로 한 번 씻으세요. 세포 분리 배지(0.5mL/12웰 플레이트의 우물)를 첨가하여 hiPSC를 해리하고 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 20분 동안 배양한다.
  4. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 우물에 줄기 세포 패세이징 배지(표 1)의 0.5mL/12웰을 추가합니다. P1000 팁을 사용하여 세포를 부드럽게 세분하여 단일 셀 서스펜션을 얻습니다. 15 mL 원심분리기 튜브로 해리된 세포를 전송; 원심 분리기는 300 x g에서 5 분 동안.
  5. 10 μM ROCK 억제제(Y-27632)로 보충된 mTeSR Plus 배지의 1mL로 세포 펠릿을 흡인하고 재중단한다. 셀 수를 수행합니다. 12웰 GFR 지하 막 중간 코팅 플레이트의 웰 당 ROCK 억제제 Y-27632로 보충된 mTeSR 1mL에 2.0 x 105 hiPSC를 추가합니다. 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양하십시오.
    참고: 셀 파싱 번호는 셀라인당 최적화되어야 합니다. 도금 후 24 시간, 우물은 50 %-70 % 컨할 수 있어야합니다.
  6. 1일째에는 mTeSR 플러스를 흡권하고 인간 활성제 A의 100 ng/mL과 GSK3β 억제제/Wnt 활성제 CHIR99021의 5 μM으로 보충된 최종 엔도드름(DE) 유도 매체(표 1)를 첨가한다.
    참고: GSK3β 억제제/Wnt 활성제 CHIR99021을 가진 DE 매체는 성공적인 분화를 위해 1DE 유도의 20-24 시간 이내에 제거되어야 합니다.
  7. 2일과 3일째, 100 ng/mL의 활성제 A로 보충된 DE 유도 매체로변경합니다.
    참고: DE 분화는 총 72h를 초과해서는 안되며 효능이 감소합니다. 4일째, 대형 세포 다이오프가 관찰되면 총 DE 미디어 노출 시간을 6-12h감소시.
  8. DE 효율을 분석하기 위해 FOXA2 및/또는 SOX17의 유동 세포측정 또는 면역 형광 분석을 통해 90% 이상의 CXCR4 및/또는 cKit 발현을 확인합니다(그림 2a).

2. 전방 전구 배분 (AFE) 유도 (4 일 - 6)

  1. 4일째에는 AFE 유도용 10μM SB431542 및 2μM 도르소모핀으로 보충된 무분유 기저형(SFBM)(표 1)으로 배지를 변경합니다. 매일 AFE 미디어를 3일(일4일, 5일, 6일)에 변경합니다.
  2. AFE 효율을 분석하려면 면역 형광 염색 (도 2b)을 통해 SOX2, TBX1 및 FOXA2의 강력한 발현을 확인합니다.

3. 폐 전구 세포 (LPC) 분화 (7 일 - 16)

  1. 7일째, 얼음 에 GFR 지하 막 매트릭스 배지를 해동. AFE 미디어를 흡입하고 1배 PBS로 잘 씻으세요. 세포 분리 용액 1mL을 추가하고 37 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
  2. 담금질 매체 1mL(DMEM/F12의 2% FBS)를 세포 분리 용액을 함유하는 우물에 추가합니다. 셀을 위아래로 부드럽게 배관하여 응집체로 유지합니다. 모든 세포가 15mL 원심분리기 튜브로 분리되어 전달되는지 확인하십시오. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
  3. 상체를 제거하고 인간 재조합 골 형태 호르몬-4(BMP4), 0.1 μM 의 모든 트랜스 망막산(RA), GSK3β 억제제/Wnt 활성제 CHIR99021, 및 10μM의 10μm-암분억제제로 보충된 담금질 매체에서 세포 펠릿을 재중단한다.
  4. 셀 수를 수행합니다. 2.5 x 105 셀을 차가운 GFR 지하 막 매트릭스 배지의 100 μL에 넣고 잘 섞고 물방울을 12웰 플레이트의 우물에 놓습니다. 배지가 중합할 수 있도록 37°C에서 30-60분 동안 플레이트를 배양한다. 1mL의 LPC 미디어를 추가하여 10 μM의 ROCK 억제제 Y-27632를 잘 추가하여 중간 낙하가 완전히 침수되고 하룻밤 사이에 37°C에서 배양할 수 있도록 합니다.
  5. LPC 유도 후 8, 24 시간, ROCK 억제제 Y-27632를 제거하기 위해 LPC 매체를 변경합니다. 총 9-11일 동안 LPC 배지를 격일로 변경합니다.
    참고: 매체가 24시간 이내에 노란색이 되면 매일 매체를 변경합니다.
  6. LPC 효율을 분석하기 위해 세포내 전사 인자 NKX2-1의 견고한 발현을 확인하거나 표면 마커 CD47hi/CD26low15 또는 CPM18(도 2c)에 대한 유동 세포측정을 수행한다. 심하게, LPC 스페로이드는 둥글고 투명해야한다 (그림 2c).
    참고: NKX2-1의 효율이 30% 미만인 경우 폐 오르간노이드 분화를 진행하지 마십시오.

4.3D 폐 오르간성 유도 (16일 - 22일)

  1. 17일째, 얼음 위에 GFR 지하 막 매트릭스 배지를 해동합니다. LPC 유도 매체를 흡인합니다. 그런 다음 2 μg/mL의 디스파제(1mL)를 우물에 넣고 P1000 파이펫으로 중간/디스파제 혼합물을 다시 분리한다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 혼합물을 다시 트리튜트하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
  2. 디스파제와 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기다. 차가운 PBS (2-3 mL)를 사용하여 우물을 씻고 디스파스 / 셀 혼합물을 다시 중단하십시오. 원심 분리기는 400 x g에서 5 분 동안. 수동으로 중간 /세포 펠릿 층을 분리하지 않도록주의하여 상체를 제거하십시오. 차가운 PBS 세척을 반복하고 원심 분리기 튜브를 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
  3. 상체를 수동으로 제거한 다음 원추형 원심분리기 튜브에 트립신 기반 해리 솔루션 2mL을 추가합니다. 37°C에서 12분 동안 배양합니다.
  4. 인큐베이션 후 P1000 파이펫 끝으로 셀을 다시 일시 중단합니다. 그런 다음 원물 원심 분리기 튜브에 동일한 양의 담금질 미디어를 추가하고 5 분 동안 400 x g 로 회전합니다. 슈퍼칸트와 암석 억제제 Y-27632의 담금질 배지 + 10 μM에서 세포를 재흡입한다.
    참고: 성공적인 폐 오르가노이드 유도는 세포가 단일 세포가 아닌 응집체로 내장될 때 발생하며, 그에 따라 파이펫팅을 조정합니다.
  5. 셀 수를 수행합니다. 우물당 5.0-8.0 x 104 셀을 얻는 데 필요한 부피를 계산합니다. AliquotLPC 세포는 400 x g에서 5 분 동안 1.5 mL 미세 원심 분리기 튜브및 원심 분리기로 집계 됩니다. 세포 펠릿을 동요하지 않도록 주의하면서 과도한 상신제제거합니다. 잔류 용지의 10 μL만 둡니다.
  6. 감기 GFR-지하 막 매트릭스 배지의 200 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 세포 배양 막 인서츠(직경 6.5mm, 0.4 μm 모공, 폴리에스테르 멤브레인)에 첨가한다. GFR-지하 멤브레인 매트릭스 배지가 중합할 수 있도록 37°C에서 30-60분 동안 플레이트를 배양한다.
  7. 섬유아세포 성장 인자-7(FGF7) 7(10 ng/mL), FGF10(10 ng/mL), GSK3β 억제제/Wn으로 보충된 3D 오르간성 유도 매체(표 1)의 1mL추가 CHIR(3 μM), 표피 성장 인자(EGF) (10 ng/mL), 및 멤브레인 삽입의 바칼탈 챔버에 대한 ROCK 억제제 Y-27632의 10 μM. 6일 동안 격일로 배지를 변경합니다.

5.3D 폐 오르가노이드 분기 (23 일 - 28 일)

  1. FGF7(10 ng/mL), FGF10(10 ng/mL), GSK3β 억제제/Wnt 액티비티어 CHIR9902로 보충된 3D 분기 매체(표 1)로 의 변경 11 (3 μM), RA (0.1 μM), EGF (10 ng/mL), 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) / 태반 성장 인자 (PlGF) (10 ng/mL). 6일 동안 격일로 배지를 변경합니다.
    참고: 3D 분기 분화 분화의 6일째에는 여러 분기 오르가노이드가 있어야 합니다(그림 2).

6.3D 폐 오르간성 성숙 (29 일 - 34 일)

  1. 29일째에는 3D 분기 매체와 동일하지만 덱사메타손(50nM), cAMP(100 μM), 3-이소부틸-1-메틸산틴(IBMX), 인포디세라이제 억제제(IBMX) 및 3-이소부틸-1-메틸산틴(IBMX) 및 3-이소부틸-1-메틸산틴(IBMX) 및 3-이소비제세라이체 억제제(Ibutylxthin)의 첨가와 동일하여 3D 성숙 배지(표 1)로 변경한다. 6일 동안 격일로 배지를 변경합니다.
    참고: 3D 성숙 후 24시간 이내에 분기 오르가노이드가 투명 구체로 확장되고 변경되어야 합니다.

7.3D 폐 오르간성 면역 세포 화학

  1. 3D 전체 폐 오르가노이드 분석을 위해, 4°C에서 1h에 대한 4% 파라포름알데히드(PFA)로 멤브레인 삽입물에서 GFR-지하 막 매트릭스 배지를 수정한다. 파라핀 왁스에 포함되고 표준 게시된 프로토콜당 슬라이드에 장착합니다.
  2. 염색하기 전에 항원 검색을 수행합니다. 기도 마커는 KRT5, MUC5AC 및 SCGB3A2를 포함한다. 폐포 마커는 SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 및 HOPX(그림 3)를 포함한다.

8. 통로, FACS 또는 냉동 보존을 위한 GFR 지하 막 매트릭스 배지에서 전체 폐 오르가노이드 제거

  1. GFR-지하 멤브레인 매트릭스 배지에서 오르가노이드를 분리하려면 기저 챔버에서 미디어를 제거하고 apical 챔버에 2 μg/mL의 디스파스(1mL)를 추가한다.
  2. P1000 파이펫으로 중간/디스파제 혼합물을 부드럽게 세리팅하고 인큐베이터에 15분 동안 배치합니다. 혼합물을 부드럽게 세리트리트하고 15분 동안 배양합니다.
  3. 1mL의 차가운 PBS(4°C)를 추가하고 매트릭스 배지로 오가노이드를 15mL 원심분리기 튜브로 옮춥니다. 5 분 동안 400 x g 에서 회전합니다. 셀 펠릿을 방해하지 말고 상체를 조심스럽게 제거하십시오.
  4. 1mL 냉장 PBS로 한 번 더 씻고 400 x g 에서 5 분 동안 회전하십시오. 중간/세포 혼합물을 방해하지 말고 주관체를 조심스럽게 제거하십시오.
  5. 원추형 원심분리기 튜브에 1mL의 세포 분리 용액을 추가하고 GFR-지하 막 매트릭스 배지/세포 혼합물을 부드럽게 세자리로 처리합니다. 인큐베이터에 12분 동안 세포를 응집체 또는 냉동 보존용으로 배치하거나 단일 세포 현탁액에 대해 20분 간 배치하십시오.
  6. 담금질 매체의 동일한 볼륨을 추가하고 5 분 동안 400 x g 에서 아래로 회전합니다. 담금질 매체 + 10 μM의 ROCK 억제제 Y-27632에서 재연한다.
    참고: 이 단계에서는 남은 지하 막 배지가 튜브에서 볼 수 없습니다. 잔여 매체가 남아 있으면 8.5 및 8.6 단계를 반복하십시오.
  7. 셀 수를 수행합니다. 다운스트림 응용 프로그램에 필요한 볼륨을 계산합니다.

결과

도금 후 24시간, 1일째, iPSC는 50%-90%의 컨할 수 있어야 합니다. 2일째에 DE는 90%-95%로 응모해야 합니다. DE 유도 하는 동안, 그것은 일반적인 세포 죽음을 관찰 하는 4 4 하지만 부착 된 세포는 소형 조약 돌 형태를 유지 합니다 (도 2b). 대부분의 부착 세포가 분리되고 활성 A를 사용하여 DE 미디어에 대한 노출을 6-12 h로 단축하는 것을 고려하는 경우 분화를 중단합니다. AFE 유도 하?...

토론

3D 전체 폐 오르가노이드 (WLO)의 성공적인 분화는 성장 인자와 소분자에 노출되는 시간, 패세후 세포 밀도 및 hiPSC의 품질을 포함하여 세부 사항에주의를 기울여 다단계 6 주 프로토콜에 의존합니다. 문제 해결의 경우 표 2를 참조하십시오. hiPSC는 약 70%-80%의 컨할 수 있어야 하며, 해리 전에 5% 미만의 자발적인 분화를 해야 합니다. 이 프로토콜은 "mTeSR 플러스"매체를 요구합니다. 그러나,...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 재생 의학에 대 한 캘리포니아 연구소에 의해 지원 되었다 (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture
12 well platesCorning3512
12-well inserts, 0.4um, translucentVWR10769-208
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
AccutaseInnovative Cell TechAT104
ascorbic acidSigmaA4544
B27 without retinoic acidThermoFisher12587010
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solutionGibco15260-037
DispaseStemCellTech7913
DMEM/F12Gibco10565042
FBSGibco10082139
GlutamaxLife Technologies35050061
Ham’s F12Invitrogen11765-054
HEPESGibco15630-080
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + GlutamaxInvitrogen31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828028
MatrigelCorning354230
MonothioglycerolSigmaM6145
mTeSR plus Kit (10/case)Stem Cell Tech5825
N2ThermoFisher17502048
NEAALife Technologies11140050
Pen/strepLonza17-602F
ReleSRStem Cell Tech5872
RPMI1640 + GlutamaxLife Technologies12633012
TrypLEGibco12605-028
Y-27632 (Rock Inhibitor)R&D Systems1254/1
Growth Factors/Small Molecules
Activin AR&D Systems338-AC
All-trans retinoic acid (RA)Sigma-AldrichR2625
BMP4R&D Systems314-BP/CF
Br-cAMPSigma-AldrichB5386
CHIR99021Abcamab120890
DexamethasoneSigma-AldrichD4902
DorsomorphinR&D Systems3093
EGFR&D Systems236-EG
FGF10R&D Systems345-FG/CF
FGF7R&D Systems251-KG/CF
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)Sigma-AldrichI5879
SB431542R&D Systems1614
VEGF/PIGFR&D Systems297-VP/CF
Primary antibodiesDilution rate
CXCR4-PER&D SystemsFAB170P1:200 (F)
HOPXSanta Cruz Biotechsc-3987030.180555556
HTII-280Terrace BiotechTB-27AHT2-2800.145833333
KRT5Abcamab526350.180555556
NKX2-1Abcamab760130.25
NKX2-1-APCLS-BIOLS-C2644371:1000 (F)
proSPCAbcamab408710.215277778
SCGB3A2Abcamab1818530.25
SOX2InvitrogenMA1-0140.180555556
SOX9R&D SystemsAF30750.180555556
SPB (mature)7 Hills486041: 1500 (F) 1:500 (W)a
SPC (mature)LS BioLS-B91611:100 (F); 1:500 (W) a

참고문헌

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